Cistron
Biogenese von PTX
Die fünf PTX-Untereinheiten werden von zusammenhängenden Cistronen innerhalb eines einzigen polycistronischen Operons kodiert, dessen Expression durch das BvgA / S-System reguliert wird. Über dieses Zweikomponentensystem kann die Toxinproduktion durch die Anwesenheit von MgSO4 oder Nikotinsäure oder während des Wachstums bei niedrigen Temperaturen moduliert werden (zur Überprüfung siehe ). BvgS ist ein inner-Membran-Spanning-Protein, das mehrere Kinase-Aktivitäten exprimiert. Im aktiven Zustand aktiviert es BvgA über Phosphorylierung. Phosphoryliertes BvgA, ein zytoplasmatischer Transkriptionsregulator, bindet dann an die Operatorstellen der PTX-Genpromotorregion, wo es mit der RNA-Polymerase interagiert und die Transkription aktiviert. Obwohl Modulatoren, die die BvgS-Signalisierung stören, identifiziert wurden, ist kein BVGS-Ligand bekannt, der zum Auslösen der Signalisierung erforderlich ist, was darauf hindeutet, dass BvgS standardmäßig aktiviert ist .
Nach der Transkription werden die einzelnen Untereinheiten als Präproteine mit spaltbaren Signalpeptiden hergestellt. Bei Translokation durch die innere Membran (höchstwahrscheinlich über einen Sec-abhängigen Weg) werden die Signalpeptide entfernt. Obwohl die Signalpeptide typische Merkmale der Substrate für Leader-Peptidase I aufweisen, ist ihre Spaltung durch die Escherichia coli-Leader-Peptidase I sehr ineffizient. Die Koexpression des B. pertussis lep-Gens in E. coli erhöht die Reifung von PTX-Untereinheiten erheblich . Innerhalb des periplasmatischen Raums werden Disulfidbindungen innerhalb der Untereinheit gebildet, und das Holotoxin wird dann vor der Sekretion durch die äußere Membran zusammengebaut. PTX enthält insgesamt 11 Disulfidbindungen innerhalb der Untereinheit, eine in S1, zwei in S4 und S5 und drei in S2 und S3 . Alle in PTX vorhandenen Cysteine sind an Intra-Chain-Disulfidbindungen beteiligt . Die Disulfidbildung ist wichtig für die Toxinbiogenese, da die Veränderung des Cysteins in S1 verhindert, dass sich diese Untereinheit mit dem B-Oligomer verbindet . Die richtige Disulfidbildung beruht auf dem DsbA / DsbC-System, das sich als wesentlich für die PTX-Assemblierung und -sekretion erwiesen hat . Mutationen in dsbC, die für eine von drei Disulfid-Isomerasen kodieren, haben jedoch anscheinend keinen Einfluss auf den Aufbau des Toxins, obwohl sie dessen Sekretion beeinträchtigen, was darauf hindeutet, dass DsbC auf eine Komponente einwirkt, die speziell für die PTX-Sekretion erforderlich ist.
Sekretion ist für biologische Aktivitäten von PTX nicht erforderlich, aber die vollständige Assemblierung des Holotoxins ist wichtig für eine effiziente Sekretion, da Stämme, die nur S1 oder nur das B-Oligomer produzieren, einen Sekretionsdefekt aufweisen . Ein voll funktionsfähiges B-Oligomer kann jedoch in Abwesenheit von S1 bis zu einem gewissen Grad sezerniert werden, was darauf hinweist, dass die Anwesenheit von S1 keine absolute Voraussetzung für die B-Oligomersekretion ist. Im Gegensatz dazu kann S1 allein nicht in Abwesenheit des B-Oligomers sezerniert werden, was darauf hindeutet, dass sich die Sekretionsdeterminanten innerhalb des B-Oligomers befinden, obwohl die Anwesenheit von S1 die Sekretionseffizienz sicherlich verbessern kann. Bestimmte Mutationen im S1-Gen haben eine starke schädliche Wirkung auf die Sekretion, insbesondere im Bereich um Arg-57 , was darauf hindeutet, dass diese Region von S1 eine Rolle bei der Sekretion von PTX spielt. In Abwesenheit des B-Oligomers verteilt sich S1 höchstwahrscheinlich an die äußere Membran, möglicherweise über seine C-terminale, hydrophobe Domäne. Dies kann der Ort der Assemblierung mit dem B-Oligomer vor der Sekretion durch die äußere Membran sein.
Die molekularen Schritte der Holotoxin-Assemblierung sind noch wenig verstanden. Einzelne Untereinheiten in Mutantenstämmen, die die anderen Untereinheiten nicht produzieren, werden schnell abgebaut. Bestimmte Kombinationen von Untereinheiten scheinen sich gegenseitig zu stabilisieren . Zum Beispiel wird die Stabilität der S2–Untereinheit durch die Anwesenheit von S4 stark verbessert und umgekehrt, was mit der S2-S4-Dimerbildung übereinstimmt, die durch die Kristallstruktur des Holotoxins aufgedeckt wird. Es ist auch möglich, dass Unterbaugruppen des S2–S4-Dimers mit der S1-Untereinheit in Abwesenheit von S3 und S5 gebildet werden. Es wurde nicht festgestellt, dass das S2–S4-Dimer in B sezerniert ist. Pertussis, während die Zugabe von S1 zu diesem Dimer zu einem gewissen Grad an Sekretion führen kann.
