Diagnose von Entzündungen und Infektionen im Harnsystem über Proteomik

Probenquellen zur Auswertung proteomischer Daten im Urin für urindiagnostische Zwecke

Die Sammlung von 120 in dieser Studie profilierten Urinproben beschränkte sich nicht auf die Diagnose, Beurteilung des Fortschreitens oder die Behandlung einer bestimmten Krankheit. Die Urinanalyse (UA) der Proben wurde von den behandelnden Ärzten aus verschiedenen Gründen angeordnet, darunter akute Verletzungen, vaginale Blutungen, Schwindel / Übelkeit, Hyperlipidämie, Typ-II-Diabetes und damit verbundene Komplikationen, Bauchschmerzen / Übelkeit, nicht näher bezeichnete Hypertonie, Blasenhypertonie, idiopathische Polyurie und Verdacht auf Harnwegsinfektionen. Da HWI eine weit verbreitete Infektionskrankheit ist, die mit einigen der oben genannten klinischen Symptome (z. B. Bauchschmerzen / Übelkeit) und Risikofaktoren (z. B. Diabetes) verbunden ist, erwarteten wir eine häufige Diagnose von Bakteriurie oder HWI von diesen Proben. Proteomanalysen beschränkten sich auf Proben, bei denen Urinanalyseberichte vorläufige Unterstützung für bakteriell verursachte Harnwegsinfektionen lieferten (siehe Methoden). Wir haben keine Urinproben in Fällen analysiert, in denen die spezifische Diagnose einer asymptomatischen Bakteriurie zur Verfügung gestellt wurde. Für alle 120 Proben wurden umfangreiche UA-Daten erhalten. Dazu gehörten Ölmessstabtests, mikroskopische Untersuchung von Harnsedimenten auf verschiedene Zelltypen und Schleim und – in 46% der Fälle – Urinkulturdaten (UC). Daten zum Aussehen des Urins wie Trübung, Farbe und Urinpelletfarbe und -volumen wurden ebenfalls überprüft. Die Ergebnisse der Urinanalyse ermöglichten einen umfassenden Vergleich der konventionellen Methoden zur Diagnose von Erkrankungen der Harnwege mit Daten aus metaproteomischen Erhebungen (Zusatzdatei 3: Tabelle A3).

Neutrophile, die dominierenden Effektoren angeborener Immunantworten im Harntrakt, sind in vielen Proben für ein hohes Entzündungsniveau verantwortlich

Proteomische Daten lieferten starke Beweise für die wichtige Rolle von Neutrophilen als Effektoren und Entzündungsboten im Harntrakt. Neutrophile setzen antimikrobielle und entzündliche Moleküle aus sekretorischen Granula frei, die sie produzieren, und töten eindringende Krankheitserreger in Phagolysosomen nach ihrer Phagozytose ab. Eine hierarchische Clusteranalyse, optimiert für die Ordnung der Probenblätter (HCLSO), identifizierte vier Probencluster mit humanen Proteinabundanzprofilen, die von Neutrophilen dominiert wurden (23 von 111 Fällen; NAD1-Cluster in Abbildung 1), und zwei Cluster mit neutrophilenspezifischen Proteinmengen, die mit denen vergleichbar sind, die mit dem Zytoskelett assoziiert sind (25 Fälle; NAD2-Cluster in Abbildung 1). Zytoskelettproteine werden in Epithelzellen, die den Urogenitaltrakt auskleiden, stark exprimiert und machen den größten Teil des Harnsedimentproteoms aus, wenn keine pathophysiologischen Bedingungen im Harntrakt vorliegen. Fünfunddreißig der 48 NAD-Cluster-Profile waren positiv für IDs eines Uropathogens einschließlich G. vaginalis, was darauf hindeutet, dass ein dominanter Grund für die Entzündung bei den jeweiligen Patienten Bakteriurie und eine Immunantwort gegenüber den eindringenden Mikroben war. Der Grund für die Abstände zwischen den NAD-Clustern im Verknüpfungsbaum war die erhebliche Variation in der Anzahl der identifizierten menschlichen Proteine im Bereich von 200 bis 1.500 IDs pro Probe.

Hierarchische Clusteranalyse von Proteomprofilen von Urinpellets für 110 Proben. Hierarchisches Clustering wurde an quantitativen humanen Proteindatensätzen unter Verwendung der TPA-Methode in der MaxQuant-Software durchgeführt. Die Datensätze wurden der Pearson-Korrelationsanalyse mit Stichprobenblattordnungsoptimierung und vollständigem Linkage Clustering unter Verwendung des Softwaretools MeV unterzogen. Wir haben die Protein-Abundanz-Heatmap aus dem angezeigten hierarchischen Baum der UP-Proben eliminiert. Die Unterseite des Panels auf der linken Seite verbindet sich mit der Oberseite des Panels auf der rechten Seite, da es sich um Baumverknüpfungen handelt. Die Beispielclusternamen, die ganz rechts in der Grafik mit ihren Akronymen angezeigt werden, werden im Text ausführlich erläutert. Farbige Balken geben den Typ, die Größe und die Position jedes Beispielclusters in der Struktur an.

