Chloramphenicolacetyltransferase als Selektionsmarker für Chlamydientransformation

pGFP::SW2, der von Wang et al. konstruierte Shuttle-Vektor, enthielt ein β-Lactamase-Gen als Selektionsmarker. Es trägt auch ein CAT-Gen, das mit dem GFP-Gen fusioniert ist . Wir fanden heraus, dass E. coli, transformiert mit dem pGFP::SW2 Plasmid, in chloramphenicol enthaltendem Medium wachsen konnte (Endkonzentration: 170 µg/ml), was darauf hindeutet, dass das CAT-Gen auch als Selektionsmarker für Chlamydien-Transformationsexperimente verwendet werden kann. Wie von Wang et al., eine nachteilige Wirkung von Chloramphenicol auf Wirtsmitochondrien, wie von Li et al. kann die Nützlichkeit dieses Antibiotikums für Chlamydien-Transformation beeinflussen . In Li et al.die minimale toxische Konzentration von Chloramphenicol betrug 10 µg / ml, was zu einer leichten Verringerung der ATP-Produktion um 20% führte. Wir haben festgestellt, dass die scheinbare niedrigste Chloramphenicolkonzentration die Einschlussbildung im plasmidfreien C vollständig inhibierte. der als L2R bezeichnete trachomatis L2-Stamm betrug nur 0,05 µg / ml (Daten nicht gezeigt), was weit unter den für Wirtszellen toxischen Konzentrationen lag. Daher argumentierten wir, dass dieses Antibiotikum verwendet werden könnte, um CAT-exprimierende Transformanten auszuwählen, ohne die Wirtszellen signifikant zu belasten.

Wir transformierten L2R mit pGFP ::SW2 und wählten eine Hälfte der transformierten Zellen mit Ampicillin und die andere Hälfte mit Chloramphenicol aus. Die Antibiotika (2 µg/ml Ampicillin oder 0,1 µg/ml Chloramphenicol) wurden den Kulturen 10 h nach der Transformation zugesetzt. Ab Passage 2 wurden ihre Konzentrationen auf 5 bzw. 0,2 µg / ml erhöht und zum Zeitpunkt der Inokulation zugegeben. Das Spaltverhältnis zwischen den Durchgängen blieb 1: 1 von Durchgang 1 bis Durchgang 4. Obwohl die MHK von Chloramphenicol, die bei geringer Infektionsmultiplizität (~ 0,1 einschlussbildende Einheiten pro Zelle) bestimmt wurde, 0,05 µg / ml betrug, wurde erwartet, dass einige der nicht transformierten Chlamydien in Gegenwart von 0,1 – 0 Einschlüsse bilden.2 µg / ml das Antibiotikum, da wir ein hohes EB-zu-Zell-Verhältnis für die Transformation verwendet haben und die Wirksamkeit der Chlamydienwachstumshemmung durch Antibiotika durch die Vielzahl der Infektionen beeinflusst wird . Mit dem oben beschriebenen Auswahlprotokoll wurde in Kulturen, die mit Ampicillin ausgewählt wurden, unter einem Phasenkontrastmikroskop festgestellt, dass fast 100% der Zellen einen Einschluss mit abweichendem RBs bei der anfänglichen Passage enthielten. Die aberranten RB-haltigen Einschlüsse waren bei Durchgang 2 noch in einem geringen Anteil der Zellen vorhanden, wurden aber bei Durchgang 3 meist durch scheinbar normale Einschlüsse ersetzt. Normale Einschlüsse wurden in etwa 20% der Zellen gefunden, und abnormale Einschlüsse wurden selten bei Passage 4 beobachtet. Bei Durchgang 5, der aus einer Inokulation mit 10% Ernte aus Durchgang 4 resultierte, wurden Einschlüsse in 80% Zellen gefunden; anscheinend enthielt keiner dieser Einschlüsse aberrante RBs.

