CMV-promotormutanter med redusert tilbøyelighet til produktivitetstap i CHO-celler

for å overvåke effekten av metyleringsutsatte CpG-steder fra enhancer, proksimal og kjernepromotor-regionen, valgte vi å undersøke Ikke bare C-179, men også cytosinene i posisjonene -508 (C-508) og -41 (C-41). Ingen av de utvalgte cpg-stedene overlapper med kjente bindingssteder for transkripsjonsfaktor i Cricetidae-arter. For å opprettholde det totale gc-innholdet, utførte Vi c Til G-transversjoner (Fig. 1a). Foruten C-41, C-13 Er den andre cytosin i kjernen promoter regionen som synes å være ofte denaturert. Fordi mutasjon Av C-13 Til G ville skape et nytt CpG-område, foretrakk vi å undersøke C-41G. de muterte promotorvarianter ble forkortet med en tre bokstavskode, f. eks. variant GCC har guanin i stedet for cytosin i posisjon -508, mens cytosinbaser ved -179 og -41 er bevart. CCC er den umuterte kontrollen hCMV-MIE (Fig. 1a). Muterte eller innfødte promotorer ble introdusert i forskjellige plasmider og plassert oppstrøms for forskjellige reportergener.

for å se om mutasjonene påvirker styrken til promotoren, utførte vi to uavhengige eksperimenter ved transiently transfiserende reporter plasmider som uttrykker utskilt embryonisk alkalisk fosfatase (SEAP) til CHO-K1-celler og undersøkte uttrykket AV SEAP fem dager etter transfeksjon. Den umuterte promotoren ble brukt som referanse (Fig. 1b). Ekspresjon AV SEAP FRA GGG, GCG og CGC-promotorer var konsekvent omtrent 20% lavere enn fra den umuterte promotoren, med mindre variasjon mellom replikateksperimentene. Generelt viste c Til G-mutasjonene en tendens til beskjeden redusert promotorstyrke som imidlertid syntes å være akseptabel.

deretter spurte vi om hCMV – mie promoter-varianter påvirker uttrykksstabiliteten til permanent transfiserte CHO-celler under langvarig dyrking. Til dette formål valgte vi en eGFP reporter som muliggjør cytometrisk analyse av reporter genuttrykk på enkeltcellenivå. eGFP reporter plasmider ble transfisert TIL CHO-K1 celler og tre til fire uavhengige bassenger av permanent transfiserte celler ble valgt med metotreksat (MTX). Disse ble dyrket over tre måneder i nærvær av seleksjonsmiddel MTX. Trettifire og åttisju dager etter transfeksjon ble egfp-uttrykk målt ved cytometri(to bassenger gikk tapt mellom dag 34 og 87 på grunn av forurensning). Den geometriske hjelp av fluorescens intensitet på 10.000 hendelser per måling ble beregnet for hver celle pool og plottet for begge tidspunkter (Fig. 1c). Trettifire dager etter transfeksjon var det liten forskjell mellom konstruksjonene. Bare ETT cgc-basseng viste forhøyede uttrykksnivåer. Åttisju dager etter transfeksjon viste to av fire bassenger transfisert MED CGC og to av tre bassenger transfisert med CCG tydelig høyere eGFP-verdier enn alle andre bassenger, transfisert enten med den umuterte kontrollen eller de resterende promotervariantene. Disse observasjonene foreslo en stabiliserende effekt AV de ENKLE c-41g-eller C-179G-mutasjonene på eGFP-uttrykk. For å konsolidere dette resultatet gjentok vi eksperimentet med både promotorvarianter og med et større antall bassenger. Vi genererte ti bassenger med CCG eller CCC, henholdsvis og åtte bassenger med CGC (to bassenger gikk tapt på grunn av forurensning). Cellene ble dyrket som før og analysert med flowcytometri fra dag 42 til dag 69 etter transfeksjon (Fig. 1d Og Utfyllende Fig. S1 online). Etter 42 dager, eGFP uttrykk ble sterkt økt i fire CCG bassenger sammenlignet MED ccc kontroll bassenger, mens to CGC bassenger viste en moderat økning i eGFP uttrykk (Fig. 1d, venstre panel). Etter 69 dager viste tre CCG-bassenger fortsatt høye nivåer av eGFP, mens eGFP-uttrykket FOR CGC-bassengene hadde falt TIL CCC-kontrollnivåer(Fig . 1d, høyre panel). Forskjellene mellom gruppene ble testet på hvert tidspunkt med Den ikke-parametriske Stål-Dwass-testen. Alfa-nivået ble satt til 0,05. En signifikant forskjell ble observert MELLOM CCG og CCC på dag 56 etter transfeksjon (p = 0,0305; Se Supplerende Fig. S1 online). Tatt sammen, resultatene Av Fig. 1c, d foreslo at begge mutasjonene C-41G og C-179G kan forsinke tapet av hCMV-mie-drevet rekombinant genuttrykk.