Aus proteomischen Daten abgeleitete Proteinhäufigkeiten von Neutrophilen korrelieren gut mit LE-Aktivitäten und Leukozytenzahlen

Eine wichtige Motivation für diese Studie war es, zu bestimmen, wie proteomische Daten aus Urinsedimenten im Vergleich zu herkömmlichen Assays zur Quantifizierung von Entzündungswerten in Urinproben abgeleitet wurden. Wir bestimmten die Mengen von 35 Proteinen, von denen bekannt ist, dass sie in aktivierten Neutrophilen stark exprimiert werden (Zusätzliche Datei 2: Tabelle A2), relativ zur Gesamtproteinhäufigkeit für jede UP-Probe, wie in blauen Balkensegmenten des Diagramms in Abbildung 2 dargestellt. Nicht unerwartet befanden sich 85% der Fälle, die zu den oben genannten NAD1-Clustern gehörten, in dem Abschnitt des Diagramms mit einem Neutrophilen Proteingehalt von mehr als 30% (auf der linken Seite). Die 35 Proteine umfassten fünf funktionelle Gruppen: die calciumbindenden Proteine der S100-Familie, S100-A8, S100-A9 und S100-A12, die 40-50% des gesamten cytosolischen Proteingehalts in Neutrophilen ausmachen; proteine, die während einer Entzündung aus neutrophilen Granula freigesetzt werden, einschließlich Myeloperoxidase (MPO), Cathepsin G (CTSG), Defensin-1 (DEFA1), Elastase (ELANE), Lysosom (LYZ), Lactotransferrin (LTF) und Cathelicidin (CAMP) ; Proteine, die an der Bildung, dem Handel und der Fusion von Granula mit Phagolysosomen beteiligt sind, einschließlich Grancalcin (GCA), Plastin-2 (LCP1), Annexin A3 ANXA3) und Tetraspanin (CD63-Antigen); Proteine, die die Neutrophilenmigration im Milieu einer sich reorganisierenden extrazellulären Matrix beeinflussen, wie Integrin aM / β2, Gelatinase (MMP9) und Neutrophilenkollagenase (MMP8); und NADPH-Oxidase, ein Enzym mit mehreren Untereinheiten, einschließlich Cytochrom b-245 (CYBA, Abbildung 3), das sich in der Membran von Phagolysosomen von Phagozytenzellen befindet und für den oxidativen Burst verantwortlich ist, der Krankheitserreger direkt abtötet. Viele dieser Proteine, insbesondere Defensin-1, waren in Proben mit Nachweis von Harnwegsinfektionen (z. B. SA_112 und PM_20, Abbildung 3) sehr häufig. Die bakteriellen Erreger in den beiden Fällen waren S. aureus (SA) und P. mirabilis (PM) und befanden sich nicht unerwartet auf der linken Seite im Diagramm von Abbildung 2 und nebeneinander in einem NAD1-Cluster (Abbildung 1). Wir erkennen an, dass diese Daten ungefähre Mengen an Neutrophilen widerspiegeln, wenn man bedenkt, dass Proteine wie Defensin-1, LTF, S100-A8 und S100-A9 auch von Urothelzellen in den Harntrakt freigesetzt werden. Die hierarchische Clustering-Analyse, optimiert für Protein Leaf Order (HCLPO), zeigte jedoch, dass diese Proteine miteinander gruppiert sind, was die Vorstellung einer dominanten Rolle von Neutrophilen bei ihrer Produktion unterstützt (Zusätzliche Datei 4: Abbildung A1). Eosinophile Peroxidase (EPX) und eosinophiles kationisches Protein (ECP), die beide auch Effektoren der Reaktion auf Krankheitserreger sind, waren um eine Größenordnung weniger häufig als neutrophile abgeleitete Proteine und unterstützten daher keine wichtige Rolle von Eosinophilen bei der Entzündungsreaktion. Der Makrophagen-spezifische migrationshemmende Faktor (MIF) war in noch geringeren Mengen vorhanden, was auf die nahezu Abwesenheit von Makrophagen als Teilnehmer an akuten Immunantworten nach einer Pathogeninvasion im Harntrakt hindeutet.

