CMV promotor mutanty se sníženou náchylnost na ztrátu produktivity v CHO buňkách

Za účelem sledování účinků metylace náchylné CpG míst od enhancer, proximální a hlavní propagátor regionu, jsme se rozhodli prozkoumat nejen C-179 ale také cytosines na pozice -508 (C-508) a -41 (C-41). Žádný z vybraných CpG míst překrývá s známý transkripční faktor vazebná místa v Cricetidae druhů. Abychom udrželi celkový obsah GC, provedli jsme transverze C až G (obr. 1a). Kromě C-41 je C-13 druhým cytosinem v oblasti jádra promotoru, který se zdá být často methylován. Protože mutace C-13 G by vytvořit nový CpG místě, jsme se raději vyšetřit C-41 G. Zmutovaný pořadatel varianty byly zkráceny na tři dopis kód, např. varianta GCC má guanin místo cytosinu na pozici -508, vzhledem k tomu, že cytosin základny na -179 a -41 jsou zachovány. CCC je nemutovaná kontrola hCMV-MIE (obr. 1a). Mutované nebo nativní promotory byly zavedeny do různých plazmidů a umístěny proti proudu různých reportérových genů.

aby bylo vidět, zda mutace mají vliv na sílu promotoru, provedli jsme dva nezávislé pokusy o přechodně transfecting reportér plazmidů exprimujících vylučován embryonálních alkalickou fosfatázu (SEAP) do CHO-K1 buněk a zkoumal expresi SEAP pět dní po transfekci. Nemutovaný promotor byl použit jako referenční (obr. 1b). Exprese SEAP z promotorů GGG, GCG a CGC byla trvale asi o 20% nižší než u nemutovaného promotoru, s malou variací mezi replikačními experimenty. Mutace C až G obecně vykazovaly tendenci k mírně snížené síle promotoru, která se však jevila jako přijatelná.

dále jsme se zeptali, zda varianty promotoru hCMV-MIE ovlivňují expresi stability trvale transfekovaných CHO buněk během dlouhodobé kultivace. Za tímto účelem jsme zvolili reportér eGFP, který umožňuje cytometrickou analýzu exprese reportérového genu na úrovni jedné buňky. eGFP reportér plasmidy byly transfektovaly do CHO-K1 buněk a tři až čtyři nezávislé bazény trvale transfektovaly buňky byly vybrány s methotrexátem (MTX). Ty byly kultivovány po dobu tří měsíců za přítomnosti selekčního agenta MTX. Třicet čtyři a osmdesát sedm dní po transfekci byla exprese eGFP měřena cytometrií (mezi 34. a 87. dnem byly kvůli kontaminaci ztraceny dva bazény). Geometrické prostředky intenzity fluorescence 10 000 událostí na měření byly vypočteny pro každý fond buněk a vyneseny pro oba časové body (obr. 1c). Třicet čtyři dní po transfekci byl mezi konstrukty malý rozdíl. Pouze jeden fond CGC vykazoval zvýšené úrovně exprese. Osmdesát-sedm dní po transfekci, dva ze čtyř bazénů transfektovaly s CGC a dva ze tří bazénů transfektovaly s CCG zobrazí výrazně vyšší eGFP hodnot než všechny ostatní bazény, transfektovaly buď s unmutated kontrolu nebo zbývající pořadatel variant. Tato pozorování naznačují stabilizační účinek jednotlivých mutací C-41G nebo C-179G na expresi eGFP. Abychom tento výsledek konsolidovali, zopakovali jsme experiment jak s variantami promotoru, tak s větším počtem bazénů. Vygenerovali jsme deset bazénů s CCG nebo CCC, respektive osm bazénů s CGC (dva bazény byly ztraceny kvůli kontaminaci). Buňky byly kultivovány jako předtím a analyzovány pomocí průtokové cytometrie den 42 den 69 po transfekci (Obr. 1d a doplňkový obr. S1 online). Po 42 dnech, eGFP výraz byl silně zvýšil ve čtyřech CCG bazény ve srovnání s CCC ovládání bazény, vzhledem k tomu, že dva CGC bazény prokázala mírné zvýšení exprese eGFP (Obr. 1d, levý panel). Po 69 dnech tři bazény CCG stále vykazovaly vysokou úroveň eGFP, zatímco exprese egfp bazénů CGC klesla na kontrolní úrovně CCC (obr. 1d, pravý panel). Rozdíly mezi skupinami byly testovány v každém časovém bodě neparametrickým testem Steel-Dwass. Hladina alfa byla nastavena na 0,05. Významný rozdíl byl pozorován mezi CCG a CCC na den 56 po transfekci (p = 0.0305; viz Doplňující Obr. S1 online). Dohromady výsledky na obr. 1c, d naznačují, že obě mutace C-41G A C-179G mohou oddálit ztrátu exprese rekombinantního genu řízené hCMV-MIE.

