Hranicích v Genetice

alkalická comet assay (single cell gel electrophoresis) je nejpoužívanější metodou pro měření poškození DNA v eukaryotických buňkách (Neri et al., 2015). Zjistí zlomů (SBs) a alkalicky labilní stránek na frekvencích od několika set do několika tisíc přestávky na buňku—biologicky užitečných rozsah, sahající od nízké endogenní poškození úrovní míry poškození, které může být způsobené experimentálně bez zabíjení buněk. Trávení nucleoids, po lýze, s určitými léze-konkrétní opravy endonucleases umožňuje měření o škody jiné než na SBs; zejména, formamidopyrimidine DNA glykosylázou a tím (FPG), byl široce používá k detekci změnil purinů, které jsou převedeny do přestávky enzymem. Nedávno (Cortés-Gutiérrez et al., 2014) vyvinula dvou-dimenzionální Two-Tailed comet assay (TT-kometa), které mohou rozlišovat mezi single-stranded (SSBs) a dvouvláknové zlomy DNA (DSBs), ve stejné komety ve spermatu.

od první zprávy Ostlinga a Johansona (1984) byl test komety široce používán při testování genotoxicity chemických látek v modelech in vitro i in vivo. Výhodou je, že buňky z různých tkání mohou být studovány v široké škále eukaryotických organismů. Během posledních 15 let, comet assay byl značně použitý v Drosophila melanogaster k testování genotoxicity chemických látek (Gaivão a Sierra, 2014). Tento přístup je velmi užitečný, protože Drosophila melanogaster je cenným modelem pro všechny druhy procesů souvisejících s lidským zdravím, včetně odpovědí na poškození DNA.

použití rostlin, jakož i široké škály suchozemských a vodních druhů v kometovém testu se v posledním desetiletí dramaticky zvýšilo (Costa et al., 2014; de Lapuente et al., 2015; Santos a kol., 2015), zejména v hodnocení environmentálních rizik (ERA). Nedávná validační studie ukázala, že test komety in vitro v kombinaci s FPG může být účinným doplňkovým důkazem v ERA i ve zvláště náročných přírodních scénářích, jako je prostředí ústí řek (Costa et al., 2014).

během posledních deseti let se výroba a použití nano-velkých materiálů výrazně zvýšila, a v důsledku toho také expozice člověka těmto typům materiálů. Identifikace a pochopení nebezpečí nanomateriálů (NMs) ve vztahu k lidskému zdraví není jednoduchá záležitost. Nejen, že chemické složení NMs je zodpovědné za jejich genotoxicitu, ale také tvar, specifická plocha povrchu, velikost, distribuce velikosti a potenciál Zeta určují účinky těchto materiálů na genom. I když tam je ještě debata o vhodnosti standardní testy genotoxicity pro studium účinků NMs, doposud nejvíce používanou metodou v nanogenotoxicology, díky své robustnosti, všestrannosti a spolehlivosti, byl comet assay (Azqueta a Dusinska, 2015). Kromě zkoumání genotoxicity záření a různých chemikálií byl test rostlinné komety nedávno také použit ke studiu genotoxického dopadu NPs (Santos et al ., 2015).

další aplikace testu komety je cenným experimentálním nástrojem pro biomonitoring člověka i v klinických studiích. Shromažďování krve nebo tkání není vždy proveditelné ve všech lidských subjektů, a jiné zdroje buněk, které mohou být shromažďovány neinvazivně byly testovány s comet assay; například, různé typy epiteliálních buněk (Rojas et al., 2014) stejně jako spermie (Cortés-Gutiérrez et al., 2014; Brunborg a kol., 2015).