Proteinprofile, die quantitative Beiträge von Neutrophilen, dem Komplementsystem und Erythrozyten zum Gesamtproteom von Pelletproben im Urin zeigen. Die Grafik zeigt die summierten Proteinhäufigkeiten relativ zum Gesamtproteom für drei biologische Proteinkategorien. Die x-Achse listet die Identifikatoren der UP-Proben auf, die 110 menschlichen Probanden zugeordnet sind. Die drei Kategorien stellen Proteine dar, die von aktivierten Neutrophilen produziert werden (BLAU), Proteine, die in Erythrozyten stark exprimiert und bei Gefäßverletzungen freigesetzt werden (GRÜN), und Proteine, die mit Komplementsystemaktivität und Koagulation assoziiert sind (ROT). Die Methode zur Quantifizierung aller Proteine ist die iBAQ-Methode im MaxQuant-Softwaretool. Die Reihenfolge der Proben basiert auf der Häufigkeit von Neutrophilenproteinen und nimmt von links nach rechts ab. Um direkte Vergleiche für die Beurteilung der Entzündung zu ermöglichen, wurde der Score für den LE-Assay in die Grafik über jedem Balken aufgenommen, der eine Probe darstellt. Unterhalb der x-Achse zeigt ein zusätzlicher Balken, welche Proben mit der ID eines Erregers assoziiert waren, der eine Harnwegsinfektion verursacht (ORANGE Farbsegmente), kommensale Bakterien (GRÜNE Farbsegmente) oder fehlende bakterielle IDs (keine Farbe).

Fülle ausgewählter neutrophiler Proteine in UP-Proben. Dreizehn Proteine, die in der Legende ganz rechts aufgeführt sind, sind neutrophile Granulatproteine. Drei weitere Proteine sind Fibrinogen-β (FGB; an der Gerinnung beteiligt), Hämoglobin α-Untereinheit (HBA1; indikativ für Gefäßverletzungen) und Uromodulin (UMOD; reichlich im Urin gesunder Spender). Die Proben SA_112 und PM_20 repräsentierten Harnwegsinfektionen, die durch S. aureus (SA) bzw. P. mirabilis (PM) verursacht wurden. Das Profil von LG_23 (Lactobacillus) zeigte das Fehlen einer Entzündung an und stellte eine Harnröhrenbesiedlung dar, möglicherweise auch eine geringfügige vaginale Kontamination der Urinprobe. KP_10 (K. pneumoniae) schien eine vaginale Infektion darzustellen, da bei der Patientin klinisch vaginale Blutungen diagnostiziert wurden. Die Proteinprofile von EC_13 (UPEC) und KP_55 deuteten auf eine nahezu fehlende Entzündung und damit höchstwahrscheinlich auf eine Harnröhrenbesiedlung hin. Proteine wurden mit der iBAQ-Methode quantifiziert, jeweils dividiert durch die summierten iBAQ-Werte für das gesamte UP-Proteom.

NAD-Score

Die Darstellung der Neutrophilen Proteinmengen im Diagramm von Abbildung 2 wird aus den NAD-Scores (Neutrophilenaktivierung und Degranulation) abgeleitet, die ebenfalls in (Zusätzliche Datei 3: Tabelle A3) bereitgestellt werden. Abbildung 2 enthält LE-Scores von negativ (N) bis Spur (T), 1, 2 und 3 für jede Probe. Insgesamt wird eine starke Korrelation der Neutrophilen Proteinhäufigkeiten und der LE-Werte beobachtet. Der LE-Score misst die Leukozytenesteraseaktivität und repräsentiert wahrscheinlich hauptsächlich Elastase (ELANE) und Myeloblastin (PRTN3), zwei neutrophile Proteasen, die für acht Proben in quantifiziert wurden Abbildung 3. Alle Profile auf der linken Seite des Diagramms (Abbildung 2) und dreiundfünfzig der 60 Proben mit mehr als 30% (iBAQ) Neutrophilenproteingehalt hatten LE-Werte von 2 oder 3. Neunundzwanzig der 40 Proben mit weniger als 23% (iBAQ) Neutrophilenproteingehalt hatten LE-Werte von negativ bis 1. In nur vier von elf Fällen, in denen der LE-Score ≥ 2 war, der Neutrophilenproteingehalt jedoch relativ niedrig war, betrug die mikroskopische Leukozytenzahl mehr als 11 Zellen pro Hochleistungsfeld (HPF), ein Schwellenwert zur Definition der Pyurie. Insgesamt gab es etwas weniger Übereinstimmung im Vergleich der Leukozytenzahlen, die den Schwellenwert bei 11 Zellen / HPF mit mehr als 30% (iBAQ) Neutrophilenproteingehalt festlegten: 14 der 60 Fälle hatten Zählungen ≤ 10 (Zusätzliche Datei 3: Tabelle A3). Zusammenfassend scheint die Beurteilung des Neutrophilengehalts in Urinsedimenten mittels Proteomik mindestens so genau zu sein wie der LE-Assay zur Diagnose von Entzündungen im Harntrakt. Es misst die Summe der Häufigkeiten von 35 mit Neutrophilen angereicherten Proteinen und ist im Vergleich zum LE-Assay möglicherweise weniger anfällig für falsch positive Ergebnisse.