Da Chloramphenicol nicht dazu führt, dass Chlamydien aberrante RBs bilden, beurteilten wir die Resistenz gegen das Antibiotikum anhand der Einschlussgröße. Einschlüsse kleinerer als normaler Größe wurden in fast allen Zellen bei Passage 1 nachgewiesen. Einige, aber sehr kleine Einschlüsse wurden in Durchgang 2 gefunden, und die meisten dieser Einschlüsse wurden durch Durchgang 3 durch normal große Einschlüsse ersetzt. normalgroße Einschlüsse wurden in mehr als 20% Zellen bei Passage 4 gefunden. Bei Passage 5, abgeleitet nach Inokulation mit 10% Passage 4 Ernte, und einer Erhöhung der Chloramphenicolkonzentration (von 0,2 µg / ml auf 0,5 µg / ml) wurden normal große Einschlüsse in fast 100% Zellen gefunden 0000000.

Zusätzlich zur offensichtlichen Resistenz gegen die Selektionsmittel verwendeten wir die GFP-Expression und die Wiederherstellung der Glykogensynthese als zusätzliche Marker für eine erfolgreiche Transformation . EBs, die aus Passage 5 geerntet wurden, wurden verwendet, um McCoy-Zellen mit einer Verdünnungsrate von 1: 100 (Zellzahläquivalenz) für Experimente zur Bestimmung der GFP-Expression und Glykogensynthese zu infizieren (Abbildung 2). Wie erwartet exprimierten weder Wildtyp-Plasmid-voll C. trachomatis L2 (434/bu) (Abbildung 2A) noch untransformiertes Plasmid-freies L2R (Abbildung 2B) GFP. Im Einklang mit den etablierten Erkenntnissen, dass die Glykogensynthese in C. trachomatis benötigt sein Plasmid , Jodfärbung zeigte, dass Glykogen in den Einschlüssen des Wildtyps L2 akkumuliert wurde (Abbildung 2A), nicht jedoch in denen von L2R (Abbildung 2B). In Gegenwart von 5 µg / ml Ampicillin, das die RB-Teilung hemmt, bildete nicht transformiertes L2R (Abbildung 2C) Einschlüsse, die Riesen-RBs enthielten, ohne Glykogen zu produzieren; während Chloramphenicol (Endkonzentration: 0,5 µg / ml) die Bildung sichtbarer Einschlüsse in L2R-infizierten Zellen vollständig hemmte (Abbildung 2D). Konsistent mit den von Wang et al. , pGFP::SW2-transformiertes L2R, das mit Ampicillin selektiert wurde, bildete GFP-positive Einschlüsse mit Glykogen (Abbildung 2E). pGFP :: SW2-transformiertes L2R, das mit Chloramphenicol selektiert wurde, bildete ebenfalls GFP-positive Einschlüsse, die Glykogen enthielten (Abbildung 2F). Wie erwartet konnten Ampicillin-selektierte Transformanten in Gegenwart von Chloramphenicol normalgroße, GFP-positive, glykogenhaltige Einschlüsse bilden (Abbildung 2G); ebenso waren Chloramphenicol-selektierte Transformanten vollständig resistent gegen Ampicillin, exprimierten GFP und produzierten Glykogen (Abbildung 2H). Diese Ergebnisse legen nahe, dass das CAT-Gen im pGFP::Das SW2-Plasmid ist in Chlamydien funktionell, und die Chloramphenicolresistenz kann als Selektionsmarker für die Chlamydientransformation verwendet werden.

Inklusion, GFP Expression und Glykogensynthese von pGFP::SW2 Transformanten von C. trachomatis L2. Untransformierter plasmid-kompletter Stamm 434/bu (A), untransformierter Plasmid-freier Stamm L2R (B-D) und transformiertes L2R, selektiert entweder mit Ampicillin (E, G) oder Chloramphenicol (F, H), wurden entweder mit Medium, das ein indiziertes Antibiotikum enthielt, oder mit antibiotikafreiem Medium kultiviert. Bilder von Einschlüssen in ungefärbten und jodgefärbten Kulturen wurden mit Phasenkontrastmikroskopie oder Fluoreszenzmikroskopie 48 h nach Inokulation aufgenommen. In allen Panels sind Phasenkontrast- und GFP-Bilder überlagerbar.

