Clothianidin-Saatgutbehandlung hat keine nachweisbaren negativen Auswirkungen auf Honigbienenkolonien und ihre Krankheitserreger

Studiendesign

Im Jahr 2013 wurden insgesamt 16 Felder (8,9 ± 5,4 ha; Mittelwert ± s.d.) in Südschweden für im Frühjahr ausgesäten Raps (Brassica napus L.) wurden nach geografischer Nähe (aber getrennt durch > 4 km) und Landnutzung (Abb. 1, siehe oben). Die umliegende Landschaft wurde auf das Fehlen blühender Pflanzen untersucht. Im Jahr 2013 blieben jedoch zwei Felder in der Studie, obwohl ein anderes Rapsfeld in der Nähe vorhanden war, um so viele Bauernhofpaare wie möglich zu halten34. In jedem Farmpaar wurde ein Feld zufällig mit Clothianidin-behandelten Rapssamen ausgesät, während das andere Feld mit Samen gesät wurde, die nicht mit Clothianidin behandelt wurden (behandelt: 8; Kontrolle: 8). Die gleichen gepaarten Farmen wurden 2014 verwendet, jedoch mit umgekehrten Behandlungen, dh Standorte mit behandelten Feldern im Jahr 2013 hatten Kontrollfelder im Jahr 2014 und umgekehrt (behandelt: 6; Kontrolle: 4). Aufgrund der Fruchtfolge wurden in den Jahren 2013 und 2014 in jedem Betrieb unterschiedliche Felder genutzt (Abb. 1, siehe oben). Um Fig. 1 haben wir eine Karte aus der World Borders Database heruntergeladen (hier herunterladbar: http://thematicmapping.org/downloads/world_borders.php).

Informationen zu den Umgebungsvariablen der Landschaft für die verschiedenen landwirtschaftlichen Betriebe im Jahr 2014 sind in der ergänzenden Tabelle 7 dargestellt. Im Jahr 2014 hatte die Hälfte der Fokusfelder zusätzlichen frühjahrssäten Raps (1-13 ha) im Umkreis von 2 km. Die mit Clothianidin behandelten Samen für die Fokusfelder wurden mit Elado beschichtet, einer markenrechtlich geschützten Mischung aus zwei Wirkstoffen: clothianidin (400 g l-1) und β−Cyfluthrin (+80 g l-1), die für diese Studie ausgewählt wurden, weil es in Schweden und in anderen Teilen Europas das vorherrschende Saatgut-Insektizid bei Raps War63. Clothianidin wird von der Pflanze aufgenommen und zum Schutz vor Insekten systemisch auf alle ihre Teile verteilt64. β-Cyfluthrin gilt nicht als systemisch, und in den in dieser Studie entnommenen Proben wurden keine Rückstände nachgewiesen34. Sowohl Clothianidin-behandeltes Saatgut als auch Kontrollsaatgut wurden 2013 mit dem Fungizid Thiram beschichtet.

Die teilnehmenden Landwirte wurden angewiesen, während der Studie keine anderen Neonicotinoide auf den Feldern zu verwenden, obwohl andere Insektizide Blattsprays; hauptsächlich Plenum (Pymetrozin), Avaunt / Steward (Indoxacarb) und Mavrik (Tau-Fluvalinate; auch als Varroazid in der Bienenzucht verwendet) wurden zur Schädlingsbekämpfung verwendet (Ergänzende Tabelle 8). Biscaya, Handelsname für eine Sprühformulierung, die das Neonicotinoid Thiacloprid enthält, wurde jedoch 2013 auf ein Kontrollfeld aufgetragen, gefolgt von einem Mavrik−Spray 1 Woche später, und 2014 auf ein behandeltes Feld, beide Male bei 0,3 L ha-1. Thiacloprid hat eine deutlich geringere akute Toxizität für Bienen als Clothianidin65 und nur Spuren von Thiacloprid wurden in den Pollen-, Nektar- und Bienenproben im Jahr 2013 und keine im Jahr 2014 nachgewiesen. Während Rundlöf et al.34 beobachteten keine Änderung der Ergebnisse Als Felder, auf denen Biscaya angewendet wurde, von den Analysen ausgeschlossen wurden, stellten wir einige qualitative Änderungen fest (ergänzende Tabelle 9). Diese Veränderungen könnten auf die im Jahr 2014 festgestellten höheren Thiacloprid-Rückstände zurückzuführen sein, aber ebenso gut nicht auf Biscaya, sondern auf den Unterschied zwischen den verwendeten Biscaya /Mavrik- und den alternativen Insektizidspray-Kombinationen34 oder auf eine verringerte statistische Aussagekraft.

