Frontiers in Genetics

alkaline comet assay (single cell gel electrophoresis) er den mest anvendte metode til måling af DNA-skader i eukaryote celler (Neri et al., 2015). Det registrerer strengbrud (SBs) og alkali-labile steder ved frekvenser fra et par hundrede til flere tusinde pauser pr.celle—et biologisk nyttigt område, der strækker sig fra lave endogene skadeniveauer til omfanget af skader, der kan påføres eksperimentelt uden at dræbe celler. Fordøjelse af nukleoiderne efter lysis med visse læsionsspecifikke reparationsendonukleaser tillader måling af andre skader end SBs; især formamidopyrimidin DNA glycosylase (FPG) er blevet brugt i vid udstrækning til at detektere ændrede puriner, som omdannes til brud ved hjælp af FPG. For nylig, (Cort Kris-Guti Kris et al., 2014) udviklede et todimensionelt to-Tailed kometassay (TT-comet), der kan skelne mellem enkeltstrengede (SSB ‘er) og dobbeltstrengede DNA-brud (DSB’ er) i de samme kometer i sædceller.

siden den første rapport fra Ostling og Johanson (1984) har kometanalysen været meget anvendt til genotoksicitetstest af kemikalier i både in vitro og in vivo modeller. En fordel med sidstnævnte er, at celler fra forskellige væv kan studeres i en lang række eukaryote organismer. I løbet af de sidste 15 år er kometanalysen blevet brugt i vid udstrækning i Drosophila melanogaster til at teste kemikaliernes genotoksicitet (Gaiv Larso og Sierra, 2014). Denne tilgang er meget nyttig, da Drosophila melanogaster er en værdifuld model til alle former for processer relateret til menneskers sundhed, herunder DNA-skadesreaktioner.

anvendelsen af planter såvel som en bred vifte af jord-og akvatiske arter i kometanalysen er steget dramatisk i det sidste årti (Costa et al., 2014; De Lapuente et al., 2015; Santos et al., 2015), især i miljørisikovurdering (ERA). En nylig valideringsundersøgelse har vist, at in vitro-kometanalysen kombineret med FPG kan være en effektiv komplementær bevislinje i ERA, selv i særligt udfordrende naturlige scenarier såsom flodmundingsmiljøer (Costa et al., 2014).

i løbet af det sidste årti er produktionen og brugen af nanostørrelsesmaterialer steget markant, og som en konsekvens heraf har menneskelig eksponering for disse typer materialer også. At identificere og forstå farerne ved nanomaterialer (NMs) i forhold til menneskers sundhed er ikke en simpel sag. Ikke alene er den kemiske sammensætning af NMs ansvarlig for deres genotoksicitet, men også form, specifikt overfladeareal, størrelse, størrelsesfordeling og potentiale bestemmer virkningerne af disse materialer på genomet. Selv om der stadig er en debat om egnetheden af standardgenotoksicitetsanalyser til at studere virkningerne af NMs, har den hidtil mest anvendte metode i nanogenotoksikologi takket være dens robusthed, alsidighed og pålidelighed været kometanalysen (2015). Ud over at undersøge genotoksiciteten af stråling og forskellige kemikalier er plantekometanalysen for nylig også blevet brugt til at undersøge den genotoksiske virkning af NPS (Santos et al., 2015).

en yderligere anvendelse af kometanalysen er som et værdifuldt eksperimentelt værktøj til human biomonitoring såvel som i kliniske studier. Indsamling af blod eller væv er ikke altid muligt hos alle mennesker, og andre kilder til celler, der kan indsamles ikke-invasivt, er blevet testet med kometanalysen; for eksempel forskellige typer epitelceller (Rojas et al., 2014)såvel som sæd (Cort., 2014; Brunborg et al., 2015).