Der Gehalt an Erythrozytenprotein dient als diagnostischer Indikator für Gefäßverletzungen

Gefäßverletzungen im Harntrakt, die typischerweise mit Entzündungen einhergehen, werden mit Ölmessstabtests auf Hämoglobin und mikroskopischer Zählung der roten Blutkörperchen in der konventionellen Urinanalyse beurteilt. In Anbetracht der hohen Anreicherung verschiedener Proteine in Erythrozyten konnten wir einen proteomischen Ansatz entwickeln, der herkömmlichen Hämaturie-Tests entspricht. Summierte Häufigkeiten von 32 Erythrozytenproteinen, einschließlich Hämoglobin-Untereinheiten, Band 3 Anionentransportprotein, Band 7 integrales Membranprotein, und Carboanhydrase-1, relativ zum Gesamtproteingehalt in jeder UP-Probe wurden bestimmt, gezeigt durch die grünen Balkensegmente des Diagramms in Abbildung 2. Diese Proteinmengen sind als ERY-Scores in (Zusatzdatei 3: Tabelle A3) für jede Probe aufgeführt. Es gab keine Hinweise auf eine gute Korrelation von NAD-Scores oder LE-Assay-Ergebnissen mit ERY-Scores, was darauf hindeutet, dass selbst im Falle des Nachweises eines Pathogens (gezeigt durch die Färbung des horizontalen Balkens am unteren Rand des Diagramms in Abbildung 2), neutrophile Infiltration der Harnwege führt nicht immer zu einer signifikanten Hämaturie und Gewebeverletzung. Die Einstellung der Schwellenwerte für Hämaturie bei 2+ für den Ölmessstabtest und 4,5% für den ERY-Score ergab eine Übereinstimmung zwischen 81% aller Fälle. In den 21 Fällen, in denen die Ergebnisse nicht übereinstimmten, wurden die mikroskopischen Werte der roten Blutkörperchen bewertet. Unter Verwendung einer Anzahl von mehr als 10 Zellen pro Hochleistungsfeld (HPF) als Beweis für Hämaturie stellten wir fest, dass in zwei Dritteln der Fälle die mikroskopische Analyse mit den proteomischen Daten übereinstimmte. Wir schließen daraus, dass die proteomischen ERY-Scores eine gute quantitative Schätzung der Hämaturie im Urin liefern.

Urinproben, die mit Proteinen angereichert sind, die an Komplementaktivitäten und Koagulation beteiligt sind

Wir beobachteten, dass die HCLPO-Analyse, die auf alle proteomischen Profile im Urin angewendet wurde, 21 Proteine mit funktionellen Rollen in Gerinnungswegen und / oder im Komplementsystem gruppierte (Zusätzliche Datei 4: Abbildung A1). Die Begründung für die gemeinsame Messung der Proteinhäufigkeit in Bezug auf diese Entzündungswege basierte auch auf Berichten über umfangreiche funktionelle Wechselwirkungen . Wir identifizierten 42 Proteine, die mit Komplementsystemaktivitäten und Koagulation (CAC) assoziiert sind, deren summierte Häufigkeiten als CAC-Score für jede UP-Probe enthalten sind (Zusätzliche Datei 3: Tabelle A3). Das Komplementsystem trägt zur Akutphasenantwort und zur angeborenen Immunität bei, und seine Komponenten sind pro- oder entzündungshemmend. Eine zentrale Komponente ist die Komplementkomponente C3. C3 reift in das Opsonin C3b und das Anaphylatoxin C3a und wird nach der Produktion in Nierentubuluszellen in das Blutplasma und die Harnwege ausgeschieden . C3 spielt eine Rolle bei Infektionen der oberen Harnwege und der Aufnahme und Ruhe von UPEC in Uroepithelzellen, die möglicherweise mit dem klinischen Problem rezidivierender Harnwegsinfektionen verbunden sind . Obwohl die Mengen an Proteinen, die mit Komplementaktivitäten und Koagulation verbunden waren, nicht so hoch waren neutrophile Proteine, Die HCLSO-Analyse erzeugte zwei Probencluster, benachbart im Baum und mit einer Gesamtzahl von 12 Proben, gekennzeichnet durch eine relativ hohe Häufigkeit solcher Proteine (die CAC-Cluster in Abbildung 1). CAC-Cluster zeigten eine geringe Anzahl von Fällen mit einer ID für einen Erreger (3 von 12). Die CAC-Werte wurden in Abbildung 2 dargestellt, dargestellt durch die roten Balkensegmente jeder Probe (Spalte). Hohe Gesamtmengen an CAC-Proteinen korrelierten nicht gut mit hohen Mengen an neutrophilen Proteinen, was darauf hindeutet, dass entzündliche Aktivitäten, die durch das Komplementsystem (z. B. C3 und C4) und die Koagulation (z. B. Fibrinogen) vermittelt werden, getrennt reguliert werden können Pathogeninvasion oder andere Belastungen, denen der Harntrakt bei Patienten ausgesetzt war. Es wurde häufiger beobachtet, dass hohe CAC- und ERY-Proteinmengen gleichzeitig auftraten. Viele Gerinnungs- und Komplementproteine sind in der Tat reichlich im Blutplasma vorhanden. Diese Körperflüssigkeit tritt bei Gefäßverletzungen in das Lumen der Harnwege aus. Urinanalysetests, die der Messung von CAC-Scores entsprechen, werden in klinischen Labors selten verwendet.