Der Transport von PTX durch die äußere Membran von B. pertussis beruht auf einem Typ-IV-Sekretionssystem (T4SS), das aus neun verschiedenen Proteinen besteht, genannt PtlA durch PtlI . Diese Proteine sind homolog zu denen von T4SSs aus anderen Bakterien, einschließlich Agrobacterium tumefaciens, Bartonella tribocorum, Brucella suis, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila und Rickettsia prowasekii . Die ptl-Gene liegen direkt stromabwärts der fünf strukturellen PTX-Gene und stehen unter der Kontrolle des ptx-Promotors. Die Ptl-Proteine scheinen jedoch auf niedrigeren Ebenen produziert zu werden als die PTX-Untereinheiten, wie durch translationale Fusionen des phoA-Gens mit verschiedenen ptx- und ptl-Genen belegt . Die Produktion bestimmter Ptl-Proteine scheint ein begrenzender Schritt bei der Sekretion von PTX zu sein. Während des exponentiellen Wachstums wurde geschätzt, dass die Bakterien drei Toxinmoleküle / min / Bakterienzelle absondern , und es wurde festgestellt, dass sich Untereinheiten innerhalb des periplasmatischen Raums ansammeln, sowohl als einzelne Untereinheiten als auch zu Holotoxinen zusammengesetzt. Die Akkumulation von Untereinheiten erfolgt während des gesamten exponentiellen Wachstums, obwohl der Gehalt bestimmter Ptl-Proteine auf 30 bis 1.000 Moleküle pro Zelle ansteigt. Daher kann die Sekretion anstelle der Toxinproduktion oder -assemblierung die Rate begrenzen. Seltsamerweise können in Abwesenheit der Ptl–Proteine einige Untereinheitskombinationen, wie das S2-S4-Dimer in Gegenwart von S1, sezerniert werden, obwohl die Sekretion des Holotoxins stark von der Anwesenheit der Ptl-Proteine abhängt.
Es wird angenommen, dass die Ptl-Proteine einen Komplex bilden, der sich sowohl über die innere als auch über die äußere Membran erstreckt , und alle (mindestens PtlA-H) scheinen für die Toxinsekretion erforderlich zu sein, wie durch Mutationen in jedem einzelnen ptl-Gen untersucht wurde . Einige der Mutationen, die in trans in Wildtyp-ptl + -Stämme eingeführt wurden, führten zu einem dominanten negativen Sekretionsphänotyp, was bestätigt, dass mindestens PtlC bis PtlH Teil eines multimeren Komplexes sind. Ein Schlüsselschritt in der PTX-Sekretion ist offensichtlich seine Fähigkeit, die Peptidoglycan-Schicht zu überqueren, und es wurde gezeigt, dass PtlE die Peptidogycanase-Aktivität exprimiert . Dieses 276-Rückstand-lange Protein enthält aktive site Ähnlichkeiten mit anderen Glycohydrolasen, und Alaninsubstitutionen an dieser Site sind gezeigt worden, um die peptidoglycanase Tätigkeit von recombinant PtlE groß zu vermindern. Die gleichen Substitutionen in natürlichem PtlE beseitigen auch die Sekretion von PTX durch B. pertussis, was stark darauf hindeutet, dass PtlE die Peptidoglycanase ist, die erforderlich ist, damit das Toxin die Peptidoglycanschicht kreuzt.
PTX-Sekretion benötigt höchstwahrscheinlich auch Energie. Zwei der Ptl-Proteine, PtlC und PtlH, enthalten mutmaßliche Adenosintriphosphat (ATP) –Bindungsstellen und könnten so die für die Toxinsekretion notwendige Energie liefern. Es wurde gezeigt, dass beide Proteine für die Sekretion notwendig sind , und in beiden Fällen sind die mutmaßlichen ATP-Bindungsstellen für die Funktion essentiell. Für beide wird ein dominanter negativer Phänotyp beobachtet, wenn mutierte Allele mit dem Wildtyp-Allel koexprimiert werden, was darauf hindeutet, dass beide als Multimere fungieren oder Teil des Sekretionskomplexes sind. Es wurde gezeigt, dass PtlH mit der inneren Membran assoziiert ist, und Mutationen in der ATP-Bindungsstelle von PtlH beeinflussen seine zelluläre Lage und heben seine Wechselwirkungen mit anderen Ptl-Proteinen auf . Die genaue Rolle von PtlC ist noch nicht bekannt. PtlD ist auch ein inneres Membranprotein und enthält fünf Transmembrandomänen. Es ist für die Stabilität von PtlE, PtlF und PtlH über seine C-terminalen 72-Reste erforderlich. Diese C-terminale Region reicht jedoch nicht für die Toxinsekretion aus . PtlF zeigt Merkmale von äußeren Membranproteinen (OMPs), kann aber auch mit der inneren Membran assoziiert sein. Unter nicht reduzierenden Bedingungen wandern PtlF und PtlI als Komplex während der Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, was darauf hinweist, dass PtlI durch Disulfidbindungsbildung an PtlF bindet. Die richtige Disulfidbindungsbildung zwischen PtlI und PtlF könnte von DsbC abhängen, da Mutationen im dsbC-Gen die Sekretion beeinflussen, ohne die Toxinassemblierung zu beeinflussen .