Honigbienenkolonien

Einhundertsechzehn Honigbienenkolonien wurden Ende Mai 2013 von einem professionellen Imker in einzelnen Langstroth-Bienenstöcken in voller Größe vorbereitet, die zwei Kämme mit hauptsächlich versiegelter Brut (mit Bienen), zwei volle Waben (mit Bienen), einen herausgezogenen leeren Kamm, fünf Kämme mit Wachsfundament, Bienen, die von zwei Kämmen geschüttelt wurden, und entweder einen 1-jährigen (84 Versuchskolonien) oder einen 2-jährigen (mit 12 Versuchskolonien plus 20 Reservekolonien) Königin bekannter Abstammung, die relativ kleine, gleich große (3418 ± 123 erwachsene Bienen; Mittelwert ± s.e.m.; n = 96 Kolonien) Kolonien mit viel Raum für Wachstum, die stark genug werden könnten, um den kommenden Winter zu überstehen, aber im Sommer nicht aus ihrem Raum herauswachsen. In jedem der 16 Rapsfelder (insgesamt 96 Kolonien) wurden zwischen dem 14. und 28.Juni 2013 zu Beginn der Rapsblüte sechs Versuchskolonien am Feldrand platziert (Ergänzende Abb. 1). Königin Abstammung und Alter wurde zwischen Farm-Paare abgestimmt, aber Kolonien wurden sonst zufällig verteilt. Die Kolonien wurden auf einem 60 ha großen, biologisch bewirtschafteten Winterrapsfeld in voller Blüte gehalten, bevor sie auf den 16 Versuchsfeldern platziert wurden (Ergänzende Abb. 1) um sicherzustellen, dass das Koloniewachstum vor dem Experiment so weit wie möglich auf pestizidfreier Futtersuche beruhte.

Als die Rapsblüte im Versuchsfeld aufgehört hatte, wurden die Kolonien zwischen dem 2. und 31. 1) zu einem gemeinsamen Bienenhaus zum Überwintern. Am 10. August erhielten die Kolonien eine Ameisensäure-Dampfbehandlung gegen Varroamilben, die aus 20 ml 60% iger Ameisensäure bestand, die in einen flachen Haushaltsschwamm eingeweicht wurde, der unter die innere Abdeckung auf der Oberseite der Rahmen gelegt wurde. Die Kolonien erhielten insgesamt 20 kg Zucker pro Kolonie in Form einer 55-60% igen v / v–Saccharoselösung, die im August und September 2013 dreimal in einer Fütterungsbox bereitgestellt wurde. Eine zusätzliche leichte Varroabehandlung wurde am 4. Dezember durchgeführt, indem 30 ml 2,6% Oxalsäure in 60% Saccharose zwischen den Rahmen direkt auf den Bienenstock gestreut wurden. Im Frühjahr 2014 wurden die Kolonien in ein biologisch bewirtschaftetes Rapsfeld verlegt, bevor sie auf die 10 im Frühjahr ausgesäten Rapsfelder gebracht wurden (Ergänzende Abb. 1). Kolonien wurden für die Aufnahme in den 2014-Teil der Studie in Betracht gezogen, wenn sie im April 2014 eine 2-jährige Eiablagekönigin hatten (ausgenommen Kolonien, die im April 2014 gestorben, wieder gekrönt oder 3-jährige Königinnen hatten) und hatte bis Anfang Juni 2014 nicht geschwärmt. Diese Einschränkungen, zusätzlich zu der Anforderung, dass Kolonien Clothianidin für beide Jahre des Experiments ausgesetzt / nicht exponiert sein würden, bedeuteten, dass im Jahr 2014 nur vier Kolonien jedem Feld zugeordnet werden konnten. Kolonien, die 2013 von behandelten Feldern platziert wurden, wurden 2014 erneut von behandelten Feldern platziert, um die kumulativen Auswirkungen einer mehrjährigen Clothianidin-Exposition zu bewerten, wurden jedoch vor der Platzierung erneut randomisiert, um unbeabsichtigte Verzerrungen zu minimieren. Trotzdem mussten 2014 zwei Kontrollkolonien aus dem Jahr 2013 von einem mit Clothianidin behandelten Feld platziert werden, da die exponierten Kolonien für die sechs mit Clothianidin behandelten Felder nicht ausreichend qualifiziert waren. Für die vier Kontrollfelder standen genügend Kolonien zur Verfügung. Die Stärke der Kolonien wurde wie für 2013 beschrieben ausgeglichen, jedoch nur innerhalb jeder Behandlungsgruppe. Die Kolonien wurden reduziert und ein zweites Mal ausgeglichen (8. Juni 2014), nachdem einige von ihnen zu groß geworden waren und versuchten zu schwärmen (Ergänzende Abb. 1). Jede reduzierte Kolonie enthielt 1 vollen Honigkamm (mit Bienen), 3 Kämme mit hauptsächlich versiegelter Brut (mit Bienen) und die ursprüngliche Königin von 2013 sowie 6 Kämme mit Wachsfundament. Die Kolonien wurden zwischen dem 16. und 25.Juni 2014 auf die Frühjahrsrapsfelder verbracht und zwischen dem 14. und 22.Juli 2014 wieder an den gemeinsamen Überwinterungsplatz gebracht (Ergänzende Abb. 1).

