Aussicht auf Stammzellkonditioniertes Medium in der Regenerativen Medizin

Abstrakt

Hintergrund. Aus Stammzellen gewonnenes konditioniertes Medium hat eine vielversprechende Aussicht, als Arzneimittel für die regenerative Medizin hergestellt zu werden. Ziel. Es sollen verschiedene Methoden untersucht werden, um aus Stammzellen gewonnenes konditioniertes Medium (CM) zu erhalten, um einen Einblick in ihre Anwendungsperspektive bei verschiedenen Krankheiten zu erhalten. Methoden. Systematische Überprüfung unter Verwendung der Schlüsselwörter “Stammzelle” und “konditioniertes Medium” oder “Sekretom” und “Therapie”.” Daten über behandelte Zustände / Krankheiten, Art der kultivierten Zelle, Medium und Ergänzungen zur Kultivierung der Zellen, Kulturzustand, CM-Verarbeitung, Wachstumsfaktoren und andere Sekrete, die analysiert wurden, Art der Anwendung und Ergebnis wurden notiert, gruppiert, tabelliert und analysiert. Suchergebnisse. Die meisten CMD-Studien zeigten gute Ergebnisse. Die verschiedenen CM wurden jedoch, selbst wenn sie von derselben Art von Zellen abgeleitet waren, unter verschiedenen Bedingungen hergestellt, dh aus verschiedenen Durchgängen, Kulturmedien und Kulturbedingungen. Die Wachstumsfaktorausbeuten der verschiedenen Zelltypen waren in einigen Studien verfügbar, und die Zellzahl, die zur Herstellung von CM für eine Anwendung benötigt wurde, konnte berechnet werden. Schlussfolgerung. Verschiedene aus Stammzellen gewonnene konditionierte Medien wurden an verschiedenen Krankheiten getestet und zeigten meist gute Ergebnisse. Es müssen jedoch standardisierte Produktionsmethoden und Validierungen ihrer Verwendung durchgeführt werden.

1. Einleitung

Daten zur Verwendung von Stammzellen bei verschiedenen Krankheiten häufen sich. Einige Studien berichteten über vorteilhafte Wirkungen der Stammzelltherapie bei degenerativen Erkrankungen wie Myokardinfarkt und zeigten, dass Stammzellen eine Gewebereparatur verursachen, da sie trophische Faktoren absondern können, die sich positiv auf das geschädigte Gewebe auswirken, und nicht auf ihre Fähigkeit, sich in die benötigten Zellen zu differenzieren . Verschiedene Studien zu aus Stammzellen abgeleiteten sekretierten Faktoren zeigten, dass der sekretierte Faktor allein ohne die Stammzelle selbst eine Gewebereparatur unter verschiedenen Bedingungen verursachen kann, die Gewebe- / Organschäden mit sich brachten. Die sekretierten Faktoren werden als Sekretom, Mikrovesikel oder Exosom bezeichnet und können in dem Medium gefunden werden, in dem die Stammzellen kultiviert werden.

Die Verwendung von CM enthaltenden Sekretomen hat gegenüber der Verwendung von Stammzellen mehrere Vorteile, da CM leichter hergestellt, gefriergetrocknet, verpackt und transportiert werden kann. Darüber hinaus, da es frei von Zellen ist; Es besteht keine Notwendigkeit, den Spender und den Empfänger zusammenzubringen, um Abstoßungsprobleme zu vermeiden. Aus Stammzellen gewonnenes konditioniertes Medium hat daher eine vielversprechende Aussicht, als Arzneimittel für die regenerative Medizin hergestellt zu werden.

Bisher wurde keine klinische Studie mit CM für eine bestimmte Krankheit berichtet, mit Ausnahme von zwei Pilotstudien zur Verwendung von CM aus mesenchymalen Stammzellen aus Fettgewebe zur Regeneration der Haarfollikel und zur fraktionierten Wundheilung durch Kohlendioxid beim Menschen, die gute Ergebnisse zeigten. Die Verwendung von CM für die Therapie ist sehr attraktiv und könnte in naher Zukunft boomen, da sich Studien zur Verwendung von CM bei verschiedenen Krankheiten ansammeln . Konditioniertes Medium enthält verschiedene Wachstumsfaktoren und Geweberegenerationsmittel, die von den Stammzellen sezerniert wurden. Die Tatsache, dass Stammzellen verschiedene Wachstumsfaktoren absondern, wurde auch durch verschiedene proteomische Studien gezeigt, die das Vorhandensein verschiedener Wachstumsfaktoren und anderer Zytokine im CM zeigten .