Mutace C-41 G a C-179G zcela inhibovat DNA methylace na příslušné stránky, protože guanin nemůže být methylovány. Zajímalo nás, zda tyto mutace také ovlivnily hladiny methylace na jiných místech CpG v rámci hCMV-MIE. Proto, měřili jsme hladiny methylace všech míst CpG v jednotlivých variantách hCMV-MIE konverzí bisulfitů ve spojení se sekvenováním nové generace. Za tímto účelem jsme získali genomické DNA z buňky bazény druhého experimentu 42 a 69 dní po transfekci a zacházet s hydrogensiřičitan amonný rozlišovat mezi methanolem a non-metylovaný cytosin. DNA hCMV-MIE byla amplifikována a sekvenována systémem Illumina MiSeq (obr. 1e). C-179 většina silně methylované ve všech bazénech transfektovaly buď CCC nebo CCG, což potvrzuje předchozí pozorování s unmutated hCMV-MIE12. Dále jsme pozorovali zřetelný methylační vzorec, který byl velmi podobný u všech bazénů, ale lišil se celkovou intenzitou. Zejména nemutované C-508 A C-41 patřily trvale mezi nejčastěji methylovaná místa. Mutace C-41 v promotér varianta CCG, zejména mutace C-179 v varianta CGC, objeví se rovnoměrně snížení metylace všech CpG míst, spíše než změnu methylace vzor. Když jsme vypočítali průměrné hladiny methylace na všech místech CpG pro každý fond, zjistili jsme nižší celkovou methylaci s mutovanými variantami promotoru (viz Doplňkový obr. S2 online). Rozdíl byl nejvýraznější u varianty CGC, ale nedosáhl statistické významnosti při testu Steel-Dwass (α = 0,05). V průměru se methylace v průběhu času zvyšovala u všech konstrukcí.

kromě umlčení epigenetického promotoru je ztráta transgenových kopií hlavní příčinou nestability produkce v rekombinantních buňkách20. Za účelem odhadu relativního příspěvku, měřili jsme plazmidová čísla kopií qPCR 42 a 69 dny po transfekci. Průměrný počet kopií plazmidu se v průběhu času snižoval, bez zjevného rozdílu mezi konstrukcemi (viz Doplňkový obr. S2 online). Je zajímavé, že distribuce čísel kopií byla posunuta směrem k nižším hodnotám ve skupině CGC. Když jsme však testovali statistickou významnost pomocí testu Steel-Dwass, rozdíly mezi konstrukcemi se neprokázaly jako významné (α = 0,05).

skupiny trvale transfekovaných buněk jsou vysoce heterogenní směsi klonů lišící se expresí transgenu a rychlostí růstu. Vysoce produktivní klony mají tendenci mít nižší růst21. Proto, nízké produkující buňky, z nichž mnohé jsou přítomny v kultuře po transfekci, téměř nevyhnutelně přerůst vysoké výrobců dříve či později. Abychom toto zkreslení minimalizovali, zkoumali jsme mutace C-179G A C-41G v klonálních buněčných liniích. Protože jsme se zaměřili na posouzení účinků na výrobu potenciálního komerčního produktu, přešli jsme jako reportér na fúzní protein IgG-IL2. Promotorové varianty obsahující obě mutace buď samotné (CGC nebo CCG) nebo v kombinaci (CGG) byly vloženy před lehký řetězec a Gen těžkého řetězce plazmidu exprese IgG-IL2.