Rückstandsanalysen

Um die Clothianidin-Exposition zu bestätigen, wurden 24 erwachsene Honigbienen pro Feld, die am Bienenstockeingang gefangen wurden, Pollenpellets von 5 Honigbienen, die auf den Rapsfeldern Futter suchten, und Nektar, der aus den Mägen von 5 Nektar-Honigbienen auf den Rapsfeldern entnommen wurde, von jedem Standort auf Clothianidin-Rückstände analysiert. Pollen (> 25 ml) wurden mit Pollenfallen gesammelt, die für 1 Tag an drei Kolonien pro Standort installiert und auf die Herkunft der Pflanzenarten analysiert wurden. Die Proben wurden wie in Rundlöf et al.34 und während der Spitzenblütenbewertungen in beiden Jahren gesammelt (Ergänzende Abb. 1), wobei die Konzentrationen von Clothianidin und vier weiteren in Schweden verwendeten Neonikotinoiden (ergänzende Tabelle 2) mittels Flüssigkeitschromatographie in Verbindung mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS / MS) quantifiziert wurden und Pollen mittels Lichtmikroskopie und einer Pollenreferenzbibliothek nach Rapsart identifiziert wurden (siehe ergänzende Tabelle 2 für Nachweis- und Quantifizierungsgrenzen). Für weitere Analysen der Variation der Neonicotinoid-Exposition von Honigbienen an verschiedenen Standorten, Wir sammelten 12 Honigbienen pro Standort vom Bienenstockeingang. Diese Probenahme wurde 2013 an drei mit Clothianidin behandelten Standorten durchgeführt. Nektar wurde aus dem Honigmagen der gesammelten Bienen gewonnen. Die Konzentrationen von Clothianidin wurden danach sowohl im Nektar als auch im Bienengewebe für jedes Bienenindividuum quantifiziert. Weitere Details zur Probenbehandlung für verschiedene Matrizen, LC-MS / MS-Methode und Qualitätskontrollen finden Sie in Ergänzende Methoden.

Kolonieentwicklung, Re-Queening und Honigproduktion

Die Entwicklung des Honigbienenkolonies wurde von demselben ausgebildeten Beobachter und einem Assistenten beurteilt. Die Anwesenheit einer Legekönigin wurde ebenso festgestellt wie die Anwesenheit von Königinzellen. Wenn ein Re-Queening-Ereignis mit einem großen Verlust an erwachsenen Bienen einherging, wurde davon ausgegangen, dass es geschwärmt hat. Wenn kein Verlust von erwachsenen Bienen beobachtet wurde, wurde die Kolonie als durch supersedure wieder queened. Die Honigproduktion und -entwicklung der Kolonien wurde durch Wiegen der Kolonien und durch Bewertung der Koloniestärke nach der Liebefeld-methode66 bestimmt, da die Gesamtzahl der erwachsenen Bienen und die Fläche der Deckbrut über alle Rahmen verteilt waren. Die Anzahl der erwachsenen Bienen wurde geschätzt, indem Honigbienen auf beiden Seiten der 10 Rahmen gezählt wurden. Die Anzahl der gekappten Brutzellen (Brutmenge) wurde durch Multiplikation des Anteils der geschlossenen Brutabdeckung mit 2700 bestimmt, was der Anzahl der Zellen auf einer Seite der verwendeten Rahmen entspricht. Die Kolonien wurden vor und nach der Exposition gewogen (unter Verwendung einer Mettler Toledo-Tischwaage, die bis zu 32 kg mit einer Genauigkeit von 1 g wiegen kann), um die Honigproduktion abzuschätzen. Volle Honigrahmen wurden während der Rapsblüte durch leere Rahmen ersetzt, damit die Kolonie wachsen und das Schwärmen reduzieren konnte. Sowohl der volle als auch der leere Rahmen wurden gewogen, um in die Berechnung der Honigproduktion einbezogen zu werden. Während der Bewertung nach der Exposition wurden so viele Honigrahmen wie möglich entfernt (maximal 10% der mit bedeckter Brut bedeckten Fläche), um die Honigernte des Imkers zu simulieren. Am 6. und 17. Juni 2013 und am 9. und 11. Juni 2014 wurden Präexpositionsbewertungen auf dem biologisch bewirtschafteten Winterrapsfeld durchgeführt, am 29. Juli bis 9. August 2013 und am 28. und 31. Juli 2014 Postexpositionsbewertungen im gemeinsamen Überwinterungsbienenhaus (Ergänzende Abb. 1). Darüber hinaus wurde im April 2014 eine Frühjahrskoloniefestigkeitsbewertung durchgeführt, bei der die Gesamtzahl der erwachsenen Bienen und die Anzahl der Deckbrut geschätzt wurden (Ergänzende Abb. 1). Die Kolonie Assessor und Assistenten wurden während der Datenerhebung in Bezug auf das Behandlungsschema der Felder geblendet.