Verschiedene Studien berichteten jedoch über die Verwendung verschiedener Arten von Stammzellen und verschiedener Methoden, um die Fähigkeit zu erlangen, verschiedene Arten von degenerativen Erkrankungen in verschiedenen Tiermodellen zu heilen. Daher zielte diese systematische Überprüfung darauf ab, die verschiedenen Methoden zu untersuchen, um die CM und die verschiedenen Krankheiten, die behandelt wurden, zu erhalten, um einen Einblick in die verschiedenen Arten von CM und ihren Anwendungsnutzen bei verschiedenen Krankheiten zu erhalten.

2. Materialien und Methoden

Wir haben am 23. Januar 2014 in Pubmed / Medline “All text” -Suchen ohne zeitliche Einschränkung unter Verwendung der Schlüsselwörter “Stammzelle” und “konditioniertes Medium” oder “secretome” und “Therapie”, “All Text” -Suchen in der Cochrane library (trials) unter Verwendung der Schlüsselwörter “secretome” oder “konditioniertes Medium” und “all text” – ClinicalTrials.gov stichworte “Stammzelle” und “konditioniertes Medium” oder “Sekretom” und “Therapie.” Darüber hinaus wurden relevante vorhandene Artikel in unserer Bibliothek hinzugefügt.

Einschlusskriterien sind alle Studien, die CM für eine bestimmte Krankheit verwendeten. Ausschlusskriterien sind Studien, die keine vollständigen Daten zum Zustand / Krankheitsmodell des Probanden, zur CM-Quelle und zum Ergebnis der Behandlung mit CM enthielten.

Die Datenerfassung erfolgt wie folgt: behandelte Zustände / Krankheiten, Zelltyp, der kultiviert wurde, detaillierte Zusammensetzung des Mediums und der Ergänzungen, die zum Kultivieren der Zellen verwendet wurden, Kulturzustand (Hypoxie oder Normoxie), um das CM zu erhalten, CM-Verarbeitung, Wachstumsfaktoren und andere Sekrete, die analysiert wurden; Methode (Modus) der Anwendung und Ergebnis der CM-Anwendung wurden notiert, gruppiert und tabelliert.

Die Datensynthese ist wie folgt: Die Daten wurden nach behandelten Krankheiten und Zelltypen gruppiert, die zur Herstellung des CM verwendet wurden. Um ferner die Wachstumsfaktorausbeuten der verschiedenen Zelltypen zu kennen, wurden, sofern verfügbar, Wachstumsfaktorspiegel tabelliert und nach Zelltypen gruppiert, die das wachstumsfaktorhaltige konditionierte Medium ergaben, in Bezug auf die Anzahl der Zellen, Art und Dauer der Kultur und Verarbeitung des konditionierten Mediums. Wenn die Daten verfügbar waren, wurde die Anzahl der Zellen berechnet, die zur Herstellung des CM für eine Anwendung benötigt wurden.

3. Ergebnisse und Diskussion

Wir haben 39 Artikel erhalten, die die Einschlusskriterien erfüllten, und 7 wurden aufgrund unvollständiger Daten ausgeschlossen. Verschiedene Zustände / Krankheiten wurden mit verschiedenen zellbasierten THERAPIEN behandelt und zeigten meist vielversprechende Ergebnisse (Tabelle 1).

Die verschiedenen konditionierten Medien wurden, selbst wenn sie von derselben Art von Zellen abgeleitet waren, unter verschiedenen Bedingungen hergestellt, dh unter verschiedenen Bedingungen, Anzahl der Zellen, Kulturmedium und Kulturzustand (Tabelle 2). Die Wachstumsfaktorausbeuten der verschiedenen Zelltypen sind in Tabelle 3 ersichtlich, und die Zellzahl, die zur Herstellung von CM für eine Anwendung benötigt wird, ist in Tabelle 4 ersichtlich.

