Chymotrypsinogen A

C.A.S.: 9035-75-0

Enzymatische Reaktion (Bild wird in einem neuen Fenster geöffnet)

Chymotrypsin ist eine Serinendopeptidase, die von den Azinuszellen der Bauchspeicheldrüse produziert wird. Chymotrypsin wird nach Proteolyse von Chymotrypsinogen durch Trypsin aktiviert. Während Trypsin an Lysin und Arginin hydrolysiert, spaltet Chymotrypsin selektiv Peptidbindungen, die durch aromatische Reste (Tyrosin, Phenylalanin und Tryptophan) gebildet werden (Hedstrom et al. 1992). Zwei vorherrschende Formen von Chymotrypsin, A und B, werden in gleichen Mengen in der Bauchspeicheldrüse von Rindern gefunden. Sie sind sehr ähnliche Proteine (80% identisch), haben aber signifikant unterschiedliche proteolytische Eigenschaften (Hartley 1964, Meloun et al. 1966, Smillie et al. 1968, und Gráf et al. 2004). Die folgenden Informationen beziehen sich hauptsächlich auf die A-Form von Chymotrypsinogen und Chymotrypsin.

Geschichte:

In den frühen 1900er Jahren schlug Vernon vor, dass Pankreaspräparate einen intrinsischen Aktivator seiner eigenen Enzyme hervorrufen könnten (Vernon 1901). Vernons Milchgerinnungsexperimente ergaben, dass mindestens zwei Enzyme vorhanden waren und dass eines stabiler war als das andere (Vernon 1902). Diese Idee wurde jedoch erst 1934 allgemein akzeptiert, als Kunitz und Northrop das Vorhandensein eines Enzyms zusätzlich zu Trypsin bestätigten und es Chymotrypsin nannten. Sie konnten Chymotrypsin sowie den inaktiven Vorläufer Chymotrypsinogen kristallisieren (Kunitz und Northrop 1934). 1938 isolierte Kunitz verschiedene aktive Formen von Chymotrypsin und bezeichnete sie als Alpha, Beta und Gamma (Kunitz 1938).

In den frühen 1940er Jahren untersuchten Fruton und Bergmann die Spezifität von Chymotrypsin weiter und berichteten über mehrere neue Substrate (Fruton und Bergmann 1942). Jacobsen identifizierte bald weitere Formen von Chymotrypsin und bezeichnete sie als Delta und Pi (Jacobsen 1947). 1948 charakterisierte Schwert die Molekulargewichte von Chymotrypsin und Chymotrypsinogen weiter.

1954 wurde der erste Beweis für den dreistufigen Mechanismus der Chymotrypsin-Hydrolyse von Amid- und Estersubstraten von Hartley und Kilby berichtet, die die Anwesenheit eines Acylenzym-Intermediats vermuteten, was sich später als wahr herausstellte (Henderson 1970). 1955 erhielt Laskowski ein zweites kristallines Chymotrypsinogen und nannte es Chymotrypsinogen B. 1964 bestimmte Hartley die Aminosäuresequenz von Chymotrypsin A, die später von Meloun et al. im Jahr 1966. Im Jahr 1968, Smillie et al. bestimmung der Aminosäuresequenz von Chymotrypsin B, die eine 80% ige Sequenzidentität mit Chymotrypsin A ergab. In den 1970er und 1980er Jahren wurde geforscht, um den Wirkungsmechanismus besser zu verstehen und die Unterschiede in den Aminosäuresequenzen zwischen Trypsin und Chymotrypsin zu identifizieren (Steitz et al. 1969, Cohen et al.1981, Asbóth und Polgár 1983 und Gráf et al. 1988).

In den 1990er Jahren wurde Chymotrypsin aus anderen Quellen gereinigt, darunter Atlantischer Kabeljau (Ásgeirsson und Bjarnason 1991) und Kamel (Al-Ajlan und Bailey 1997). Darüber hinaus wurde mit der Untersuchung von Inhibitoren begonnen (Baek et al. 1990) und Frigerio et al. klärte die Kristallstruktur von bovinem Chymotrypsin auf eine Auflösung von 2,0 Å auf (Frigerio et al. 1992).

Neuere Forschungen haben die Faltung und Denaturierung von Chymotrypsin über einen Konzentrationsbereich untersucht (Ghaouar et al. 2010), Chymotrypsins Interaktion mit Nanopartikelsubstraten (You et al. 2006 und Jordan et al. 2009) und Erhöhung der Chymotrypsinstabilität durch Konjugation an PEG-Moleküle (Castellanos et al. 2005 und Rodríguez-Martínez et al. 2009).

