Clostridium acetobutylicum
A Microbial Biorealm page on the genus Clostridium acetobutylicum
Classification
Higher order taxa
Bacteria (Domain); Firmicutes (Phylum); Clostridia (Class); Clostridiales (Order); Clostridiaceae (Family); Clostridium (Gattung)
Spezies
Clostridium acetobutylicum
Clostridium acetobutylicum ATCC 824 gilt als typischer Stamm.
NCBI: Taxonomie
Beschreibung und Bedeutung
Clostridium acetobutylicum ist ein grampositiver Bazillus (1). C. acetobutylicum ist am häufigsten Boden Wohnung, obwohl es in einer Reihe von verschiedenen Umgebungen gefunden wurde. Es ist mesophil mit optimalen Temperaturen von 10-65 ° C. Darüber hinaus ist der Organismus saccharolytisch (kann Zucker abbauen) (1) und in der Lage, eine Reihe verschiedener kommerziell nützlicher Produkte herzustellen; vor allem Aceton, Ethanol und Butanol (2).
C. acetobutylicum benötigt anaerobe Bedingungen, um in seinem vegetativen Zustand zu wachsen. In seinen vegetativen Zuständen ist es über Flagellen über die gesamte Oberfläche beweglich. Unter aeroben Bedingungen kann es nur bis zu mehreren Stunden überleben, wobei es Endosporen bildet, die selbst unter aeroben Bedingungen jahrelang anhalten können. Nur wenn sich diese Sporen unter günstigen anaeroben Bedingungen befinden, setzt sich das vegetative Wachstum fort (1).
Es wurde erstmals zwischen 1912 und 1914 isoliert (2). Chaim Weizmann kultivierte die Bakterien, um Aceton, Ethanol und Butanol in einem Verfahren namens ABE-Methode herzustellen. Daher ist es passend, dass C. acetobutylicum oft als “Weizmann-Organismus” bezeichnet wird.” Die Produkte wurden dann im ersten Weltkrieg zur Herstellung von TNT und Schießpulver verwendet (3). Nach dem Ersten Weltkrieg war der ABE-Prozess bis in die 1950er Jahre weit verbreitet, als petrochemische Prozesse aufgrund der Kosten und Verfügbarkeit von Erdölbrennstoffquellen kostengünstiger wurden. Die jüngste Krise mit fossilen Brennstoffen hat zu mehr Forschung über C. acetobutylicum und zur Nutzung des ABE-Prozesses geführt (2).
C. acetobutylicum ist nicht nur ein wichtiges Bakterium für den industriellen Einsatz, sondern wird auch als Modell für die Endosporenbildung in Bakterien untersucht. Es wurde mit den am häufigsten untersuchten Endosporenbakterien Bacillus subtilis verglichen (2). Das Verständnis der Wege der Endosporenbildung ist wichtig, da viele endosporenbildende Bakterien sowohl in den Gattungen Bacillus als auch Clostridium menschliche Krankheitserreger sind.
Der am häufigsten untersuchte Stamm ist der Typ-Stamm ATCC 824. Diese Sorte wurde 1924 in Erde aus einem Garten in Connecticut entdeckt und isoliert. Untersuchungen haben gezeigt, dass der weithin untersuchte ATCC 824 eng mit dem Weizmann-Stamm verwandt ist, der in der frühen industriellen Produktion von Aceton verwendet wurde (2).
Genomstruktur
Das Genom von Clostridium acetobutylicum ATCC 824 wurde mit dem Shotgun-Ansatz sequenziert. Dies ist der Modellstamm für lösemittelproduzierende Bakterien. Das Genom besteht aus einem zirkulären Chromosom und einem zirkulären Plasmid. Das Chromosom enthält 3.940.880 Basenpaare. Es gibt eine geringe Strangverzerrung, wobei ungefähr 51,5% der Gene vom Vorwärtsstrang und 49,5% vom Komplementärstrang transkribiert werden (2).
Zu den bekannten Genen, die Bakterien gemeinsam haben, gehören die 11 Operone, die für Ribosomen kodieren. Es ist interessant, dass jedes dieser Operone in der Nähe des orischen (Replikationsursprungs) liegt und in Richtung des führenden Strangs der Replikationsgabel ausgerichtet ist. (2). Dies ist eine Eigenschaft, die allgemein als Gendosierung bekannt ist, bei der hoch transkribierte Gene in der Nähe des oriC platziert werden. Aufgrund der Orientierung dieser Gene werden sie in größerer Anzahl transkribiert, während die DNA gerade repliziert wird und zusätzliche Kopien des Gens in der Zelle vorhanden sind.