Verschiedene Studien zeigten, dass konditioniertes Medium bei verschiedenen Arten von Krankheiten / Zuständen getestet wurde (Tabelle 1), dh Alopezie, akute und chronische Ischämie der Hinterbeine , akute und chronische Wundheilung, Myokardinfarkt , akute Leberverletzung / Versagen , Hirnverletzung / Ischämie / Schlaganfall , Rückenmarksverletzung , Lungenverletzung und Knochendefekt , und zeigten eine Verbesserung der Zustände. Darüber hinaus zeigte eine chronische Nierenerkrankung, die mit mesenchymalen Stammzellen aus humanen embryonalen Stammzellen (huESC-MSC) CM behandelt wurde, einen verringerten systolischen Blutdruck und Proteinurie sowie eine Verbesserung der tubulären und glomerulären Schädigung, des renalen Blutflusses und der glomerulären Filtrationsrate . Nephropathie, die mit CM aus humanen Nabelschnurblut-uneingeschränkten somatischen Stammzellen (huUCB-USSC) oder Maus-Knochenmark-Mesenchym-Stammzellen (mBM-MSC) CM behandelt wurde, zeigte jedoch keine Verbesserung des Serumharnstoff- und Kreatininspiegels, der histopathologischen Schädigung und des körperlichen Aktivitätswerts . Darüber hinaus zeigte die Krebsprävention unter Verwendung der CM der humanen mesenchymalen Stammzelllinie eine erhöhte Tumorzellproliferation und Vaskularisation .

In den beiden Fällen von Nierenerkrankungen kann der Schluss gezogen werden, dass CM von hu-ESC-MSC den Zustand verbessern kann und der erforderliche Wachstumsfaktorspiegel vermutlich ausreicht, da die CM-Verarbeitung einen 25-fachen Konzentrationsschritt umfasst . Für hu-UCB-USSC oder mBM-MSC-CM verhindern jedoch fehlende Daten zur CM-Verarbeitung und zum Wachstumsfaktorniveau des CM eine weitere Analyse, um zu schließen, ob das Versäumnis, den Zustand zu verbessern, auf das Fehlen eines bestimmten Wachstumsfaktors oder auf das Niveau zurückzuführen ist von Wachstumsfaktoren, die zu niedrig waren, um eine Wirkung zu erzielen.

3.1. Kulturmedium und Ergänzung

Einige Studien verwendeten fötales Rinderserum oder ein anderes Ergänzungsmittel, das ein vollständiges Medium enthielt, während andere Studien serumfreie Medien verwendeten. Darüber hinaus waren die verwendeten Basalmedien variabel, beispielsweise aMEM, DMEM, DMEM / F12, M199, EBM2, EGM-2, in vivo 15 oder chemisch definiertes Medium, und derselbe Zelltyp konnte in verschiedenen Basalmedien kultiviert werden (Tabelle 2). Kulturmedium in in vitro Kultur stellt Mikroumgebung im in vivo Zustand dar und kann das Zellschicksal und damit die Zellsekretion bestimmen. Daher kann der gleiche Zelltyp unterschiedliche Wachstumsfaktoren absondern, wenn sie in einem anderen Medium kultiviert wurden, wie in Tabelle 3 zu sehen ist .

3.2. Kulturdauer

Die Produktion von CM variiert in der Kulturdauer zwischen sechzehn Stunden und fünf Tagen (Tabelle 3). Falls komplettes Medium verwendet wurde, konnte kurze Kulturdauer bestimmte Serum abgeleitete Wachstumsfaktoren lassen, die nicht durch die Zellen verbraucht wurde und dem Wachstumsfaktorniveau hinzufügen konnte, oder, im Gegenteil, Wachstumsfaktorsekretion durch die Zellen unterdrücken. Die Möglichkeit des Vorhandenseins von Restwachstumsfaktor aus dem Medium kann in einer Studie gesehen werden, die zeigte, dass Medium ohne Zelle einen TGF-b1-Spiegel von pg / ml enthielt (Tabelle 3) .

3.3. Kulturbedingung

Die meisten Studien ergaben CM in Monoschichtkultur, mehrere Studien verwendeten jedoch Sphäroidkulturen (Tabelle 3). Sphäroidkulturen benötigen eine spezielle Handhabung und Ausrüstung (Spinnerkolben), liefern jedoch im Vergleich zu herkömmlichen Monoschichtkulturen mehr Zellen und damit mehr sekretierte Faktoren (Tabelle 4). Darüber hinaus können sich Zellen, die sich in der Mitte des Sphäroids befinden, im Vergleich zu Zellen auf der Oberfläche in einem relativen hypoxischen Zustand befinden, wodurch die Ausbeute an bestimmten Wachstumsfaktoren weiter erhöht wird.