Entnahme und Verarbeitung von Pathogen- und Parasitenproben

Aus jeder Kolonie wurden Proben von rund 100 adulten Honigbienen während Vor- und Nachexpositionsuntersuchungen in den mit Clothianidin behandelten und kontrollierten experimentellen Rapsfeldern in den Jahren 2013 und 2014 entnommen (Ergänzende Abb. 1). Bienen wurden aus dem äußeren Kamm jeder Kolonie entnommen und bestanden daher aus einer Mischung von Hausbienen und Futterbienen67. Alle Bienenproben wurden bis zur Durchführung der Laborarbeit bei -20 °C gelagert. Das V. die Destruktorbefallsraten für jede Kolonie wurden bestimmt, indem die erwachsenen Bienenproben mit Seifenwasser gewaschen wurden, um die Mites zu entfernen und zu zählen68. Die Bäuche von 60 erwachsenen Honigbienen pro Kolonie (für individuelle Kolonieanalysen) oder pro Bienenhaus (für die gepoolten Kolonieanalysen 2013, 10 Bienen pro Kolonie) wurden entfernt und in einen Polyethylenbeutel mit einem inneren Netz (BioReba) gegeben. Die Bauchmuskeln wurden im Beutel mit einem Stößel gemahlen und 30 ml nukleasefreies (Milli-Q) Wasser (0,5 ml pro Biene) wurden gründlich mit der Probe vermischt, um eine homogene Suspension zu erhalten. Mehrere 1 ml Aliquots dieser Suspension wurden entnommen und sofort bei -80°C zur DNA- und RNA-Extraktion und als zukünftiges Referenzmaterial eingefroren.

Parasiten, Pathogene, symbiotische Mikroben und Immungene

Die gesammelten Bienenproben wurden auf eine Vielzahl von pathogenen und nicht pathogenen Parasiten und Mikroben untersucht, um die Auswirkungen der Platzierung von Kolonien auf Clothianidin-behandelten Feldern auf ihre Prävalenz und Häufigkeit zu untersuchen. Zu den Organismen gehörten der allgegenwärtige Ektoparasit Varroa Destructor, 13 Viren: akute biene lähmung virus (ABPV), blattlaus tödliche lähmung virus (ALPV), Big Sioux River virus (BSRV), schwarz königin zelle virus (BQCV), chronische biene lähmung virus (CBPV), verformt flügel virus typ-A (DWV-A), verformt flügel virus typ-B (DWV-B), Israelische akute lähmung virus (IAPV), Kaschmir bee virus (KBV), See Sinai virus stamm 1 (LSV-1) und stamm 2 (LSV-2), Sacbrood virus (SBV ), slow Bee paralysis Virus (SBPV); zwei häufige Honigbienen-Mikrosporidian-Darmparasiten (Nosema apis und Nosema ceranae) und zwei symbiotische Darmbakterien (Gammaproteobacterium: Gilliamella apicola und Betaproteobacterium: Snodgrassella alvi). Für die Proben 2013 analysierten wir auch auf Bienenstandsebene die mRNA-Spiegel von acht Honigbienengenen (Amel / LRR, Apidaecin, cSP33, Dorsal-1A, Eater-like, NimC2, PGRP-S2 und SPH51), deren Expression zuvor mit Pestizid-, Pathogen- und / oder Parasitenexposition in Verbindung gebracht wurde19,44 und (soziale) Immunität in Honigbienen45.