parallelt med udviklingen af kometanalysen til DNA—skademåling er der udviklet analyser til DNA—reparation-et væsentligt element i det genotoksiske cellulære respons. Den enkleste tilgang til DNA-reparationsmåling er at behandle celler med et DNA-skadeligt middel og derefter inkubere dem for at tillade reparation at fortsætte og måle mængden af skader, der er tilbage med intervaller. En alternativ, biokemisk tilgang til vurdering af reparationskapacitet blev beskrevet i 1994 (Collins et al., 1994), og siden da er forskellige modificerede versioner af analysen til måling af både baseudskæringsreparation (BER) og nukleotidudskæringsreparation (NER) blevet offentliggjort., 2014). Denne biokemiske tilgang er blevet anvendt til at undersøge virkningerne af miljø, ernæring, livsstil og besættelse på DNA-reparationskapacitet ud over kliniske undersøgelser., 2014).

denne alternative in vitro-tilgang til DNA-reparation vurderer reparationsaktiviteten af et celleekstrakt på et DNA-substrat indeholdende definerede læsioner. Kometanalysen bruges til at følge akkumuleringen af DNA-pauser (reparationsmellemprodukter) med inkubationstiden. For nylig var Slyskova og kolleger de første til at anvende in vitro DNA-reparationsanalyser for BER og NER med succes på humane vævsprøver; specifikt kolorektal carcinombiopsier (Slyskova et al., 2012, 2014).

en anden slags DNA-reparationsassay, der tillader celler indlejret i gelen at reparere før lysis, blev for nylig vedtaget for at studere DNA-reparationskinetik mere detaljeret; specifikt at studere reguleringen af BER-proteiner ved post-transkriptionelle modifikationer (Nickson og Parsons, 2014). Endnu en måde at studere DNA-reparation på, på niveau med specifikke gener, er med comet-FISH-teknikken, der gør brug af fluorescerende mærkede DNA-prober, der vil hybridisere til det enkeltstrengede DNA i komethalen. McAllister et al. (2014) brugte denne metode til at studere præferentiel strengbrudsreparation i bulk-DNA såvel som i udvalgte regioner med aktivt transkriberede gener.

at studere kinetikken ved reparation af induceret skade vil hjælpe med vores forståelse af cellulære reaktioner på genotoksiske kemikalier. Desuden kan betydningen af DNA-reparation som spiller i den (anti)kræftfremkaldende proces belyses ved at se på reparation på niveauet af specifikt kræftmålvæv. Regulering af reparation – og andre aspekter af det cellulære respons på genotoksiske forbindelser—vil sandsynligvis involvere epigenetiske mekanismer, og kometanalysen er blevet vedtaget med succes for at måle ændringer i det globale DNA-methyleringsmønster i individuelle celler under forskellige vækstbetingelser., 2014).

procent hale—DNA anbefales som den bedste deskriptor for DNA—brudfrekvenser, da de kometer, der henvises til-og omfanget af skader-let kan visualiseres. Imidlertid foretrækker mange forskere stadig brugen af tail moment (m Lartller et al., 2014). Faktisk er de to deskriptorer på samme måde påvirket af analysebetingelser., 2011; Ersson og M. kr., 2011).

variabilitet i kometanalysen er et vigtigt spørgsmål, uanset om det stammer fra brugen af forskellige protokoller eller fra ukontrollerbar eller tilfældig eksperimentel variation. Inkludering af referencestandarder i alle eksperimenter anbefales, især når et stort antal prøver—for eksempel fra et biomonitoreringsforsøg—analyseres ved forskellige lejligheder. Referencestandarder er celler med en kendt mængde DNA-skade; enten ubehandlede celler (negativ kontrol), røntgeneksponerede celler (positiv kontrol) eller celler behandlet med fotosensibilisator plus lys (positiv kontrol for analyser inklusive FPG-inkubation), batchforberedt og frosset som alikvoter. Hvis der forekommer væsentlig variation i standarderne i en række eksperimenter, kan prøveresultater normaliseres (Collins et al., 2014). Hvis referencestandarder udveksles mellem laboratorier, kan Resultater fra disse laboratorier lettere sammenlignes.

