Chromosomenmalerei

8 Chromosomengebiete

Anstatt im gesamten Kern verteilt zu sein, nimmt jedes Chromosom ein bestimmtes Volumen ein, das als Chromosomengebiet bezeichnet wird. Dies wurde durch Chromosomenmalerei demonstriert – eine fischbasierte Technik, bei der das Genom mit einer großen Anzahl chromosomenspezifischer Sonden hybridisiert wird, um die Visualisierung einzelner Chromosomen innerhalb des Zellkerns zu ermöglichen. Die radiale Positionierung eines Chromosoms wird stark von seiner Zusammensetzung beeinflusst – genarme Chromosomen neigen dazu, Positionen näher an der Kernperipherie einzunehmen, während genreiche Chromosomen häufiger zum Inneren hin lokalisiert sind . Dieser Trend wird durch die menschlichen Chromosomen 18 und 19 veranschaulicht, die in ihrer Größe sehr ähnlich sind, aber eine sehr unterschiedliche Sequenzzusammensetzung aufweisen: Chromosom 18 ist genarm, während 19 genreich ist. Das Bickmore-Labor verwendete Chromosom-2-FISCHE, um die Positionen der beiden Chromosomen im Zellkern zu untersuchen, und stellte fest, dass Chromosom 18 sowohl in lymphoblastoiden als auch in Fibroblasten-Zelllinien konsistent näher an der Kernperipherie lag als Chromosom 19 . Die radiale Positionierung der Chromosomen im Zellkern erwies sich ebenfalls als gewebespezifisch, wobei eng verwandte Zelltypen eine ähnlichere Chromosomenpositionierung aufwiesen . Das menschliche Genom enthält auch fünf akrozentrische Chromosomen, die rDNA-Sequenzen enthalten – Chromosomen 13, 14, 15, 21 und 22, die normalerweise um den Nukleolus gruppiert sind — den Ort der Transkription und Verarbeitung von ribosomaler RNA.

Die radiale Regel der Chromosomenpositionierung beeinflusst auch die Positionierung alternierender genreicher und genarmer Segmente innerhalb von Chromosomen – in diesem Fall befinden sich genreiche Segmente zentraler, während genarme Regionen Regionen einnehmen, die näher an der Peripherie liegen. Darüber hinaus befinden sich innerhalb von Chromosomengebieten transkriptionell inaktive Segmente intern und transkriptionell aktive Segmente an der Oberfläche des Territoriums . Diese Anordnung ermöglicht transkriptionell aktiven Regionen den Zugriff auf die Transkriptionsmaschinerie und Domänen, die reich an mRNA-Stoffwechselfaktoren wie SC-35-Foci sind . Die feindetaillierte Struktur der Chromosomenregionen ist jedoch noch unklar, was unser mangelndes Wissen über die Chromatinstrukturen widerspiegelt, die sie formen.

Aus der Perspektive der Genomstabilität bezieht sich eine wichtige Konsequenz von Chromosomenpositionierungsmustern auf Translokationen, die häufigste Chromosomenanomalie in der menschlichen Bevölkerung. Es ist bekannt, dass die physische Nähe zweier Chromosomen im Kern die Wahrscheinlichkeit einer Translokation zwischen ihnen beeinflusst (Abb. 23.3).

Abbildung 23.3. Bevorzugte Positionen von Chromosomen im Zellkern beeinflussen die Translokationsfrequenz.

Chromosomen mit der gleichen bevorzugten radialen Position im Zellkern (z. B. Chromosomen 17 und 19) sind eher an Translokationen beteiligt als Chromosomen mit unterschiedlichen radialen Positionen (z. B. Chromosomen 17 und 18).

