Chrom Release Assay: den gamle skole måde at teste cytotoksiske T-celler

der er flere metoder, du kan bruge til at se, om dine T-celler er cytotoksiske, men en chrom release assay ved hjælp af radioaktivt 51chromium (51cr) er en af de ældste. Det giver gode resultater, og er fantastisk til laboratorier, der ikke har råd til eller ikke har flydende cytometri let tilgængelige.

her vil jeg skitsere en simpel metode til test af T-celledrabsfunktion ved hjælp af 51cr. Men før du starter din analyse, skal du sørge for at læse om passende sikkerhedsforanstaltninger, når du håndterer radioaktive materialer.

Vælg dit mål og effektorer

for at lave et chrom-frigivelsesassay inkuberer du først dine målceller (T) med 51cr. Du inkuberer derefter målcellerne med effektorceller (dine T-celler; E). Hvis effektorcellerne dræber målene, frigiver de 51Cr, som du vil opdage med en gammatæller.

hvilke mål og effektorer du bruger, afhænger helt af din applikation. Dine målceller er det, du tester T-cellefunktion mod. Du vil måske dræbe dit mål (måle cytotoksicitet), eller du kan se om T-cellerne er tolerante (som at teste fremstillede celler, før de går ind i en patient for sikkerhed!). Dine effektor T-celler kan også stamme fra forskellige kilder. For eksempel kan du bruge fremstillede t-cellelinjer eller T-celler, der er frisk isoleret fra et dyr.

lad os få radioaktive

når du har samlet dine mål og effektorer, er det tid til at få madlavning.

1. Tæl dine celler. Du kan bruge et hæmocytometer eller en automatisk celletæller. Antallet af celler, du har brug for, afhænger af antallet af betingelser, og hvor mange replikater af hver tilstand, du gør. Typisk kører jeg mine analyser i tre eksemplarer og har fire forhold (5:1, 10:1, 20:1 og 40:1 E: T). Alikvot dine målceller (i mit tilfælde 500.000-omkring 25.000 pr. brønd) i til 15 ml koniske rør, der holder hver eksperimentel tilstand adskilt! Sørg for at suspendere dine celler i et lille volumen, så de har chancen for at komme i kontakt med krom.

1. Tilføj 51Cr (omkring 50 liter) og inkuber dine mål med chrom i en time. Flick rørene om hvert 20. minut for at øge mulighederne for celler til at optage chrom.

1. mens du inkuberer….Denne lange inkubation er et godt tidspunkt at oprette dine effektorceller. Vask T-cellerne to gange med PBS for at fjerne overskydende cytokiner, der kan skæve dine resultater. Derefter opblandes dem i de relevante medier.

1. når du er færdig med vaskene, er du klar til at lægge dine effektorer på pladen! Jeg bruger typisk en 96 brøndplade, da mængderne er ret små. Plade effektorerne i forskellige forhold til målene for at bestemme tærsklen for drab. Jeg kører typisk analysen i triplicater, men det afhænger af hvor mange celler du har til rådighed. 40, 20, 10 og 5 til 1-forhold (effektorer til mål) er en god skabelon, hvis du har nok tilgængelige celler.

ud over disse test skal du oprette to kontrolbetingelser:

• en spontan frigørelseskontrol, der kun indeholder målceller (dybest set en negativ kontrol, fordi der ikke skal være nogen drab uden effektorerne) og
• en maksimal frigørelseskontrol, hvor du lyser målcellerne (en positiv kontrol, der viser den maksimale mængde et krom, der optages af cellerne).

1. tilbage til disse målceller…når dine målceller er færdige med at inkubere, vask dem tre gange med cellekulturmedium for at fjerne overskydende krom. Drej cellerne forsigtigt ved 400 g i 5 minutter for hver af disse vasker. Dekanter supernatanten i en affaldsbeholder, der kan overføres til et sikkert henfaldsområde i stedet for at forsøge at pipette det ud. Dette hjælper med at reducere mulig forurening, da du ikke behøver at håndtere nogen tip.

1. efter vaskene, resuspend dine celler til 5000 celler per 100?l. tilføj derefter 100?l af celler til hver brønd, selv de spontane og maksimale brønde. Inkuber cellerne sammen i mindst 4 timer ved 37 liter C, præcis hvor længe afhænger af din ansøgning.

1. fire timer senere….Tag din tallerken ud af inkubatoren. Tilføj 100?l af en 1% triton-opløsning til dine celler i de maksimale brønde for at lyse cellerne og frigive alt krom.

1. drej pladen ned ved 1250rpm i ti minutter for at pille cellerne.

1. Overfør supernatanten fra hver brønd til brønden på en absorberende plade (f.eks.

1. lad pladen tørre natten over. Om morgenen, pop det ind i pladen læseren og få dine resultater.

de resultater, du ser, afhænger af din specifikke applikation

beregning af resultaterne af dit chrom-Frigivelsesassay

når du har aflæsningerne, skal du udføre en simpel beregning for at bestemme cytotoksiciteten af dine celler.

først, gennemsnit dine triplicater for hver tilstand. Tag derefter disse gennemsnit og sæt dem i denne formel:

(Kromfrigivelse for interessetilstand – Kromfrigivelse i spontane brønde)/ (maks.kromfrigivelse – Kromfrigivelse i spontane brønde)

Multiplicer værdien med 100 for at få din procent lysering.