souběžně s vývojem testu komety pro měření poškození DNA byly vyvinuty testy pro opravu DNA-základní prvek v genotoxické buněčné odpovědi. Nejjednodušší přístup pro opravy DNA měření je léčit buňky s DNA-škodlivé látky, a pak se inkubujte je umožnit opravy pokračovat, měření množství poškození zbývající v pravidelných intervalech. Alternativní biochemický přístup k hodnocení opravné kapacity byl popsán v roce 1994 (Collins et al ., 1994), a od té doby se různé upravené verze testu měřit obě základny excizní opravy (BER) a nukleotidová excizní oprava (NER) byly publikovány (přezkoumána Azqueta et al., 2014). Tento biochemický přístup byl použit ke studiu účinků prostředí, výživy, životního stylu a povolání na kapacitu opravy DNA, kromě klinických výzkumů (Azqueta et al., 2014).

tento alternativní přístup in vitro k opravě DNA hodnotí opravnou aktivitu buněčného extraktu na substrátu DNA obsahujícím definované léze. Test komety se používá k sledování akumulace zlomů DNA (opravných meziproduktů) s časem inkubace. V poslední době, Slyskova a jeho kolegové byli první, aby se použít in vitro opravy DNA testy pro BER a NER úspěšně na vzorky lidských tkání, konkrétně kolorektálního karcinomu biopsie (Slyskova et al., 2012, 2014).

jiný druh testu opravy DNA, který umožňuje buňkám vloženým do gelu opravit před lýzou, byl nedávno přijat ke studiu kinetiky opravy DNA podrobněji; konkrétně studovat regulaci ber proteinů post-transkripčními modifikacemi (Nickson a Parsons, 2014). Dalším způsobem, jak studovat opravu DNA na úrovni specifických genů, je technika kometa-ryba, která využívá fluorescenčně značené DNA sondy, které budou hybridizovat s jednovláknovou DNA v ocasu komety. McAllister et al. (2014) použil tuto metodu ke studiu preferenční opravy přerušení řetězce v hromadné DNA i ve vybraných oblastech s aktivně transkribovanými geny.

studium kinetiky opravy indukovaného poškození pomůže v našem pochopení buněčných reakcí na genotoxické chemikálie. Navíc význam opravy DNA jako hráče v (anti)karcinogenním procesu lze objasnit pohledem na opravu na úrovni specifických rakovinných cílových tkání. Nařízení opravy—a další aspekty buněčné odpovědi na genotoxické sloučeniny—je pravděpodobné, že zahrnují epigenetické mechanismy a comet assay byl přijat úspěšně měřit změny v globální vzor metylace DNA v jednotlivých buňkách za různých růstových podmínek (Lewies et al., 2014).

procento dna ocasu se doporučuje jako nejlepší deskriptor pro zlomové frekvence DNA, protože uvedené komety—a rozsah poškození-lze snadno vizualizovat. Mnoho vědců však stále dává přednost použití ocasního momentu (Møller et al ., 2014). Ve skutečnosti jsou oba deskriptory podobně ovlivněny podmínkami testu (Azqueta et al., 2011; Ersson a Möller, 2011).

variabilita testu komety je důležitou otázkou, ať už vyplývá z použití různých protokolů, nebo z nekontrolovatelné nebo náhodné experimentální variace. Zařazení referenční standardy ve všech experimentech se doporučuje, a to zejména když se velký počet vzorků—z biomonitoringu soudu, například—jsou analyzovány na různých příležitostech. Referenčními standardy jsou buňky se známým množstvím poškození DNA; buď neošetřených buněk (negativní kontrola), X-ray exponovaných buněk (pozitivní kontrola) nebo buňky ošetřené fotosenzibilizátor plus světlo (pozitivní kontrola pro testy včetně FPG-inkubace), šarže připravené a zmrazené jako alikvoty. Pokud dojde k podstatným změnám ve standardech v průběhu experimentů, výsledky vzorků mohou být normalizovány (Collins et al., 2014). Při výměně referenčních standardů mezi laboratořemi lze výsledky z těchto laboratoří snadněji porovnat.