Ausfällung von Harnsäuresalzen und zugehörigen proteomischen Profilen des Urinsediments

Die visuelle Inspektion der 12 Urinproben in den CAC-Clustern ergab, dass neun Urinproben stark trüb und zehn Urinpellets relativ groß mit einer rosa bis hellbraunen Färbung waren. Diese Merkmale wurden mit hohen Sättigungsgraden von Harnsäure und Ausfällung von Harnsäuresalzen, insbesondere bei einem pH-Wert unter 6, im Urin in Verbindung gebracht. Die Ausfällung von Harnsäure kann ein Vorläuferzustand der Harnsteinbildung sein . Es ist anzunehmen, dass das trübe Aussehen der Proben dazu beigetragen hat, die Präzipitate während der Mikroskopie fälschlicherweise als Bakterien zu identifizieren. Es lag nur ein klinischer Bericht über das Auftreten von Nierensteinen vor (GV_64). Obwohl das Proteomprofil für diesen Patienten nicht Teil des CAC-Clusters war, gaben die visuellen Merkmale der Probe auch Trübung und eine rosa bis hellbraune Urinpelletfarbe an. Wir gehen davon aus, dass Proteine, die in der löslichen Fraktion des Urins relativ häufig vorkommen, an die Salzpräzipitate binden und daher zu unterschiedlichen Proteinhäufigkeitsmustern in den jeweiligen Urinproben beitragen. Tatsächlich waren Proteine, die im Allgemeinen im Urin löslich sind und normalerweise eine geringe Häufigkeit in Urinpellets aufweisen, in einigen CAC-Clusterproben im Vergleich zu einer Kontrolle ohne Anzeichen von Harnwegsinfektionen und Salzausfällungen im Überfluss erhöht (LG_21). Beispiele für solche Proteine sind IgG γ-Kette, AMBP (Bikunin) und Fibrinogen γ-Kette, wie in Abbildung 4 gezeigt. Die Proteine Defensin-1 und die Untereinheiten HBA1 und HBD von Hämoglobin waren im Vergleich zu Daten für LG_21 am stärksten erhöht. Obwohl bekannt ist, dass die meisten in Abbildung 4 dargestellten Proteine im Urin und Plasma infolge lokaler Verletzungen erhöht sind und zur Akutphasenreaktion beitragen, zeigten diese Daten eine hohe quantitative Variabilität. Pathologische Signifikanz, insbesondere Verletzungen im Harntrakt, können aus diesen Daten nicht abgeleitet werden. Proteomprofile wurden kürzlich für die Harnsteinmatrix berichtet . Zu den am häufigsten beobachteten Proteinen in der Steinmatrix gehörten schwere IgG-Ketten, Fibrinogen-Untereinheiten, S100-A8, Lysozym C und LTF, Proteine, die auch in der Darstellung von Abbildung 4 gezeigt sind. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um den Wert der Proteomanalyse zu bewerten, um Biomarker aus Urinproben zu identifizieren, die Urinsalzniederschläge enthalten, z. B. um das Risiko einer Nierensteinbildung zu beurteilen.