Spezifität:

Chymotrypsin wird durch Spaltung der Bindung zwischen Arginin und Isoleucin (R15 und I16) durch Trypsin aktiviert, was zu strukturellen Modifikationen und zur Bildung der Substratbindungsstelle führt (Sears 2010). Chymotrypsin unterscheidet sich von Trypsin dadurch, dass Trypsin Peptide an Arginin- und Lysinresten spaltet, während Chymotrypsin große hydrophobe Reste bevorzugt (Hedstrom et al. 1992). Chymotrypsin katalysiert bevorzugt die Hydrolyse von Peptidbindungen, an denen L-Isomere von Tyrosin, Phenylalanin und Tryptophan beteiligt sind. Es wirkt auch leicht auf Amide und Ester empfindlicher Aminosäuren. Die Spezifität von Chymotrypsin für große hydrophobe Reste kann durch eine hydrophobe S1-Bindung erklärt werden, die durch die Reste 189 bis 195, 214 bis 220 und 225 bis 228 gebildet wird (Cohen et al. 1981).

Obwohl die Struktur der S1-Stelle von Trypsin und Chymotrypsin nur einen Unterschied aufweist (an Position 189), konnte die ortsgerichtete Mutagenese von Trypsin und Chymotrypsin keine Spezifitäten austauschen, was darauf hindeutet, dass der Mechanismus, durch den Trypsin und Chymotrypsin eine substratspezifische Katalyse erreichen, nicht vollständig verstanden ist (Steitz et al. 1969 und Gráf et al. 1988).

Zusammensetzung:

Die drei Aminosäurereste der katalytischen Triade (H57, D102 und S195) sind essentiell für die Peptidbindungsspaltung und werden durch Wasserstoffbrückenbindungen stabilisiert (Sears 2010 und Gráf et al. 2004). G193 und S195 bilden das Oxyanion-Loch und interagieren mit der Carbonylgruppe der Nitrilpeptidbindung, wobei sie zum tetraedrischen Zwischenprodukt ausgerichtet werden (Rühlmann et al. 1973, Huber und Bode 1978 und Gráf et al. 2004).

Molekulare Eigenschaften:

Chymotrypsin A und B teilen 80% Sequenzidentität (Hartley 1964, Meloun et al. 1966, Smillie et al. 1968, und Gráf et al. 2004). Die Aminosäuren der katalytischen Triade (H57, D102 und S195) sind in den Sequenzen der Peptidasen der Familie S1 (Gráf et al. 2004). Das Serin an Position 214 ist auch in der Familie hoch konserviert und wurde als viertes Mitglied der katalytischen Triade vorgeschlagen (Ohara et al. 1989 und McGrath et al. 1992).

Proteinzugangsnummer: P00766

CATH-Klassifikation (v. 3.3.0):

• Klasse: Hauptsächlich Beta
• Architektur: Beta Barrel
• Topologie: Trypsin-ähnliche Serinprotease

Molekulargewicht:

• 25.6 kDa (Wilcox 1970)

Optimaler pH-Wert: 7,8-8,0 (Rick 1974)

Isoelektrischer Punkt:

• 8.52 (Chymotrypsinogen, Theoretical)
• 8.33 (Chymotrypsin, Theoretical)

Extinction Coefficient:

• 51,840 cm-1 M-1 (Theoretical)
• E1%,280 = 20.19 (Chymotrypsinogen, Theoretical)
• E1%,280 = 20.57 (Chymotrypsin, Theoretical)

Active Site Residues:

• Histidine (H57)
• Aspartate (D102)
• Serine (S195)

Activators:

• Cetyltributylammonium bromide (Spreti et al. 2008)
• Dodecyltrimethylammonium bromide (Abuin et al. 2005)
• Hexadecyltrimethylammonium bromide (Celej et al. 2004)
• Tetrabutylammonium bromide (Spreti et al. 2001)

Inhibitors:

• Hydroxymethylpyrroles (Abell and Nabbs 2001)
• Boronic acids (Smoum et al. 2003)
• Courmarin derivatives (Pochet et al. 2000)
• Peptidyl aldehydes (Lesner et al. 2009)
• Peptides from natural sources (Telang et al. 2009, Roussel et al. 2001, and Chopin et al. 2000)
• Peptides containing an unnatural amino acid (Legowska et al. 2009, and Wysocka et al. 2008)

Anwendungen:

• Sequenzanalyse
• Peptidsynthese
• Peptidkartierung
• Peptid-Fingerprinting