3.4. Die Rolle des sekretierten Faktors bei der Verbesserung von Krankheiten

Verschiedene Zytokine wurden von Stammzellen in das CM sekretiert und spielten eine Rolle bei der Verbesserung verschiedener Krankheiten / Zustände. Diese Zytokine können in Wachstumsfaktoren, proinflammatorische und entzündungshemmende Zytokine und andere Zytokine eingeteilt werden. Verschiedene Studien verwendeten verschiedene Methoden, um verschiedene Zytokine im konditionierten CM zu bewerten, von den konventionellen ELISA-Assays bis hin zu proteomischen Profilierungsmethoden .

3.4.1. Wachstumsfaktoren

Darüber hinaus berichteten Studien, die verschiedene Wachstumsfaktoren analysierten, über das Vorhandensein der verschiedenen Wachstumsfaktoren, die von verschiedenen Stammzellen in ihr konditioniertes Medium sezerniert wurden (Tabelle 3), mit Ausnahme von humanem MSC (Lonza), das nicht FGF-2, PDGFBB, BMP-2 und SDF-1 sezernierte, sondern IGF-1, VEGF, TGF β1 und HGF sezernierte . Darüber hinaus können unterschiedliche Kulturbedingungen und -medien zu unterschiedlichen Wachstumsfaktorsekreten führen .

3.4.2. Pro- und entzündungshemmende Zytokine

3.4.3. Andere Zytokine

3.5. Übersetzung der Verwendung von konditioniertem Medium bei Patienten

In konditioniertem Medium können verschiedene Faktoren als Cocktail vorhanden sein und gemeinsam die Regeneration fördern. Daher ist es wichtig, einen vollständigen Satz von Wachstumsfaktor- und Zytokinspiegeln für jede Art von aus Stammzellen gewonnenem konditioniertem Medium zu analysieren und den Kulturzustand, die konditionierte Mediumverarbeitung und Krankheiten / Zustände zu kennen, die auf eine bestimmte konditionierte Mediumbehandlung ansprechen. Wenn der Gehalt der verschiedenen Zytokine in einem bestimmten konditionierten Medium bekannt ist, kann das Ergebnis des konditionierten Mediums auf eine bestimmte Krankheit / einen bestimmten Zustand bestimmt werden, und der Weg zur Translation in Patienten ist offen.

Aus Studien, die den VEGF-Spiegel analysierten, können wir schließen, dass die meisten Stammzellen VEGF absondern. Da VEGF eine Rolle bei der Angiogenese spielt, die für die Regeneration verletzter / geschädigter Gewebe / Organe wichtig ist, können verschiedene aus Stammzellen gewonnene konditionierte Medien verschiedene Krankheiten heilen und haben einen größeren Einfluss auf Krankheiten mit Ischämie. Darüber hinaus kann VEGF die Apoptose im hypoxischen Zustand verhindern und so weitere Schäden verhindern .

Darüber hinaus ist FGF2 im Vergleich zu VEGF ein stärkerer angiogener Faktor mit zusätzlicher Wirkung auf die Proliferation von Fibroblasten, Präadipozyten und Endothel-, Epithel- und neuralen Stammzellen, auf die Migration von aus der Neuralleiste abgeleiteten Glia- und myogenen Zellen und auf die Differenzierung von Neuroepithelzellen in reife Neuronen und Gliazellen .

Andere Wachstumsfaktoren tragen zur Regeneration verletzter / geschädigter Gewebsorgane bei, wobei der Schwerpunkt auf der Proliferation liegt, dh PDGF für Bindegewebe, Gliazellen und andere Zellen, EGF für Mesenchym-, Gliazellen- und Epithelzellen und IGF-I und IGF-II für verschiedene Arten von Zellen . Darüber hinaus erhöht PlGF, das Mitglied der VEGF-Familie ist, die Aktivität von VEGF in vitro und in vivo , KGF hemmt den durch oxidativen Stress induzierten Epithelzelltod , NGF fördert das Neuritenwachstum und das Überleben neuronaler Zellen , BDNF ist neuroprotektiv, fördert das Überleben von Zellen und reduziert die Bildung von Astroglialnarben , und einige Wachstumsfaktoren, einschließlich HEGF, FGF-7, EGF und HGF, fördern die Leberregeneration .

Proinflammatorische Zytokine, die bei der Regeneration eine Rolle spielen, sind IL-1b aufgrund seiner leberschützenden Rolle , IL-8 aufgrund seiner angiogenen Aktivität und IL-9 aufgrund seiner wundheilungsfördernden Aktivität . Darüber hinaus verhindern entzündungshemmende Zytokine Entzündungen und fördern die Leberregeneration .