Mutasjonene C-41G og C-179G hemmer FULLSTENDIG DNA-metylering på det respektive stedet siden guanin ikke kan metyleres. Vi lurte på om disse mutasjonene også påvirket metyleringsnivåer på andre CpG-steder innenfor hCMV-MIE. Derfor målte vi metyleringsnivåene for alle CpG-steder i de enkelte hCMV – mie-varianter ved bisulfittkonvertering kombinert med neste generasjons sekvensering. Til dette formål hentet vi genomisk DNA fra cellepuljene i det andre eksperimentet 42 og 69 dager etter transfeksjon og behandlet det med bisulfitt for å diskriminere mellom metylert og ikke-metylert cytosin. hCMV-MIE DNA ble forsterket og sekvensert Med Illumina MiSeq-systemet (Fig. 1e). C-179 var sterkest metylert i alle bassenger transfisert med ENTEN CCC eller CCG, bekrefter tidligere observasjoner med den umuterte hCMV-MIE12. Videre observert vi et tydelig metyleringsmønster som var veldig likt med alle bassenger, men varierte i total intensitet. Spesielt var unmutated C-508 Og C-41 konsekvent blant de hyppigst metylerte stedene. Mutasjonen Av C-41 I promotervarianten CCG, spesielt mutasjonen Av C-179 i variant CGC, ser ut til å jevnt redusere metyleringen av alle CpG-steder i stedet for å endre metyleringsmønsteret. Når vi beregnet gjennomsnittlig metyleringsnivå på tvers av Alle CpG-områder for hvert basseng, oppdaget vi lavere total metylering med de muterte promotorvarianter (se Tilleggsfigur. S2 online). Forskjellen var mest uttalt med variant CGC, men nådde ikke statistisk signifikans med Stål-Dwass-testen(α = 0,05). I gjennomsnitt økte metylering over tid med alle konstruksjoner.

foruten epigenetisk promotor-demping, er tap av transgenkopier en viktig årsak til produksjonsstabilitet i rekombinante celler20. For å estimere det relative bidraget, målte vi plasmid kopi tall ved qPCR 42 og 69 dager etter transfeksjon. Gjennomsnittlig plasmid kopi tall redusert over tid, med ingen åpenbar forskjell mellom konstruksjonene (Se Supplerende Fig. S2 online). Interessant nok ble fordelingen av kopitall skiftet mot lavere verdier I CGC-gruppen. Men da vi testet statistisk signifikans med Stål-Dwass-testen, viste forskjellene mellom konstruksjonene seg ikke å være signifikante (α = 0,05).

Puljer av permanent transfiserte celler er svært heterogene blandinger av kloner som varierer i transgen ekspresjon og vekstrate. Svært produktive kloner har en tendens til å ha en lavere vekstrate21. Derfor er lavproducerende celler, hvorav mange er til stede i kulturen etter transfeksjon, nesten uunngåelig overgrow de høye produsentene før eller senere. For å minimere denne bias, undersøkte vi mutasjonene C-179G OG C-41G i klonale cellelinjer. Siden vi hadde som mål å vurdere effektene på produksjonen av et potensielt kommersielt produkt, byttet vi til Et IgG-IL2 fusjonsprotein som reporter. Således ble promotorvarianter som inneholdt begge mutasjoner enten alene (CGC eller CCG) eller i kombinasjon (CGG) satt inn oppstrøms for lettkjeden og tungkjedegenet Til Et IgG-IL2-ekspresjonsplasmid.

Ekspresjonsplasmider som bærer ENTEN CCG, CGC, CGG eller de umuterte hCMV-MIE ble transfisert TIL CHO-K1-celler og stabilt transfiserte kloner ble isolert i 384-brønnplater. Tretti klonale cellelinjer per konstruksjon ble tilfeldig valgt og utvidet til seks brønnplater. Etter at cellelinjene hadde vist stabil vekst, studerte vi produktiviteten i omtrent to måneder, fra dag 68 til dag 134 etter transfeksjon. Noen cellelinjer gikk tapt på grunn av forurensning eller redusert levedyktighet, men 23 til 29 kloner per konstruksjon ble undersøkt over hele tidsperioden.

i løpet av hele studien bestemte Vi IgG-IL2-konsentrasjoner i supernatanter i cellekultur og produktivitet per celle og dag (spesifikk produktivitet qP). Ved begynnelsen (dag 68) og slutten (dag 134) av studien viste cellelinjer transfisert MED CGC signifikant høyere titre enn kontrolltransfektantene (α = 0,05; Fig. 2a). Cellelinjer med bemerkelsesverdig høye titre ble også observert blant CGG-transfektantene på dag 68 og blant CCG-og CGG-transfektantene på dag 134. Når vi sammenlignet spesifikke produktiviteter mellom cellelinjer transfisert med forskjellige konstruksjoner, gjorde vi lignende observasjoner(Fig. 2b). For å kompensere for unøyaktigheter i celletelling, vi gjennomsnitt de spesifikke produktiviteter qP av to passasjer i begynnelsen (dag 68-71 og 83-86 etter transfeksjon representerer de tidligste tilgjengelige datapunkter) og tre passasjer på slutten av langsiktig dyrking (dag 124-127, dag 127-131 og dag131 – 134 etter transfeksjon). Signifikante forskjeller mellom cellelinjer transfisert MED CGC eller CCC ble observert ved slutten av langtids kultivering (α = 0,05).

Høyere titre og spesifikke produktiviteter av cellelinjer som bærer G-179 Eller g-41 foreslo en stabiliserende effekt av disse mutasjonene på hCMV-MIE-drevet genuttrykk. For å dokumentere denne effekten, beregnet vi den prosentvise endringen av qP under langvarig dyrking for hver enkelt cellelinje som det mest hensiktsmessige tiltaket for produksjonsstabilitet (Fig. 2c). Selvfølgelig var dette bare mulig med cellelinjer som fortsatt produserer IgG-IL2 på dag 68 etter transfeksjon. En kontrolltransfektant økte sin spesifikke produktivitet med 500% og ble identifisert som en outlier ved jackknife outlier analysis (Fig. 2c, venstre tomt). Derfor ble denne cellelinjen ekskludert fra videre analyse (Fig. 2c, høyre tomt). Cellelinjer transfisert med ENTEN CGC eller CCG var signifikant mer stabile enn kontrollcellelinjer transfisert med CCC(α = 0,05). Overraskende var den doble mutanten CGG ikke forskjellig fra kontrollen.

Published by admin

Legg igjen en kommentar Avbryt svar