Fülle ausgewählter Proteine in Proben mit Nachweis von Salzfällung im Urin. UP-Proben, die mit nm_ (no microbes) begannen, zeigten keine Hinweise auf eine bakterielle Besiedlung, aber die Urinsedimente hatten ein visuelles Erscheinungsbild, das auf Harnsäuresalzniederschläge hindeutet, und waren in zwei CAC-Clustern vorhanden. LG_21 (Lactobacillus) repräsentiert das Fehlen einer Entzündung. Bei dem mit der Probe GV_64 (G. vaginalis) assoziierten Patienten wurden Nierensteine diagnostiziert. Zusätzlich zu den in der Legende von Abbildung 3 beschriebenen Proteinen sind andere die Komplementkomponente C3 (C3), Ceruloplasmin (CP), Plasminogenaktivator Inhibitor-3 (PAI-3), AMBP (Bikunin), Hämoglobin δ-Untereinheit (HBD) und Immunglobulin γ-Kette (Ig Gamma). Alle diese Proteine sind an der Akutphasenreaktion beteiligt, die typischerweise durch Gewebeverletzung und Pathogeninvasion ausgelöst wird. Die Probenprofile zeigen eine hohe Variabilität der Proteinmengen, obwohl in einigen Proben deutliche Akutphasenproteine im Vergleich zur Kontrolle LG_21 erhöht waren.

Urethrale Kolonisation durch kommensale Bakterien, die keine Wirtsimmunantworten hervorrufen

Hochparallele DNA-Sequenzierungstechnologien haben gezeigt, dass Urin nicht vollständig steril ist, und der Begriff eines Harnmikrobioms hat sich zu einem interessanten Forschungsthema entwickelt . Es ist wahrscheinlich, dass äußere Teile der Harnröhre, insbesondere bei Frauen, mit Bakterien aus perinealen und vaginalen Quellen besiedelt sind. Es ist auch offensichtlich, dass eine suboptimale Sammlung von sauberem Urin von weiblichen Patienten zur Kontamination des Urins mit Proteinen und Kommensalbakterien aus der Vaginalhöhle führen kann. Die hier vorgestellten Daten können durch erklärt werden, unterscheiden aber nicht die beiden oben genannten Szenarien. Ungefähr 25% der in dieser Studie erhaltenen Harn-Proteomprofile waren angereichert für Proteine, die in einem physiologisch normalen Milieu (z. B. Uromodulin und Zytokeratine) in den Urin ausgeschieden werden oder reichlich von Epithelzellen produziert werden, die von Schleimhautoberflächen, die den Harn- und Vaginaltrakt auskleiden, ausgeschieden werden. Die HCLSO-Analyse identifizierte vier Cluster (Abbildung 1), einen großen Cluster mit 150 Proben, die mit nur zwei Ausnahmen von weiblichen Patienten stammten. Die Profile zeigten eine hohe Häufigkeit von Zytoskelettproteinen (z. B. α-Aktine und Annexine), desmosomale Proteine (z. B. Desmoplakin und Periplakin) und verhornte Zellhüllproteine (z. B. Zytokeratine, Cornulin und kleines prolinreiches Protein 3). Proteine, die zu den ersten beiden Kategorien gehören, sind in den meisten Zelltypen einschließlich Urothelzellen vorhanden , während das geschichtete Plattenepithel im Harnröhrengang und im Vaginaltrakt reichlich Proteine aus all diesen Kategorien produziert . Die mikroskopische Untersuchung von Urinsedimenten bestätigte den erhöhten Plattenepithelzellgehalt mit Scores ≥ 2+ für die meisten der in den vier Clustern vorhandenen Proben (Zusätzliche Datei 3: Tabelle A3), die von nun an als Uromodulin- und Plattenepithelzellcluster mit Vaginalbakterien (USEV) bezeichnet werden. Uromodulin, ein Protein, das zum Wasser-Elektrolyt-Gleichgewicht im Harntrakt beiträgt , war auch in den Proben des USEV-Clusters reichlich vorhanden. Vaginalbakterien (Lactobacillus und G. vaginalis) wurden aus 22 von 30 Proben identifiziert, und Bakterien fehlten in 5 dieser Proben. Proteomische Daten bestätigten ein sehr niedriges Entzündungsniveau für die USEV-Cluster in 74% der Fälle gemäß NAD-Scores, wie aus den Positionen der Proben in der Grafik von Abbildung 2 hervorgeht. Ein repräsentatives Profil des USEV-Clusters ist LG-23 mit einem NAD-Score von 20% und geringen Häufigkeiten von entzündungsassoziierten Proteinen mit Ausnahme von Defensin-1 und S100A8 (Abbildung 3). Im Vergleich zu den Profilen für SA_112 und PM_20 waren alle Proteine, die zur Entzündung beitragen, in LG_23 weniger häufig. G. vaginalis kann ein opportunistischer Erreger im Harn- und Vaginaltrakt sein. Clustering der Wirtsproteinprofile in den USEV-Clustern, ausgewählt für die Identifizierung von Lactobacillus, G. vaginalis oder beiden Arten, zeigte das Fehlen einer starken Immunantwort gegenüber diesen Bakterienarten. Wir schließen daraus, dass die Proteomanalyse diagnostischen Wert hat, indem sie das Fehlen einer Infektion im Urogenitaltrakt von Frauen nachweist.