Referencestandardceller indstilles normalt i geler parallelt med prøvegeler. Interne standarder—dvs., standardceller i samme gel som prøveceller—ville være ideelle; men det er selvfølgelig vigtigt at kunne skelne mellem de to typer celler. Fiskeceller, der enten er større eller mindre i genomstørrelse sammenlignet med humane celler, er med succes blevet vedtaget til dette formål (Brunborg et al., 2015). Disse referenceceller kan anvendes i kombination med en standard-eller kalibreringskurve (etableret med celler givet forskellige doser af ioniserende stråling), hvilket muliggør en mere præcis kvantificering af DNA-læsioner udtrykt som en DNA-brudfrekvens snarere end % hale-DNA.

statistik er et vigtigt redskab i alle anvendelser af kometanalysen for at kontrollere, om små forskelle forekommer tilfældigt. Kortfattede beskrivelser af statistisk analyse og anbefalinger til test er blevet offentliggjort (Lovell et al., 1999; Lovell og Omori, 2008). M lartller And Loft (2014) minder os om, at for at holde Comet-analysen statistisk analyse enkel, bør passende undersøgelsesdesign og statistisk styrke overvejes nøje, når man planlægger eksperimenter.

som med alle biologiske analyser er dataintegration afgørende for at fortolke kometanalyseresultaterne inden for det større billede. Integration af information leveret af kometanalysen med andre DNA-skadeindikatorer og cellulære reaktioner (f.eks., 2014; Santos et al., 2015) såvel som humane (biomonitoring) undersøgelser (f.eks., 2010; Slyskova et al., 2012). Også inklusive “omics” – data vil hjælpe med at afsløre virkningsmåden for genotoksiske forbindelser (Slyskova et al., 2012, 2014; Santos et al., 2015) – selvom det er værd at påpege, at flere undersøgelser har vist, at fænotypiske målinger af DNA-reparation ikke nødvendigvis korrelerer med genomiske eller transkriptomiske data (Collins et al., 2012; Slyskova et al., 2012, 2014); de forskellige tilgange bør betragtes som komplementære.

selv efter tre årtier med udvikling og modifikation er kometanalysen stadig en ret simpel, alsidig, men arbejdskrævende analyse. Forskellige ændringer med høj kapacitet af analysen blev for nylig gennemgået (Brunborg et al., 2014). Både in vivo og in vitro applikationer ville få stor fordel af yderligere forbedringer i effektivitet, standardisering af protokol og gennemstrømning. Automatisering og miniaturisering er almindelige strategier inden for mange områder af biologi, der tillader størrelsesordener i antallet af analyserede prøver pr.

så—hvad kan vi håbe på i de næste 30 år? Accept af in vitro-kometanalysen til genotoksicitetstest, billig automatiseret kometscoring for at redde forskere fra uendelig mikroskopvisning, protokolstandardisering (måske) og pålidelige interne referencestandarder, flere humane biomonitoreringsundersøgelser af DNA-reparation (accept af, at fænotypiske analyser har en vigtig plads sammen med genomik og transkriptomik), miljøovervågning ved hjælp af en række dyre-og plantearter; og mange flere uforudsigelige udviklinger og anvendelser.

interessekonflikt Erklæring

forfatterne erklærer, at forskningen blev udført i mangel af kommercielle eller økonomiske forhold, der kunne fortolkes som en potentiel interessekonflikt.

anerkendelser

vi vil gerne takke alle forfattere såvel som korrekturlæsere og redaktører, der har bidraget til dette Frontiers-forskningsemne. SL er modtager af et postdoktoralt tilskud fra FORSKNINGSFONDEN og Cefic-LRI Innovative Science-prisen 2013. AA takker den spanske regerings Ministerio de Economy Kurra y Competitividad (‘Ram Kurtn y Cajal’ – programmet, 2013) for personlig støtte.