Chromium Release Assay: de ouderwetse manier om cytotoxische T-cellen

te testen Er zijn verschillende methoden die u kunt gebruiken om te zien of uw T-cellen cytotoxisch zijn, maar een chroom release assay met radioactief 51chromium (51Cr) is een van de oudste. Het geeft goede resultaten, en is groot voor laboratoria die zich niet kunnen veroorloven of stroom cytometry niet direct beschikbaar hebben.

hier zal ik een eenvoudige methode schetsen voor het testen van de T-celdodende functie met behulp van 51Cr. Maar voordat u begint met uw assay, moet u lezen over de juiste veiligheidsmaatregelen bij het omgaan met radioactieve materialen.

Kies uw doel-en effectoren

om een chroomvrijgavetest uit te voeren, incubeert u eerst uw doelcellen (T) met 51Cr. Vervolgens incubeer je de doelcellen met effectorcellen (je T-cellen; E). Als de effectorcellen de doelwitten doden, dan geven ze de 51Cr vrij, die je detecteert met een gamma-teller.

welke doelen en effecten u gebruikt is volledig afhankelijk van uw toepassing. Je doelcellen zijn waar je de T-celfunctie tegen test. Misschien wilt u uw doel te doden (maatregel cytotoxiciteit) of je zou kunnen kijken om te zien of de T-cellen tolerant zijn (zoals het testen van vervaardigde cellen voordat ze gaan in een patiënt voor de veiligheid!). Uw effector T cellen kunnen ook worden afgeleid uit verschillende bronnen. U kunt bijvoorbeeld gefabriceerde t-cellijnen of T-cellen gebruiken die vers zijn geïsoleerd van een dier.

laten we radioactief

als je eenmaal je doelwitten en effecten hebt verzameld, is het tijd om te koken.

1. tel uw cellen. U kunt een hemocytometer of een automatische cel teller gebruiken. Het aantal cellen dat u nodig hebt, is afhankelijk van het aantal voorwaarden en het aantal replicaten van elke voorwaarde die u doet. Typisch, ik doe mijn tests in drievoud en heb vier verhoudingen (5:1, 10:1, 20:1 en 40: 1 E: T). Aliquot uw doelcellen (in mijn geval 500.000-ongeveer 25.000 per put) in tot 15ml conische buizen, waarbij elke experimentele conditie apart! Zorg ervoor dat u uw cellen in een klein volume opschorten, zodat ze de kans hebben om in contact te komen met het chroom.

1. voeg de 51Cr (ongeveer 50 µCi) en incubeer uw doelen met het chroom voor een uur. Flick de buizen ongeveer elke 20 minuten om de mogelijkheden voor cellen om de opname van het chroom te verhogen.

1. terwijl je aan het incuberen bent … Deze lange incubatie is een geweldig moment om je effectorcellen op te zetten. Was de T-cellen twee keer met PBS om overtollige cytokines te verwijderen die uw resultaten kunnen scheeftrekken. Resuspendeer ze vervolgens in de juiste media.

1. zodra u klaar bent met de wasbeurten, bent u klaar om uw effectors op de plaat te zetten! Ik gebruik meestal een 96 goed plaat omdat de volumes zijn vrij klein. Plaat de effectoren in verschillende verhoudingen aan de doelstellingen om de drempel van het doden te bepalen. Ik voer de test meestal in drievoud uit, maar het hangt af van hoeveel cellen je beschikbaar hebt. 40, 20, 10 en 5 tot 1 ratio ‘ s (effectoren tot Targets) zijn een goede template als je genoeg beschikbare cellen hebt.

naast deze test moeten twee controlevoorwaarden worden vastgesteld:

• een spontane vrijgavecontrole die alleen doelcellen bevat (in principe een negatieve controle omdat er geen doding zou moeten zijn zonder de effecten) en
• een maximale vrijgavecontrole waarbij u de doelcellen lyse (een positieve controle die de maximale hoeveelheid chroom aangeeft die door de cellen wordt opgenomen).

1. terug naar die doelcellen…zodra je doelcellen klaar zijn met incuberen, was ze drie keer met celkweekmedium om het overtollige chroom te verwijderen. Draai de cellen zachtjes op 400g gedurende 5 minuten voor elk van deze wasbeurten. Decanteer het supernatant in een afvalcontainer die kan worden overgebracht naar een veilig vervalgebied in plaats van te proberen om het uit te pipetten. Dit zal helpen bij het verminderen van mogelijke verontreiniging, omdat je niet te maken hebt met eventuele tips.

1. na de wasbeurten uw cellen resuspenderen naar 5000 cellen per 100?l. voeg dan 100 toe?l van cellen aan elke put, zelfs de spontane en maximale putten. Incubeer de cellen samen voor een minimum van 4 uur bij 37°C, precies hoe lang hangt af van uw toepassing.

1. vier uur later … Haal je bord uit de couveuse. 100 erbij?l van een 1% triton-x oplossing aan uw cellen in de maximale putten om de cellen te lyse en al het chroom vrij te geven.

1. draai de plaat tien minuten naar beneden bij 1250 rpm om de cellen te pellet.

1. breng het supernatans van elk putje over in de putje van een absorberende plaat (bv. Luma-platen), waarbij u erop moet letten dat u de pellet aan de onderkant van de putje niet aanraakt.

1. laat de plaat ‘ s nachts drogen. In de ochtend, pop het in de plaatlezer en krijg je resultaten.

de resultaten die u ziet zijn afhankelijk van uw specifieke toepassing

het berekenen van de resultaten van uw Chromium Release Assay

zodra u de waarden hebt, moet u een eenvoudige berekening uitvoeren om de cytotoxiciteit van uw cellen te bepalen.

ten eerste, gemiddeld uw drievoud voor elke aandoening. Neem dan die gemiddelden en plug ze in deze formule:

(Chroomafgifte voor een interessante aandoening – Chroomafgifte in spontane putjes)/ (max chroomafgifte – Chroomafgifte in spontane putjes)

vermenigvuldig de waarde met 100 om uw percentage lysis te krijgen.