Harnröhrenbesiedlung durch opportunistische Erreger

Die USEV-Cluster umfassten drei Fälle, in denen häufige Erreger der Harnwege identifiziert wurden, UPEC und K. pneumoniae. Die beiden Fälle (EC_13 und KP_55) zeigten niedrige NAD- und ERY-Werte, was mit dem Fehlen einer durch Neutrophile ausgelösten Entzündung und Gefäßverletzung übereinstimmte. Die relativen Häufigkeiten der Proteine, die in Abbildung 3 für diese beiden Fälle angezeigt werden, und ihre Ähnlichkeit mit dem für LG_23 beobachteten Muster stützten die Vorstellung, dass Immunantworten, die für Harnwegsinfektionen charakteristisch sind, bei der Besiedlung durch die Bakterien nicht ausgelöst wurden. Ob es sich bei den Fällen um eine asymptomatische Bakteriurie (ASB) handelt, kann aufgrund mangelnder Kenntnisse über die Immunantwort auf molekularer Ebene für ASB nicht beurteilt werden. Zusammenfassend stützen diese Daten die Vorstellung, dass proteomische Profile Fälle von Harnröhrenbesiedlung durch Uropathogene ohne Aktivierung des angeborenen Immunsystems identifizieren können.

Vaginale Kontamination mit Nachweis von Urogenitalinfektionen

Die HCLSO-Analyse erzeugte einen NEUEN Probencluster, den wir als vaginalen Kontaminationscluster (VCO) bezeichneten (siehe Abbildung 1). Die VCO-Cluster-Profile zeigten eine hohe Häufigkeit von Zytoskelett-, desmosomalen und verhornten Zellhüllproteinen, aber niedrige oder moderate Uromodulinmengen, was darauf hindeutet, dass der vaginale Proteingehalt in diesen Proben erhöht war. Der VCO-Score, ein quantitatives Verhältnis von fünf Proteinen, die im zervikovaginalen Epithelgewebe mit relativ hoher Spezifität gemäß der Datenbank exprimiert werden, wurde im Vergleich zu Uromodulin berechnet. Diese Proteine waren Cornifelin, Cornulin, Serpin B3, Galectin-7 und das Proteoglycan Mucin-5B. Neutrophilenspezifische entzündungsfördernde Moleküle wie das Protein S100-A12 und Lysozym (LYZ) und Proteine, die auf eine Gefäßverletzung hinweisen oder darauf ansprechen (HBA1 bzw. Fibrinogen-β), waren im VCO-Cluster im Vergleich zum USEv-Cluster häufiger vorhanden, wie für KP_10 im Vergleich zu LG_23 in Abbildung 3 gezeigt. Der VCO-Cluster enthielt 14 Proben, alle außer einer von weiblichen Patienten, von denen die Hälfte mit einer ID für ein Uropathogen assoziiert war. In fünf Proben wurde G. vaginalis oder Lactobacillus identifiziert. Klinische Beweise deuteten auf vaginale Blutungen bei der Patientin der Probe KP_10 hin, was die Diagnose einer urogenitalen oder vaginalen Infektion mit K. pneumoniae unterstützt. Die VCO-Scores sind in der zusätzlichen Datei 3: Tabelle A3 enthalten. Ein Wilcoxon-Rangsummentest, bei dem die VCO-Werte der VCO- und USEV-Cluster verglichen wurden, ergab einen p-Wert von 0,017, was darauf hindeutet, dass der Score nützlich ist, um keine oder geringfügige von größeren vaginalen Kontaminationen in Urinproben zu unterscheiden. Es können keine eindeutigen Einschätzungen bezüglich der Nützlichkeit des VCO-Scores zur Unterscheidung einer Harnwegsinfektion von einer Vaginalinfektion vorgenommen werden.