Eine Analyse zwischen den Häufigkeiten verschiedener nichtpathogener Translokationen in der menschlichen Bevölkerung und den bevorzugten radialen Positionen von Chromosomen im Zellkern ergab, dass Chromosomen mit ähnlichen Kernpositionen Translokationen bilden häufiger als zufällig erwartet . Eine andere Studie konnte eine enge Nähe zwischen den BCR- und ABL-Loci nachweisen, die an der gut charakterisierten t (9; 22) -Translokation beteiligt sind, die bei chronischer myeloischer Leukämie ein “Philadelphia” -Chromosom bildet. Die Autoren zeigten, dass die BCR- und ABL–Loci in B-Lymphozyten näher waren als in hämatopoetischen Vorläuferzellen, was darauf hindeutet, dass zelltypspezifische Aspekte der nuklearen Organisation zur Assoziation bestimmter Translokationen mit bestimmten Krebsarten beitragen können. Im Jahr 2013 veröffentlichte das Misteli-Labor eine Studie, in der die Dynamik von Doppelstrangbrüchen und die anschließende Translokationsbildung in einem eleganten System untersucht wurden: NIH3T3duo-Zellen kodieren eine kleine Anzahl von SceI-Restriktionsenzymstellen, die auf verschiedenen Chromosomen integriert sind, wobei einige Stellen an ein LacO-Array und andere an ein TetO-Array angrenzen. Bei der Bruchinduktion durch das SceI-Enzym konnten die Brüche verfolgt werden, die durch fluoreszenzmarkierte Lac (LacR) – und Tet (TetR) -Repressorproteine markiert waren; die Translokationsbildung wurde durch lang anhaltende, stabile Kolokalisierung der LacR- und TetR-Signale angezeigt. Die Autoren konnten zeigen, dass die meisten Translokationen von Loci gebildet werden, die vor der Bruchinduktion eng lokalisiert sind (Kontakt-erstes Modell), und nicht als Ergebnis einer Bewegung von Doppelstrangbrüchen zu proximalen Stellen (Bruch-erstes Modell).

Neben Methoden zur Analyse von Chromosomenregionen werden zwei komplementäre Hauptmethoden verwendet, um die 3D-Organisation des Genoms auf der Ebene der Domänenstruktur höherer Ordnung zu untersuchen: Fischbasierte Methoden und Methoden zur Erfassung der Chromosomenbestätigung . FISH setzt auf die Hybridisierung fluoreszenzmarkierter Sonden, um einzelne Loci, definierte Teile des Genoms oder ganze Chromosomen sichtbar zu machen. Es bietet eine Momentaufnahme der Kernstruktur auf Einzelzellebene, hat jedoch den Nachteil, dass es zeitaufwändig ist und eine begrenzte Menge an Informationen bei niedriger Auflösung liefert. Chromatin Conformation Capture (3C) -Techniken beruhen auf dem “Einfrieren” der Kernstruktur durch vernetzende Wechselwirkungen innerhalb des Kerns, Ligieren von DNA-Fragmenten, die durch die Querverbindungen in der Nähe gehalten werden, gefolgt von PCR oder Next-Generation-Sequenzierung, um hybride DNA-Fragmente zu identifizieren, die auf Kontakte hinweisen. Am raffiniertesten Ende können diese Techniken theoretisch alle möglichen Interaktionen im gesamten Genom identifizieren, aber es gibt auch Nachteile. Im Gegensatz zu FISH arbeiten 3C-Techniken eher an Zellpopulationen als auf Einzelzellebene, wodurch ein Populationsdurchschnitt erzeugt wird, der eine Reihe unterschiedlicher Kontaktkonfigurationen auf Einzelzellebene widerspiegeln kann. Trotz der Vorbehalte waren 3C-Methoden auf dem Gebiet der 3D-Genomorganisation sehr einflussreich und trugen zum Konzept der topologisch assoziierenden Domänen (TADs) bei. TADs sind definiert als Regionen mit einer Größe von ∼900 kb, in denen Kontaktkarten erhöhte Interaktionen zeigen; FISH-basierte Studien haben gezeigt, dass Sonden, die sich innerhalb eines TAD befinden, physikalisch näher sind als Sonden, die sich nicht innerhalb desselben TAD befinden, aber durch einen ähnlichen “linearen” genomischen Abstand voneinander getrennt sind . Das gesamte menschliche Genom ist in ungefähr 2000 TADs unterteilt, die sich auch mit der Verteilung von Histonmarken und anderen genomischen Merkmalen wie dem Replikationszeitpunkt (später beschrieben) überschneiden. Sie sind jedoch nicht zelltypspezifisch und die Frage, welche Ebene der strukturellen Organisation sie widerspiegeln und welche funktionelle Bedeutung sie haben, ist noch offen. Interessanterweise kann das Translokationshäufigkeitsmuster, das bei Chromosomenterritorien beobachtet wird, auch auf die TAD—Organisationsebene zurückgeführt werden – eine Studie, die in B-Zellen durchgeführt wurde, ergab, dass die Wahrscheinlichkeit einer Translokation zwischen zwei Loci stark mit der Kontaktfrequenz zwischen ihnen zusammenhängt, wie durch Chromosomenbestätigungserfassung definiert -generierte Kontaktkarten .