Der MCSF-Rezeptor (MCSFR) fördert das Wachstum und die Entwicklung von myeloischen Vorläufern, mononukleären Phagozyten und plazentaren Trophoblasten , und PDGFR kann mit verschiedenen Signalmolekülen oder Integrin interagieren, um Zellproliferation, Motilität, Differenzierung oder Überleben durch Apoptosehemmung zu verursachen .

Darüber hinaus kann ein Faktor zu mehr als einem Modus der regenerativen Wirkung beitragen, wie MCP-1, das an der Angiogenese und der Leberschutzaktivität beteiligt ist . Darüber hinaus sind Daten aus Tierversuchen, die vielversprechende Ergebnisse zeigten, sehr wertvoll, damit die Produktion von CM bei verschiedenen menschlichen Krankheiten angewendet werden kann.

3.5.1. Herstellung von CM für die Translation in verschiedene menschliche Krankheiten

Um CM für verschiedene menschliche Krankheiten zu verwenden, muss das Herstellungsverfahren des CM in Bezug auf die Art und Anzahl der Zellen, die zur Herstellung des CM benötigt wurden, standardisiert werden, Kulturmedium und Zustand, und konditionierte Mediumverarbeitung. Darüber hinaus sind das Volumen und die Art der Lieferung wichtig. Da verschiedene Studien eine unterschiedliche Anzahl und Art von Zellen und verschiedene Dosen von CM verwendeten, ist es wichtig, die Anzahl der Zellen zu kennen, die das CM für eine Anwendung ergaben, die für Humanstudien interpoliert werden kann. Daher haben wir in Tabelle 4 alle Daten zusammengefasst, die für die Interpolation in Humanstudien erforderlich sein können, dh behandelte Krankheiten, Spezies und Alter oder Körpergewicht des Tieres, Zelltyp, Kulturmedium und -zustand, Anzahl der zu produzierenden Zellen CM für eine Anwendung, Volumen und Art der Anwendung. Darüber hinaus sind in Abbildung 1 verschiedene Anwendungsmöglichkeiten von CM für verschiedene Bedingungen zusammengefasst.

Abbildung 1

Verschiedene mögliche Anwendungen von CM für verschiedene Bedingungen.

Darüber hinaus ist es für die Translation in Patienten sehr wichtig, die verschiedenen Zytokingehalte der verschiedenen konditionierten Medien zu analysieren und zu notieren. Ferner muss für jedes konditionierte Medium mit bekanntem Zytokingehalt eine Validierung seiner Verwendung bei verschiedenen Krankheiten durchgeführt werden. Schließlich sollte die Möglichkeit der Förderung eines bestehenden Krebses für jeden CM getestet werden, und vor der CM-Therapie sollte Vorsicht walten gelassen werden, um sicherzustellen, dass der Empfänger frei von Krebs ist.

Die Vorteile der Herstellung verschiedener Arzneimittel für Patienten liegen in der Möglichkeit der Massenproduktion durch Pharmaunternehmen, wenn die Produktionsmethoden standardisiert wurden. Konditionierte Medien sind nicht wie Stammzellen, die eine gute Herstellungspraxis (GMP) benötigen, um auf Patienten angewendet zu werden . Wenn es richtig verpackt ist, kann es leicht als Arzneimittel transportiert werden und benötigt keine Kryokonservierung, wie sie die Stammzellen benötigen. Im Vergleich zu Stammzellen, die möglicherweise über einen längeren Zeitraum überleben, muss CM jedoch häufiger verabreicht werden, da die Halbwertszeiten von Zytokinen und Wachstumsfaktoren meist kürzer sind, was für die Patienten von Nachteil ist, den Pharmaunternehmen jedoch mehr Gewinn bringt.

4. Schlussfolgerung

Verschiedene aus Stammzellen gewonnene konditionierte Medien wurden durch verschiedene Methoden und Verarbeitung hergestellt und an verschiedenen Krankheiten getestet und zeigten meist gute Ergebnisse. Es müssen jedoch standardisierte Methoden für die Produktion verschiedener konditionierter Medien und Validierungen ihrer Verwendung bei verschiedenen Krankheiten durchgeführt werden.

Interessenkonflikt

Der Autor erklärt, dass kein Interessenkonflikt bezüglich der Veröffentlichung dieses Artikels besteht.

Anerkennung

Diese Studie wurde durch das Forschungsstipendium des indonesischen Ministeriums für Bildung und Kultur (Pusnas 2014), Vertrag Nr. 2218 / H2, finanziert.R12/HKW.05.00/2014.