Nukleinsäureextraktion

DNA wurde aus den Bienen-Homogenaten unter Verwendung des Protokolls zur Extraktion von DNA aus Nosema-Sporen69 extrahiert, das ausreichend robust ist, um auch DNA aus Bakterien und anderen Mikroorganismen zu extrahieren. Insgesamt wurden 500 µl primäres Bienenhomogenat für 5 min in einer Mikrofuge bei 13.000 upm zentrifugiert. Das Pellet wurde wiederholt mit flüssigem Stickstoff eingefroren-aufgetaut und mit einem sterilen Teflon-Mikropistille pulverisiert. Das pulverisierte Pellet wurde in 400 µl Qiagen Plant tissues DNeasy AP1 Lysepuffer enthaltend 4 µl RNase-A (10 mg ml−1) resuspendiert und 10 min bei 65 oC inkubiert und geschüttelt, wonach 130 µl P3 Neutralisationspuffer (3,0 M Kaliumacetat pH 5.5) wurde zugegeben, gefolgt von 5 min Inkubation auf Eis und Zentrifugation für 5 min bei 14.000 U / min, um die Lysetrümmer zu entfernen. Die DNA wurde aus 500 µl des Überstands mit dem automatisierten Qiacube-Extraktionsroboter von Qiagen nach dem plant DNeasy-Protokoll gereinigt und die DNA in 100 µl nukleasefreies Wasser eluiert. RNA wurde mit dem Qiacube-Roboter direkt aus 100 µl primärem Honigbienenhomogenat unter Verwendung des Qiagen Plant RNeasy-Protokolls (einschließlich des Qia-Shredders für zusätzliche Homogenisierung70) extrahiert und die RNA in 50 µl nukleasefreies Wasser eluiert. Die ungefähre Nukleinsäurekonzentration wurde durch NanoDrop bestimmt, wonach die Proben mit nukleasefreiem Wasser auf ein einheitliches 10 ng µl-1 (DNA und LSV−1(RNA)) oder 20 ng µl-1 (für alle anderen RNA−Proben) verdünnt und bei -80°C gelagert wurden.

RT-qPCR und qPCR

Die verschiedenen Mikroorganismen und Wirts-mRNA-Targets wurden entweder durch einstufige reverse Transkription-quantitative PCR (RT-qPCR) für Pathogene mit einem RNA-Genom und den Immun- und internen Referenzgen-mRNA-Targets oder durch quantitative PCR (qPCR) für Organismen mit einem DNA-Genom. Einzelheiten zu den Assays sind in der Ergänzungstabelle 10, der Ergänzungstabelle 11 und der Ergänzungstabelle 12 dargestellt. Der Reverse Primer für Amel/LRR wurde von Di Prisco et al.19, da die extrem hohe Komplementarität zwischen den ursprünglichen Vorwärts- und Rückwärtsprimern zu hohen PCR-Artefakten führte, die das quantitative Signal dominierten. Die Reaktionen wurden doppelt durchgeführt, in 20 µl (DNA) oder 10 µl (RNA) Reaktionsvolumina enthaltend 2 µl (DNA) oder 1,5 µl (RNA) Template, 0,4 µM (DNA) oder 0.2 µM (RNA) Vorwärts- und Rückwärts-Primer und entweder der Bio-Rad Eva Green qPCR Mix (DNA) oder der Bio-Rad One-Step iTaq RT-qPCR Mix mit SYBR Green Detection Chemistry (RNA). Die Reaktionen wurden in optischen 96-Well-qPCR-Platten im Bio-Rad CFX connect Thermocycler unter Verwendung der folgenden Amplifikationszyklusprofile inkubiert: 10 min bei 50 ° C für die komplementäre DNA (cDNA) -Synthese (nur RT-qPCR): 5 min bei 95 °C (um die reverse Transkriptase zu inaktivieren und die Taq-Polymerase zu aktivieren), gefolgt von 40 Zyklen von 10 s bei 95 °C zur Denaturierung und 30 s bei 58 °C zum Primer-Annealing, Verlängerung und Datenerfassung. Für DNA-Assays wurden die folgenden Amplifikationszyklusprofile verwendet: 2 min bei 98 ° C für die anfängliche Denaturierung, gefolgt von 40 Zyklen von 5 s bei 98 ° C für die Denaturierung und 10 s bei 60 ° C für das Primer-Annealing, die Verlängerung und die Datenerfassung. Auf die Amplifikationszyklen folgte eine Schmelzkurvenanalyse, um die Spezifität der Amplifikation zu bestimmen, indem die Fluoreszenz bei 0,5 ° C-Schritten von 65 ° C bis 95 ° C abgelesen wurde. Für jeden Assay-Typ (ergänzende Tabelle 10, ergänzende Tabelle 11 und ergänzende Tabelle 12) wurde eine Kalibrierkurve durch eine 10-fache Verdünnungsreihe einer Positivkontrolle bekannter Konzentration über 6 Größenordnungen zur quantitativen Datenumrechnung erstellt, wobei das Referenz-Schmelzkurvenprofil des Amplikons festgelegt und die Reaktionsleistungsstatistik geschätzt wurde.