Zusätzlich enthält das Genom ein großes Plasmid (Megaplasmid genannt). Dieses Plasmid scheint fast alle Gene zu enthalten, die an der Lösungsmittelproduktion beteiligt sind, und trägt den treffenden Namen pSOL1. pSOL1 enthält 192.000 Basenpaare und kodiert für 178 Polypeptide. Die Untersuchung des Plasmids zeigt keinen Bias, in welchem Strang der kodierende Strang (2) ist.
Wenn Clostridium acetobutylicum in kontinuierlicher Kultur kultiviert wird oder viele Transfers durchläuft, degeneriert der Stamm langsam, indem er seine Fähigkeit zur Lösungsmittelproduktion verliert. Experimente zur Bestimmung der Ursachen der Degeneration haben gezeigt, dass pSOL1 vier Gene enthält, die für die Alkohol- und Acetonproduktion lebenswichtig sind. Im Laufe vieler Transfers oder fortgesetzten vegetativen Wachstums geht dieses Plasmid verloren. Ein weiterer Beweis für den Verlust dieses Plasmids, der zur Stammdegeneration führt, ist, dass Mutanten, denen diese Gene fehlen und die kein Lösungsmittel produzieren können, die Aceton- und Alkoholproduktion nach Komplementierung der Gene über Plasmide wieder aufnehmen (4).
Andere, weniger untersuchte Stämme von C. acetobutylicum wie ATCC 4259 haben eine ähnliche Degeneration gezeigt. Das Plasmid in diesem Stamm heißt pWEIZ. Auch hier wird angenommen, dass eine Degeneration aufgrund einer seriellen Kultivierung dieses Stammes aufgrund eines eventuellen Verlusts auftritt pWEIZ. Dieser Stamm ist bemerkenswert, weil interessanterweise diese degenerierten Stämme auch nicht sporulieren. Dies hat die Idee beflügelt, dass Gene, die an der Sporulation beteiligt sind, auch auf dem Plasmid sowohl in ATCC 4259 als auch im Typstamm ATCC 824 existieren (4, 2).
Energiestoffwechsel und Nebenprodukte
Clostridium acetobutylicum ist ein Chemoorganotroph. Es erhält Energie über Substratphosphorylierung durch Fermentation. Wie bei allen Fermentationen sind das Substrat organische Moleküle, die als Elektronendonor und Akzeptor fungieren. Daraus folgt, dass es heterotroph ist und seine Kohlenstoffquelle aus organischen Molekülen stammt. Insbesondere C. acetobutylicum benötigt zum Überleben eine fermentationsfähige Kohlenhydratquelle (1).
Darüber hinaus ist C. acetobutylicum ein obligates Anaerob. Es kann nur Stunden in einer aeroben Umgebung überleben, bevor es einer Sporulation unterzogen wird, um viel längere Zeit in der aeroben Umgebung zu überleben. Es zeigt keine Aktivität von Katalase, einem Enzym, das für aerobe Organismen wichtig ist, um ein toxisches Nebenprodukt des Sauerstoffstoffwechsels, Wasserstoffperoxid, in Wasser und Sauerstoff umzuwandeln (5). Es enthält jedoch viele Enzyme, die es ermöglichen, in mikrooxischen Umgebungen wie Superoxiddismutase zu überleben. Diese Enzyme werden in Gegenwart von Sauerstoff hochreguliert und tragen zum kurzfristigen Überleben der Zellen in mikrooxischen Umgebungen bei (6).
C. acetobutylicum ist in der Lage, eine Reihe verschiedener fermentierbarer Kohlenhydrate als Energie- und Kohlenstoffquelle zu nutzen. Das Genom kodiert für Proteine, die beim Abbau von Xylan, Levan, Pektin, Stärke und anderen Polysacchariden helfen (2). Interessanterweise sind Gene vorhanden, die üblicherweise für Cellusomen kodieren, Proteinkomplexe, die kristalline Cellulose abbauen, der Organismus kann jedoch nicht ausschließlich auf Cellulosesubstraten wachsen (7).
Beträchtliche Forschungsarbeiten wurden in die Stoffwechselwege von Clostridium acetobutylicum investiert, um die industrielle Fermentation zu verbessern. Die Stoffwechselwege, die technisch nützliche Lösungsmittel produzieren, sind am bemerkenswertesten in C. acetobutylicum. Die Lösungsmittel Aceton, Acetat, Butanol, Butyrat und Ethanol leiten sich alle vom gemeinsamen Vorläufer Acetyl-CoA (2) ab. Zusätzlich zu diesen Produkten werden CO2 und H2 produziert (1).