Výraz plasmidy nesoucí buď CCG CGC, CGG nebo unmutated hCMV-MIE byly transfektovaly do CHO-K1 buněk a stabilně transfektovaly klony byly izolovány v 384-no desek. Třicet klonálních buněčných linií na konstrukt bylo náhodně vybráno a rozšířeno do šesti jamkových desek. Po buněčných liniích ukázaly, stabilní růst, studovali jsme jejich produktivity po dobu přibližně dvou měsíců, 68 ze dne na den 134 po transfekci. Některé buněčné linie byly ztraceny kvůli kontaminaci nebo snížené životaschopnosti, přesto 23 na 29 klony na konstrukt byly zkoumány po celou dobu.

během celé studie jsme stanovili koncentrace IgG-IL2 v supernatantech buněčné kultury a produktivitu na buňku a den(specifická Produktivita qP). Na začátku (den 68) a na konci (den 134) studie vykazovaly buněčné linie transfektované CGC významně vyšší titry než kontrolní transfektanty (α = 0,05; obr. 2a). Buněčné linie s pozoruhodně vysokými titry byly také pozorovány mezi TRANSFEKTANTY CGG v den 68 a mezi TRANSFEKTANTY CCG a CGG v den 134. Když jsme porovnali konkrétní produktivitu mezi buněčnými liniemi transfektovanými různými konstrukty, provedli jsme podobná pozorování (obr. 2b). S cílem kompenzovat nepřesnosti v počítání buněk, jsme v průměru konkrétní productivities qP dvě pasáže v začátku (den 68-71 a 83-86 po transfekci představující nejstarší dostupné údaje bodů) a tři pasáže na konci dlouhodobé kultivace (den, 124-127, den 127-131 a day131–134 po transfekci). Významné rozdíly mezi buněčnými liniemi transfekovanými CGC nebo CCC byly pozorovány na konci dlouhodobé kultivace (α = 0,05).

hCMV-MIE varianty CGC a CCG stabilizovat produkci rekombinantního proteinu v klonální CHO buněčné linie.

(a) IgG-IL2 titry CHO klonů 68 dní (levý panel) a 134 dní (pravý panel) po transfekci. (b) specifická Produktivita qP CHO klonů na začátku (levý panel) a na konci (pravý panel) dlouhodobé kultivace. Časné hodnoty qP byly vypočteny zprůměrováním hodnot qP dvou raných pasáží představujících dva nejčasnější datové body (dny 68-71 a dny 83-86 po transfekci). Pozdě qP hodnoty byly počítány v průměru za poslední tři pasáže (dny 124-127, days127–131 a dny 131-134 po transfekci) (c) Procentní změna specifických productivities ∆qP během dlouhodobé kultivace na základě dat uvedených v (b) s (levý panel) a bez (pravý panel) jeden outlier označeny kudla analýzy. Byly zvažovány pouze klony produkující detekovatelné hladiny přípravku v den 68. a-c) identita variant promotoru a počet (N) nezávislých buněčných skupin je uveden pod osou x. Horní a dolní konce krabic představují první a třetí kvartil každé skupiny. Konce vousů představují nejnižší a nejvyšší hodnoty stále v 1,5 násobném mezikvartilním rozmezí. Šedá čára označuje celkový průměr proměnné y v diagramu. Významné rozdíly (α = 0,05)mezi skupinami podle testu Steel-Dwass jsou indikovány hodnotami p.

Vyšší titry a konkrétní productivities z buněčné linie nesoucí G-179 nebo G-41 navrhl stabilizující vliv těchto mutací na hCMV-MIE řízený genové exprese. Abychom dokumentovali tento účinek, vypočítali jsme procentuální změnu qP během dlouhodobé kultivace pro každou jednotlivou buněčnou linii jako nejvhodnější měřítko její stability produkce (obr. 2c). To bylo samozřejmě možné pouze s buněčnými liniemi, které stále produkují IgG-IL2 v den 68 po transfekci. Jeden kontrolní transfektant zvýšil svou specifickou produktivitu o 500% a byl identifikován jako outlier analýzou jackknife outlier (obr. 2c, levý plot). Proto byla tato buněčná linie vyloučena z další analýzy (obr. 2c, vpravo plot). Buněčné linie transfektované buď CGC nebo CCG byly významně stabilnější než kontrolní buněčné linie transfektované CCC (α = 0,05). Překvapivě se dvojitý mutant CGG nelišil od kontroly.