Datenkonvertierung und Normalisierung

Die Schmelzkurven einzelner Reaktionen wurden visuell ausgewertet, um unspezifische Amplifikationen, die sich in Schmelztemperaturprofilen von echten Ziel-cDNA/DNA-Amplikons unterscheiden, abzutrennen. Unspezifische Amplifikationen wurden aus dem Datensatz gelöscht. Alle Assays wurden doppelt durchgeführt, wobei der Mittelwert dieser beiden Duplikate in weiteren Berechnungen verwendet wurde. Beide Duplikate mussten einen positiven quantitativen Wert ergeben und die Schmelzkurvenanalyse bestehen, damit die Daten in den Datensatz aufgenommen werden konnten. Die rohen RT-qPCR-Daten aller bestätigten Amplifikationen wurden anschließend unter Verwendung der entsprechenden Kalibrierungskurve für den Assay in geschätzte Kopienzahlen jeder Ziel-RNA umgewandelt. Diese Daten wurden während des gesamten Verfahrens mit den verschiedenen Verdünnungsfaktoren multipliziert, um die geschätzten Kopien jedes Ziels pro bee69 zu berechnen. Da RNA leicht abgebaut wird, besteht die Gefahr, dass Unterschiede zwischen den einzelnen Proben in der RNA-Qualität (d. h. Abbau) die Ergebnisse beeinflussen70. Um dies zu korrigieren, wurden an allen Proben RT-qPCR-Assays für die mRNA eines gemeinsamen Honigbienen-internen Referenzgens (RP49) durchgeführt. Die Daten für die interessierenden RNA-Targets wurden dann auf den Durchschnittswert für RP49-mRNA normalisiert, wodurch die Daten für probenspezifische Unterschiede in der RNA-Qualität in Bezug auf die RT-qPCR-Leistung korrigiert wurden70.

Statistische Analysen

Die Anteile der von Honigbienen gesammelten Pollen, die von Rapspflanzen stammten, wurden zwischen den Behandlungen (Clothianidin-Samenbehandlung / unbehandelt) unter Verwendung eines verallgemeinerten linearen Modells unter der Annahme einer binominalen Verteilung und Korrektur einer Überdispersion verglichen. Die Clothianidin-Konzentrationen in Nektar und Pollen, die von Honigbienen gesammelt wurden, und in Bienengewebe wurden zwischen den Behandlungen mit Wilcoxon–Mann–Whitney-Tests verglichen. Um die Konzentrationen von Clothianidin im Bienengewebe und Nektar in einzelnen Bienen zwischen Feldern zu vergleichen, verwendeten wir Varianzanalysen (ANOVA) mit Feldidentität als Prädiktor. Darüber hinaus wurden die Konzentrationen von Clothianidin im Gewebe und der Nektarmagengehalt einzelner Bienen mittels einer multiplen linearen Regression mit der Feldidentität und der Konzentration von Clothianidin im Nektar als erklärende Variablen und der Konzentration von Clothianidin im Bienengewebe als Antwortvariable in Beziehung gesetzt.

Die Studie folgte im Allgemeinen einem BACI-Design (Before-After-Control-Impact) mit einer gepaarten Feldstruktur, die für zwei aufeinanderfolgende Jahre auf Kolonieebene wiederholt wurde, um Daten zur Kolonieentwicklung sowie zur Prävalenz und Häufigkeit von Parasiten, Krankheitserregern und Darmbakterien zu erhalten. Die Jahre 2013 und 2014 wurden zusammen in einem vollständigen Modell analysiert, wobei Saatgutbehandlung, Blüte, Jahr und ihre Wechselwirkungen feste Faktoren waren. Die Wirkung der Clothianidin-Behandlung wurde anhand der Wechselwirkung zwischen Blüte und Saatgutbehandlung beurteilt, da dieser Begriff den Unterschied in der Veränderung zwischen den Behandlungen gegenüber den Rapsblüten widerspiegelt. Wenn die Drei-Wege-Interaktion (Blüte × Samenbehandlung × Jahr) signifikant war (d. H. Wenn die Variable von Jahr zu Jahr unterschiedlich auf die Clothianidin-Behandlung ansprach), wurde der Datensatz nach Jahr aufgeteilt und das Jahr wurde als fester Faktor fallen gelassen. Darüber hinaus wurde der Datensatz nur für 1 Jahr analysiert, wenn die Daten aus einer Stichprobengröße ≤10 in einem Jahr sowohl für die Mikrobiota-Prävalenz als auch für die Häufigkeit bestanden (ergänzende Tabelle 1). Kolonien, die schwärmten (8 auf Kontrollfeldern und 10 auf Clothianidin-behandelten Feldern im Jahr 2013; eine auf einem Kontrollfeld und zwei auf Clothianidin-behandelten Feldern im Jahr 2014), wurden von der Analyse ausgeschlossen, da das Schwärmen einen großen Einfluss auf die Kolonieentwicklung hat. Ausgeschlossen ist auch die einzelne Kolonie, die ihre Königin während des Transports vor der Feldplatzierung im Jahr 2013 verloren hat (behandeltes Feld). Der Ausschluss von Kolonien, die von der Analyse schwärmten, veränderte einige Ergebnisse qualitativ (siehe ergänzende Tabelle 13). Änderungen des Signifikanzniveaus können auf eine verringerte statistische Aussagekraft, Zufall oder biologische Effekte zurückzuführen sein.