Ein weiterer bemerkenswerter Stoffwechselweg ist, dass einige Clostridien (einschließlich C. acetobutylicum) in der Lage sind, atmosphärischen Stickstoff zu “fixieren”. Der Prozess der Stickstofffixierung reduziert atmosphärisches N2 zu Ammoniak, das dann über die Biosynthese in Moleküle eingebaut wird. Dies wurde unter Verwendung einer markierten Form von Stickstoff, 15N2, bestimmt. Nach der Sequenzierung, C. acetobutylicum ATCC 824, eine Reihe von Genen, die den stickstofffixierenden Genen in C. pasteurianum sehr ähnlich sind, wurden gefunden, was die Fähigkeit des Bakteriums, atmosphärischen Stickstoff zu nutzen, weiter bestätigt (8).
Zellstruktur und -entwicklung
Während der frühen Zellentwicklung färbt sich C. acetobutylicum grampositiv, kann jedoch mit zunehmendem Alter der Kultur gramnegativ färben. Während des vegetativen Wachstums hat die Zelle peritrichöse Flagellen (Flagellen, die die gesamte Oberfläche der Zelle bedecken) (1). Eine erhöhte Motilität der Bakterien wurde mit einer erhöhten Lösungsmittelproduktion aufgrund von Chemotaxis in Verbindung gebracht. Lockstoffe umfassen Buttersäure und Zucker. Bemerkenswerte Repellentien umfassen Aceton, Butanol und Ethanol. Dieser Mechanismus ist logisch, da er es der Zelle ermöglicht, Nährstoffe zu finden und sich von Nebenprodukten zu entfernen, die durch ihren eigenen Stoffwechsel produziert werden (9).
Darüber hinaus entstehen bei C. acetobutylicum in verschiedenen Wachstumsphasen unterschiedliche Nebenprodukte. Während der exponentiellen Wachstumsphase sind die Primärprodukte Acetat und Butyrat. Während dieser Zeit findet auch eine Stickstofffixierung statt (8). Einige Zeit nach Eintritt der Zelle in die stationäre Phase (18 Stunden) erreicht die Produktion von Butanol und Aceton ihren Höhepunkt (1). Diese zeitliche Trennung von Stickstofffixierung und Lösungsmittelerzeugung ist vorteilhaft, um eine Konkurrenz um Reduktionsmittel durch die beiden Verfahren (8) zu vermeiden.
Das Hauptstadium der Zellentwicklung ist durch die Bildung einer Endospore gekennzeichnet. Eine Endospore ist der resistenteste bekannte Zelltyp. Bei bestimmten Umwelteinflüssen produziert die vegetative Zelle ein subterminales Septum( 1), ein Ereignis, das mit Elektronenmikroskopie betrachtet werden kann . Dieses Septum wird schließlich zu einer anderen Zelle, der sogenannten Forespore, die von der ursprünglichen Zelle, der Mutterzelle, verschlungen wird. Die Vorderpfote besteht aus einer Schicht aus Cortex (hauptsächlich Peptidoglycan) und Hüllproteinen. Diese beiden hochresistenten Schichten umgeben den Kern, der ein stark dehydriertes Zytoplasma ist. Der Kern ist dadurch definiert, dass absolut kein Stoffwechsel innerhalb der Zelle stattfindet. Die Mutterzelle lysiert und setzt die reife Spore frei. Diese reife Spore ist resistent gegen hohe Temperaturen, Chemikalien und viele Arten von Strahlung, so dass sie eine außergewöhnliche Anzahl von Jahren überleben kann. Bei anderen Umwelteinflüssen, wie einer anoxischen Umgebung, keimt die Zelle und beginnt den vegetativen Zyklus erneut (10).
Die Sporenbildung beginnt, wenn die Zelle ungünstigen Bedingungen ausgesetzt ist. Aerobe Bedingungen, Bildung organischer Nebenprodukte und Dissipation des Protonengradienten außerhalb der Zytoplasmamembran führen alle zur Sporulation. Dies steht im Gegensatz zum Modellorganismus der Endosporenbildung, Bacillus subtilis, der Endosporen hauptsächlich aufgrund von Nährstoffeinschränkungen bildet (10).