Die Proteomanalyse von Urinsedimenten identifiziert Mikroben mit einer Empfindlichkeit und Spezifität, die mit denen der Urinkultur vergleichbar sind

Wir identifizierten Bakterien aus 76 UP-Proben und Candida albicans aus einer UP-Probe (63% aller analysierten Fälle). In nur 55 Fällen wurden Urinkulturen durchgeführt, von denen 44% mindestens einen Erreger, 24% kommensale Organismen und 17% kein mikrobielles Wachstum zeigten (Zusatzdatei 3: Tabelle A3). Im Zusammenhang mit Pathogenidentifikationen stimmten Proteomdaten und UC-Ergebnisse nicht immer überein (Tabelle 1). Mehrere Gründe scheinen zu den Meinungsverschiedenheiten beigetragen zu haben. Die Herausforderungen bei der Interpretation metaproteomischer Daten basierend auf den identifizierten mikrobiellen Proteinen folgen. Erstens können Protein-IDs für weniger häufige Uropathogene aufgrund des Fehlens ihrer Proteinsequenzen aus der durchsuchten Datenbank übersehen werden. Die in der Datenbank vertretenen Bakterienarten wurden in zwei Fällen mittels Proteomanalyse identifiziert (K. pneumoniae und E. faecalis), aber die UC-Daten deuteten auf das Vorhandensein der phylogenetisch nahen Arten Enterobacter aerogenes bzw. E. faecium hin. Zweitens sind mikrobielle Organismen, die in geringer Häufigkeit im Urin vorhanden sind, in Gegenwart von hochhäufigen Mikroben schwieriger zu identifizieren, insbesondere wenn die mikrobiellen Spezies eine umfangreiche Sequenzidentität unter orthologen Proteinen aufweisen. Die Profile EC_85 und KP_11 in (Zusatzdatei 5: Datensatz A1) veranschaulichen dieses Problem und betreffen insbesondere die Familie der Enterobacteriaceae, die die Mehrheit aller Harnwegsinfektionen verursachen. Ungenaue genomische Annotationen, z. fehlende Gene für eine Spezies (in der UP-Probe vorhanden) führen zur Identifizierung orthologer Proteine, die im Genom einer verwandten Spezies korrekt annotiert sind (in der UP-Probe jedoch fehlen). Kleine tryptische Peptide werden in einer Shotgun-Proteomanalyse identifiziert, was eine falsche Proteinzuordnung durch den Suchalgorithmus bei hoher Sequenzidentität wahrscheinlicher macht. Drittens kann die ID von Bakterien, die in niedrigen Anzahlen im Urin vorhanden sind, weniger als ~ 10.000 Zellen / ml, kombiniert mit einem hohen proteomischen Hintergrund des Wirts, übersehen werden, da Wirt- und mikrobielle Proteine nicht getrennt von LC-MS / MS untersucht werden. Niedrige KBE-Zählungen für bakterielle Organismen gemäß UC-Daten zeigten eine niedrigere Übereinstimmungsrate mit proteomischen IDs als hohe KBE-Zählungen (Zusätzliche Datei 3: Tabelle A3). Proteomische Identifikationen von Mikroben haben dagegen den Vorteil, dass sie kulturunabhängig sind und Informationen über Virulenz, Antibiotikaresistenz, aufgetretenen Stress und Wachstumszustand der identifizierten Erreger liefern. Zwei Beispiele für solche umfassenden Daten sind in (Zusatzdatei 5: Datensatz A1) enthalten. In einem Datensatz (EC_85) wurden Proteine von UPEC, G. vaginalis und Lactobacillus profiliert. Im anderen Datensatz (KP_11) war die Ursache der Harnwegsinfektion K. pneumoniae. Tabelle 1 gibt einen Überblick über den Vergleich des Nitrittests, die Identifizierung von Enterobacteriaceae im Urin anhand ihrer Fähigkeit, Nitrate zu reduzieren, und die Ergebnisse mit den proteomischen Daten. 90% der positiven Nitrittests betrafen tatsächlich Fälle von Bakteriurie mit UPEC oder K. pneumoniae als Erreger und wurden ausnahmslos auch mit den Proteom- und UC-Methoden identifiziert. Im Gegensatz zur Proteomanalyse schienen Nitrittests in zehn Fällen nicht empfindlich genug zu sein, um Enterobacteriaceae zu identifizieren. Nitrittests waren in 21 Fällen, in denen die ID aus Proteomanalysen G. vaginalis war, nicht positiv. In Bezug auf Unterschiede in der Pathogen-ID über proteomische versus UC-Methoden wurden β-hämolytische Streptokokken in drei Fällen durch UC-Experimente identifiziert, während proteomische Daten auf das Vorhandensein von G. vaginalis hindeuteten. Wie in Tabelle 1 gezeigt, war die Anzahl der übereinstimmenden IDs für UPEC und in geringerem Maße für K. pneumoniae hoch. Zusammenfassend zeigte die proteomische Methode eine höhere Empfindlichkeit als der Nitrittest und eine mit UC vergleichbare Empfindlichkeit und Spezifität. Ein hoher proteomischer Wirtshintergrund in einer Urinprobe verringert die Empfindlichkeit für die mikrobielle Identifizierung.