Chromium Release Assay: Staré Školy Způsob Testování Cytotoxické T Buňky
Existuje několik metod, které můžete použít, pokud váš T buněk jsou cytotoxické, ale chromium release testu pomocí radioaktivní 51chromium (51Cr) je jedním z nejstarších. Poskytuje dobré výsledky a je skvělý pro laboratoře, které si nemohou dovolit nebo nemají snadno dostupnou průtokovou cytometrii.
zde nastíním jednoduchou metodu pro testování funkce zabíjení T buněk pomocí 51Cr. Než však začnete s testem, nezapomeňte si přečíst správná bezpečnostní opatření při manipulaci s radioaktivními materiály.
Vyberte si cíl a efektory
Chcete-li provést test uvolňování Chromu, nejprve inkubujte své cílové buňky (T) pomocí 51Cr. Poté inkubujete cílové buňky efektorovými buňkami (vaše T buňky; E). Pokud efektorové buňky zabijí cíle, uvolní 51cr, který detekujete pomocí čítače gama.
které cíle a efektory používáte, zcela závisí na vaší aplikaci. Vaše cílové buňky jsou tím, proti čemu testujete funkci T buněk. Možná budete chtít zabít svůj cíl (změřit cytotoxicitu) nebo se můžete podívat, zda jsou T buňky tolerantní (jako testování vyrobených buněk před tím, než půjdou do pacienta kvůli bezpečnosti!). Vaše efektorové T buňky mohou být také odvozeny z různých zdrojů. Můžete například použít vyrobené linie T buněk nebo T buňky čerstvě izolované od zvířete.
Pojďme radioaktivní
jakmile shromáždíte své cíle a efektory, je čas vařit.
- Spočítejte své buňky. Můžete použít hemocytometr nebo automatický čítač buněk. Počet buněk, které potřebujete, závisí na počtu podmínek a počtu replik každé podmínky, kterou provedete. Typicky, provádím své testy ve trojím vyhotovení a mám čtyři poměry (5:1, 10:1, 20:1 a 40: 1 E:T). Alikvotní cílové buňky (v mém případě 500 000 dolarů – asi 25.000 eur) do 15 ml kónické zkumavky, udržováním každé experimentální podmínky, oddělené! Ujistěte se, že pozastavíte buňky v malém objemu, aby měly šanci přijít do kontaktu s chromem.
- přidejte 51cr (přibližně 50 µCi) a inkubujte své cíle chromem po dobu jedné hodiny. Švihněte zkumavky asi každých 20 minut, abyste zvýšili možnosti buněk absorbovat chrom.
- zatímco inkubujete….Tato dlouhá inkubace je skvělý čas na Nastavení efektorových buněk. Umyjte T buňky dvakrát PBS, abyste odstranili přebytečné cytokiny, které by mohly zkreslit vaše výsledky. Poté je znovu promíchejte do příslušného média.
- Jakmile dokončíte mytí, jste připraveni dát efektory na talíř! Obvykle používám 96 dobře deska, protože objemy jsou poměrně malé. Plate efektory v různých poměrech k cílům, abyste určili práh zabíjení. Obvykle provádím test v trojnásobcích, ale záleží na tom, kolik buněk máte k dispozici. Poměry 40, 20, 10 a 5: 1 (efektory k cílům) jsou dobrou šablonou, pokud máte dostatek dostupných buněk.
kromě těchto testů nastavte dvě kontrolní podmínky:
- spontánní uvolnění kontroly obsahující jen cílové buňky (v podstatě negativní kontrolu, protože tam by měl být žádné zabíjení bez efektory) a
- maximální uvolnění kontroly, ve které budete lyse cílových buněk (pozitivní kontrola, která ukazuje maximální množství chromu přijata do buňky).
- zpět k cílovým buňkám … jakmile jsou vaše cílové buňky inkubovány, třikrát je omyjte médiem buněčné kultury, abyste odstranili přebytečný chrom. Pro každé z těchto promývání jemně Roztočte buňky při 400 g po dobu 5 minut. Dekantujte supernatant do nádoby na odpad, kterou lze přenést do bezpečné oblasti rozpadu, místo aby se ji pokusil pipetovat. To pomůže snížit možnou kontaminaci, protože nebudete muset řešit žádné tipy.
- po promytí se buňky promíchají na 5000 buněk na 100?l. Pak přidejte 100?l buněk do každé jamky, dokonce i spontánní a maximální jamky. Inkubujte buňky společně po dobu minimálně 4 hodin při 37°C, přesně jak dlouho závisí na vaší aplikaci.
- o čtyři hodiny později….Vyjměte talíř z inkubátoru. Přidat 100?l 1% roztoku triton-x do vašich buněk v maximálních jamkách pro lýzu buněk a uvolnění veškerého Chromu.
- Točit desku dolů na 1250rpm na deset minut, aby peleta buněk.
- supernatant přeneste z každé jamky do jamky absorpční desky (např. destiček Luma), přičemž dbejte na to, aby se pelety na dně jamky nedotýkaly.
- nechte desku přes noc zaschnout. Ráno ho vložte do čtečky desek a získejte výsledky.
výsledky se vám zobrazí, závisí na vaší konkrétní aplikace
Výpočet Výsledky Své Chromium Release Assay
Jakmile budete mít měření, je třeba provést jednoduchý výpočet pro stanovení cytotoxicity buněk.
nejprve zprůměrujte své triplikáty pro každou podmínku. Pak vezměte tyto průměry a zapojte je do tohoto vzorce:
(Chromium release pro stav zájmu – Chrom uvolnění spontánní wells)/ (max chrom verzi – Chrom uvolnění spontánní wells)
Násobit hodnotou 100, aby si své procent lýza.