Lineare Mixed-Effects-Modelle (LMM) wurden verwendet, um die Wirkung der Clothianidin-Behandlung auf die Kolonieentwicklung zu testen, gemessen als Anzahl der gekappten Brutzellen (Brut) und die Anzahl der erwachsenen Bienen. Saatgutbehandlung (Clothianidin oder Kontrolle), Blüte (vor oder nach der Rapsblüte), Jahr (2013 oder 2014) und deren Wechselwirkungen waren feste Faktoren. Farmpaaridentität, Farmidentität und Kolonieidentität wurden als Zufallsfaktoren einbezogen. Die Honigproduktion wurde zwischen Behandlungen unter Verwendung eines LMM mit Farmpaaridentität und Farmidentität als Zufallsfaktoren verglichen. Generalisierte lineare Mischmodelle (GLMMs) wurden verwendet, um den Einfluss der Clothianidin-Behandlung auf das Re-Queening und die Mortalität der Kolonien mit Farmidentität als Zufallsfaktor zu testen.

Der Einfluss der Clothianidin-Behandlung auf die Frühjahrskolonieentwicklung, gemessen als Anzahl der erwachsenen Bienen und Brutmenge, wurde mit einem LMM bzw. einem GLMM mit Samenbehandlung als festem Faktor und Farmpaaridentität und Farmidentität als Zufallsfaktoren getestet. Für die Anzahl der gekappten Brutzellen verwendeten wir eine negative binomiale Fehlerverteilung und eine logarithmische Verknüpfungsfunktion.

Die Mikrobiom- und Varroamilbendaten wurden sowohl auf ihren binomialen (An- / Abwesenheit) als auch quantitativen (Häufigkeit) Charakter analysiert, wobei GLMMs (mit binomialen Fehlerverteilungen und einer Logit-Link-Funktion) bzw. LMMs (mit normalen Fehlerverteilungen) mit Saatgutbehandlung, Blüte, Jahr und deren Wechselwirkungen als feste Faktoren verwendet wurden. GLMMs zur Prävalenz von Mikroorganismen oder Varroamilben umfassten nur die Kolonieidentität als Zufallsfaktor, da die effektive Stichprobengröße (d. H. Das weniger häufige Ergebnis der An- / Abwesenheitsdaten) die Einbeziehung weiterer Zufallsfaktoren nicht zuließ. Nur Organismen und Jahre mit einer (effektiven) Stichprobengröße > 10 wurden sowohl für die Prävalenz- als auch für die Abundanzdaten analysiert. Darüber hinaus wurden Kolonien, die nicht mindestens einmal positiv auf einen bestimmten Mikroorganismus getestet wurden, von der Abundanzanalyse ausgeschlossen. Bienenpathogen und Bakterienhäufigkeit wurden logarithmisch (log10) transformiert, da sie im Allgemeinen exponentiell verteilt sind. LMMs auf Zielorganismus Fülle enthalten Farm Paar Identität, Farm Identität und Kolonie Identität als zufällige Faktoren. Die Anzahl der Varroamilben pro 100 Bienen und das Koloniegewicht wurden quadratwurzeltransformiert, um nicht normal verteilte Residuen zu vermeiden. Konfidenzintervalle wurden basierend auf der Profilwahrscheinlichkeit berechnet. Für die quadratwurzeltransformierten Daten wurden Schätzungen für grafische Darstellungen in den ursprünglichen Maßstab zurücktransformiert.

Die Immun-Gen-Transkripte waren nur für 2013 und auf Bienenstandsebene verfügbar, folgten aber auch dem BACI-Design. LMMs zur Genexpression enthielten Saatgutbehandlung und Blüte als feste Faktoren und Farmidentität als zufällige Faktoren.