Ökologie
Während der Typ Stamm von C. acetobutylicum wurde aus dem Boden isoliert, C. acetobutylicum ist ubiquitär. Es wurde in “Seesediment, Brunnenwasser und Muscheldarm” gefunden (1). Darüber hinaus wurde es in einer Reihe verschiedener Kotproben aufgezeichnet, darunter Kot von Menschen, Rindern und Hunden (1). Eine Literaturrecherche zeigt, dass pathogene oder symbiotische Beziehungen nicht dokumentiert sind.
Pathologie
C. acetobutylicum ist sowohl für Pflanzen als auch für Tiere völlig gutartig, jedoch sind viele andere Arten der Gattung Clostridium bekannte Krankheitserreger, darunter: Clostridium difficile, Clostridium botulinum, Clostridium tetani und Clostridium perfringen. Insbesondere C. botulinum und C. tetani produzieren einige der tödlichsten bekannten Neurotoxine (11).
C. acetobutylicum wurde im menschlichen Dickdarm gefunden, es ist jedoch nicht bekannt, dass es Teil der normalen menschlichen Flora ist (3). Da der Organismus für Säugetiere durch die Produktion intrazellulärer oder extrazellulärer Substanzen nicht toxisch zu sein scheint, müsste der Organismus in enormen Mengen vorhanden sein, um eine Bedrohung zu erzeugen (12).
Das einzige Problem der Pathologie mit C. acetobutylicum ist der Erwerb von Genen aus pathogenen Clostridien wie C. tetani oder C. botulinum. Während es keine Fälle gibt, in denen C. acetobutylicum diese Gene erworben hat, gab es in der Literatur Vorfälle, in denen andere Clostridium-Arten Säuglingsbotulismus mit Toxinen verursacht haben, die denen in C. botulinum sehr ähnlich sind. Die Ähnlichkeit der Toxine legt nahe, dass der normalerweise nicht-toxigene Clostridium-Stamm Toxin-kodierende Gene von C. botulinum erworben hat, die wahrscheinlich auf einem Plasmid vorhanden sind (13).
Anwendung in der Biotechnologie
Clostridium acetobutylicum hat im 20.Jahrhundert eine wichtige Rolle in der Biotechnologie gespielt. Ursprünglich wurde Aceton zur Herstellung von synthetischem Kautschuk benötigt. Chaim Weizmann wurde eingestellt, um an der Manchester University an dem Problem zu arbeiten, und die Fermentation wurde zu einem attraktiven Weg, um das für den Prozess notwendige Aceton zu erwerben. Zwischen 1912 und 1914 isolierte Weizmann eine Reihe von Stämmen. Die beste Sorte wurde später als Clostridium acetobutylicum bekannt. Die von Weizmann entwickelte ABE-Methode bot den Vorteil einer Effizienzsteigerung gegenüber anderen Fermentationsprozessen. Darüber hinaus konnte Maisstärke als Substrat verwendet werden, während andere Verfahren die Verwendung von Kartoffeln erforderten (3).
Der Ausbruch des Ersten Weltkriegs 1914 führte zu einem enormen Anstieg des Acetonbedarfs. Es würde sich als Dreh- und Angelpunkt in der Entwicklung des ABE-Prozesses unter Verwendung des Weizmann-Organismus erweisen. Das Aceton sollte zur Herstellung von rauchlosem Schießpulver, bekannt als Cordit, verwendet werden. Im Laufe der nächsten Jahre würde Weizmanns Verfahren in einer Reihe von großen Industriefabriken in ganz Großbritannien eingesetzt werden. Als Großbritannien während des Krieges vom Zugang zu Getreide abgeschnitten war, wurde der Prozess in Fabriken in Kanada verlagert. Als die Vereinigten Staaten 1917 in den Krieg eintraten, eröffneten sie auch eine Reihe von Fabriken nach der Weizmann-Methode. Nach Kriegsende sank der Bedarf an Aceton abrupt. In Fabriken wurde jedoch immer noch Butanol hergestellt, ein nützliches Lösungsmittel für die Herstellung von Lacken für die expandierende Automobilindustrie. Bisher war Butanol ein Abfallprodukt des Prozesses, wenn der Fokus auf der Herstellung von Aceton lag. In den späten 1920er Jahren stieg die Nachfrage nach Butanol aufgrund der wachsenden Automobilindustrie weiter an und es wurden eine Reihe neuer Anlagen mit enormer Produktionskapazität eröffnet. Zwei solcher Anlagen geben jeden Tag 100 Tonnen Aceton aus. Neben Butanol wurde industrielles Ethanol für verschiedene Zwecke hergestellt. Das dabei abgegebene Wasserstoffgas wurde zur Hydrierung von Ölen für Lebensmittel verwendet. Um diese Zeit wurde Melasse zum führenden Substrat für die ABE-Fermentation. Es war billiger und effizienter als Maisstärke. Als das Patent auf den Weizmann-Stamm 1937 auslief,wurden weitere neue Pflanzen im ganzen Land sowie international eröffnet (3).