referenční standardní buňky jsou normálně nastaveny v gelech paralelně se vzorkovacími gely. Vnitřní normy-tj., standardní buňky ve stejném gelu jako vzorkové buňky-by bylo ideální; ale je samozřejmě nezbytné, aby bylo možné rozlišit dva typy buněk. Pro tento účel byly úspěšně přijaty rybí buňky, které jsou větší nebo menší ve velikosti genomu ve srovnání s lidskými buňkami (Brunborg et al ., 2015). Tyto referenční buňky mohou být použity v kombinaci s standardní nebo kalibrační křivka (založena s buňkami vzhledem k různé dávky ionizujícího záření), což umožňuje přesnější kvantifikace poškození DNA vyjádřený jako DNA zlom frekvence, spíše než % tail DNA.

statistiky jsou důležitým nástrojem ve všech aplikacích testu komety, aby se zjistilo, zda se malé rozdíly vyskytují náhodou. Byly zveřejněny stručné popisy statistické analýzy a doporučení pro testy (Lovell et al., 1999; Lovell and Omori, 2008). Møller and Loft (2014) nám připomínají, že pro udržení statistické analýzy kometového testu je třeba při plánování experimentů pečlivě zvážit vhodný design studie a statistickou sílu.

stejně jako u všech biologických testů je integrace dat zásadní pro interpretaci výsledků testu komety v širším obrazu. Integrace informací poskytovaných testem komety s dalšími indikátory poškození DNA a buněčnými odpověďmi (např. oxidační stres, buněčné dělení nebo buněčná smrt)byla aplikována jak v ERA (Costa et al ., 2014; Santos a kol., 2015) a studie na lidech (biomonitoring) (např., 2010; Slyskova a kol., 2012). Také zahrnutí údajů “omics” pomůže odhalit způsob působení genotoxických sloučenin (Slyskova et al., 2012, 2014; Santos et al., 2015)—i když je třeba zdůraznit, že několik studií ukázalo, že fenotypové opatření opravy DNA nemusí nutně korelovat s genomických nebo transcriptomic dat (Collins et al., 2012; Slyskova a kol., 2012, 2014); různé přístupy by měly být považovány za doplňkové.

i po třech desetiletích vývoje a modifikace je test komety stále poměrně jednoduchý, všestranný, ale náročný na práci. Nedávno byly přezkoumány různé modifikace s vysokou propustností testu (Brunborg et al., 2014). Aplikace in Vivo I in vitro by získaly velkou výhodu z dalšího zlepšení účinnosti, standardizace protokolu a propustnosti. Automatizace a miniaturizace jsou společné strategie v mnoha oblastech biologie, který umožňuje objednávky-z-velikosti změny v počtu vzorků analyzovaných za experiment, snížení subjektivní zkreslení a zvýšení reprodukovatelnosti.

takže – v co můžeme doufat v příštích 30 letech? Přijetí in vitro comet assay pro zkoušení genotoxicity, levné automatické bodování komety zachránit vědci z nekonečné prohlížení mikroskopem, protokol normalizaci (snad) a spolehlivé interní referenční standardy, více lidského biomonitoringu studie oprav DNA (přijmout, že fenotypové testy mají důležité místo vedle genomiky a transcriptomics), monitorování životního prostředí pomocí různých živočišných a rostlinných druhů; a mnohé další nepředvídatelné události a aplikace.

Prohlášení o střetu zájmů

autoři prohlašují, že výzkum byl proveden bez jakýchkoli obchodních nebo finančních vztahů, které by mohly být vykládány jako potenciální střet zájmů.

poděkování

rádi bychom poděkovali všem autorům, recenzentům a editorům, kteří přispěli k tomuto výzkumnému tématu Frontiers. SL je příjemcem postdoktorandského grantu z Výzkumného fondu AXA a cefic-LRI Innovative Science Award 2013. AA díky Ministerio de Economía y Competitividad (‘Ramón y Cajal programu, 2013) španělské Vlády pro osobní podporu.