Statistische Datenanalysen wurden mit R durchgeführt, mit Ausnahme von Analysen zur Überprüfung der Clothianidin-Exposition und Landnutzung, für die SAS 9.4 für Windows (SAS Institute Inc.) verwendet wurde. LMMs wurden unter Verwendung der lmer-Funktion des lme4-Pakets angepasst und GLMMs wurden unter Verwendung der glmmTMB-Funktion des glmmTMB-Pakets in R angepasst. P-Werte aus LMMs wurden unter Verwendung der Anova-Funktion des Car-Pakets berechnet, wobei Typ-III-F-Tests für Modelle mit Wechselwirkungen und Typ-II-F-Tests für Modelle ohne Wechselwirkungen (d. H. Frühlingsbewertung und Honigproduktion) verwendet wurden. Die Auswirkungen fester Faktoren wurden in allen Modellen mit Ausnahme der Neonikotinoidreste unter Verwendung von Summe-zu-Null-Kontrasten geschätzt. Summe-zu-Null-Kontraste ermöglichen die Bestimmung von Haupteffekten / Wechselwirkungen (d. H. Schätzung unabhängig von anderen unabhängigen Variablen) und zeigen die Auswirkungen von Faktoren als Abweichungen vom großen Mittelwert (Achsenabschnitt). Für Faktoren mit zwei Ebenen ist die Größe der Abweichung jeder Ebene vom großen Mittelwert gleich, aber die Richtung unterscheidet sich. Wir stellen Effekte von Faktoren (Saatgutbehandlung, Blüte, Jahr) als Abweichung der zweiten Ebene (Clothianidin, nach 2014) vom großen Mittelwert dar. Dies war auch bei Wechselwirkungen der Fall, so dass z.B. die Saatgutbehandlung × Blüte-Wechselwirkung anzeigt, inwieweit sich Clothianidin-exponierte Kolonien in der Veränderung über die Rapsblüte von der mittleren Veränderung beider Behandlungen unterschieden.

Leistungsanalyse

Wir führten Leistungsanalysen für die Anzahl der erwachsenen Bienen und die Anzahl der begrenzten Brutzellen und die Honigproduktion durch, um die Effektgröße zu untersuchen, die wir aufgrund unseres Designs, unserer Replikation und unserer Modellauswahl möglicherweise erkennen könnten. Die Leistung wurde für einen Bereich von Effektgrößen bei einem nominalen Konfidenzniveau von α = 0,05 durch 1000 Monte-Carlo-Simulationen pro Effektgröße unter Verwendung der powerSim-Funktion des simr-Pakets bestimmt. Die Leistung wurde für eine Reihe von Effektgrößen berechnet, ausgedrückt als Änderung der Anzahl erwachsener Bienen, Anzahl der begrenzten Brutzellen oder Honigproduktion. Durch Division der Effektgröße mit der mittleren Anzahl der Bienen, der mittleren Anzahl der Brutzellen oder der Honigproduktion aller Kontrollkolonien erhielten wir die Effektgröße ausgedrückt als prozentuale Änderung dieser Matrizen (Ergänzende Abb. 3). Diese Leistungsanalyse ermöglichte es, unsere Effektgröße mit der von Rundlöf et al.34. Unter Verwendung des vollständigen Modells konnten wir eine Effektgröße für die Anzahl der erwachsenen Bienen von unter 5% mit einer Potenz von 80% im Vergleich zu der von Rundlöf et al.34. Dies ist sogar niedriger als die von EFSA32 festgelegten Anforderungen an eine Effektgröße < 7%. Als Ergebnis einer signifikanten Interaktion von Saatgutbehandlung, Blüte und Jahr wurde der Datensatz für die Anzahl der gekappten Brutzellen für jedes Jahr separat analysiert. Daher stellen wir hier die Leistungsanalyse für jedes Jahr vor. Die Effektgröße, bei der 80% erreicht wurde, stieg von unter 10% im Jahr 2013 auf leicht unter 11% im Jahr 2014 (Ergänzende Abb. 3), wahrscheinlich aufgrund der reduzierten Replikation im Jahr 2014. Wir haben auch eine Leistungsanalyse der Honigproduktion (Honigmenge pro Kolonie in kg) unter Verwendung des Datensatzes beider Jahre durchgeführt, die zeigt, dass eine Effektgröße von unter 20% mit einer Leistung von 80% nachgewiesen werden konnte (Ergänzende Abb. 3).

Berichtszusammenfassung

Weitere Informationen zum experimentellen Design finden Sie in der Nature Research Reporting Summary, die mit diesem Artikel verknüpft ist.