In den späten 1950er und 1960er Jahren begann die Erdölindustrie jedoch mit einer unglaublichen Geschwindigkeit zu klettern. Darüber hinaus begann der Preis für Melasse, die in der Fermentation verwendet wurde, steil zu steigen. Während effizientere Fermentationsmethoden entwickelt wurden, konnten sie letztendlich nicht mit der petrochemischen Produktion der industriellen Lösungsmittel konkurrieren, und die meisten Anlagen wurden bis 1957 stillgelegt(3). Mit dem anhaltenden Anstieg der Erdölpreise gab es jedoch zahlreiche Studien, um die Fermentation als Quelle für industrielle Lösungsmittel zu überdenken. Einige dieser Verfahren haben versucht, die Effizienz des Prozesses durch genetische Manipulation zu erhöhen (14). Andere haben die Verwendung von Abfallprodukten wie Molke oder Holzspänen als Substrat untersucht (15).
Aktuelle Forschung
C. acetobutylicum stand im Mittelpunkt der Forschung als spezifischer Mechanismus zur Abgabe therapeutischer Arzneimittel an Krebsregionen des Körpers. C. Acetobutylicum ist notwendigerweise anaerob und daher führt die intravenöse Injektion von Sporen nur in hypoxischen Regionen solider Tumoren im Körper zur Keimung. Die genetische Manipulation von C. acetobutylicum zur Herstellung von Enzymen, die Pro-Medikamente in der Tumorregion aktivieren, bietet einen äußerst spezifischen Verabreichungsmechanismus an diese Tumorstellen (16).
Einige der neuesten Forschungen haben alternative Methoden zur Herstellung der industriellen Lösungsmittel untersucht, für deren Herstellung C. acetobutylicum im letzten Jahrhundert verwendet wurde. Insbesondere Butanol hat als mögliche alternative Kraftstoffquelle für Automobile besondere Aufmerksamkeit erhalten. Butanol und Ethanol, beide Fermentationsprodukte von C. acetobutylicum, wurden intensiv untersucht. Von den beiden hat Butanol Vorteile gegenüber Ethanol als Kraftstoffquelle sowie viele mögliche Vorteile gegenüber aktuellen Kraftstoffquellen, da es geringere Emissionen und eine höhere Effizienz bieten kann. Der wichtigste Faktor für die Kosten der Butanolproduktion sind die Kosten und die Verfügbarkeit des Substrats. Studien wurden daher auf neuartige Methoden zur Verwendung billiger Substrate ausgerichtet. In einer Studie aus dem Jahr 2006 wurde die Butanolfermentation durch ein neues patentiertes Verfahren als Ersatz für das ABE-Verfahren vorgeschlagen. Es beinhaltet die Verwendung von Maisfasern (speziell Xylem) als Substrat für C. acetobutylicum, um billiges Butanol herzustellen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Maisfasern in vielen landwirtschaftlichen Prozessen ein Nebenprodukt sind und eine reichliche Substratquelle darstellen (17).
Eine weitere intensive Forschungsquelle für C. acetobutylicum ist die Wasserstoffgasproduktion als alternative Energiequelle. Wasserstoffgas enthält eine große Menge an Energie, die ein äußerst vorteilhaftes alternatives Benzin sein könnte. Insbesondere erzeugt die Verwendung von Wasserstoffgas kein Kohlendioxid oder Treibhausgase. Das meiste Wasserstoffgas wird derzeit aus nicht erneuerbaren Quellen hergestellt; Ein alternatives Produktionsmittel durch Fermentation wäre äußerst wertvoll, wenn die Ausbeuten enorm gesteigert werden könnten. Daher werden in der jüngsten Forschung mit C. acetobutylicum eine Reihe verschiedener Fermentationsmethoden untersucht, mit denen die Erträge verbessert werden könnten. Insbesondere ein Rieselbettreaktor, der Glucose als Substrat verwendet, wurde als Möglichkeit vorgestellt, obwohl die Ausbeuten zu niedrig sind, um industriell verwendet zu werden. Eine Art Anwendung eines Rieselbettes wird jedoch als ein mögliches Produktionsmittel in der Zukunft angesehen (18).
Taxonomie: NCBI
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Herausgegeben von Mark Hower, Schüler von Rachel Larsen und Kit Pogliano