Als nächstes entfernten wir das β-Lactamase-Gen aus dem pGFP::SW2-Plasmid, wie im Abschnitt “Methoden” beschrieben, und verwendete das resultierende pGFP-CAT :: SW2-Plasmid zur Transformation von L2R. Transformierte Chlamydien wurden einer Selektion mit Chloramphenicol unter Verwendung des gleichen Regimes wie oben beschrieben unterzogen. Chloramphenicol-resistente Einschlüsse traten in etwa 20% der infizierten Zellen in der Kultur der Passage 4 auf. Fluoreszenzmikroskopie und Jodfärbung zeigten GFP- und Glykogen-positive Einschlüsse in Zellen, die mit EBs infiziert waren, die aus Passage 5 geerntet und in Gegenwart von Chloramphenicol kultiviert wurden (Abbildung 3, obere Tafel). Infolge eines Mangels an β-Lactamase im pGFP-CAT :: SW2-Plasmid waren die Transformanten jedoch nicht in der Lage, in Gegenwart von Ampicillin normale Einschlüsse zu bilden, sondern ihre Einschlüsse waren mit abweichendem RBs gefüllt. Während die unregelmäßigen Einschlüsse noch positiv für GFP waren, waren sie weitgehend frei von Glykogen (Abbildung 3, untere Tafel). Nach Passage 5 wurden die pGFP-CAT::SW2-Transformanten mit 0,5 µg/ml Chloramphenicol für weitere vier Passagen bei einem Spaltverhältnis von 1:100 für jede Passage kultiviert. Alle Einschlüsse an Passage 9 hatten das gleiche Aussehen wie die Einschlüsse von plasmidreichen Chlamydien und nicht die des plasmidfreien L2R, und es wurde festgestellt, dass alle GFP exprimieren (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse belegen, dass das CAT-Gen im pGFP-CAT::SW2-Plasmid, ähnlich dem pGFP::SW2-Plasmid, als Selektionsmarker für die C. trachomatis-Transformation fungiert.

Inklusion, GFP-Expression und Glykogensynthese in L2R transformiert mit pGFP-CAT::SW2. Zellen, die mit Chloramphenicol-ausgewählten Transformanten infiziert waren, wurden entweder Chloramphenicol oder Ampicillin ausgesetzt. Bilder von Einschlüssen in ungefärbten und jodgefärbten Kulturen wurden mit Phasenkontrastmikroskopie oder Fluoreszenzmikroskopie 48 h nach Inokulation aufgenommen. Phasenkontrast- und GFP-Bilder sind überlagerbar.

Es sei darauf hingewiesen, dass Tam et al. hat zuvor versucht, ein Transformationssystem mit dem CAT-Gen als selektiven Marker zu entwickeln . In dieser Studie wurde ein Shuttle-Vektor, der ein CAT-Gen enthielt, in EBs von C elektroporiert. trachomatis E (Stamm UW-5/CX) und L2 (Stamm 434/Bu). Obwohl sowohl CAT-mRNA als auch Enzymaktivität in den initialen Kulturen transformierter Chlamydien nachweisbar waren, gelang es den Autoren nicht, stabile Transformanten nach Selektion mit Chloramphenicol für 4 Passagen zu erhalten. Es ist wichtig zu beachten, dass beide elektroporierten Stämme ein natives Plasmid enthalten, das denselben Replikationsursprung wie das für die Transformation verwendete rekombinante Plasmid aufweist . Da Wang et al. konnten stabile Penicillin-resistente Transformanten nur aus L2R, einem plasmidfreien C, erhalten. trachomatis L2-Variante, nicht aber der Wildtyp, Plasmid-vollgestopft 434/Bu, unter ansonsten identischen Versuchseinstellungen, ist es retrospektiv nicht verwunderlich, dass Tam et al. es gelang nicht, stabile Chloramphenicol-resistente Chlamydien abzuleiten.