Die konstitutive Expression ausgewählter Gene aus den Pentosephosphat- und Aromawegen erhöht die Shikimisäureausbeute in Hochglucose-Batchkulturen eines Escherichia coli-Stammes ohne PTS und pykF

Konstruktion von Stämmen, die von PB12-aroK-aroL-haltigen A-Stämmen abgeleitet sind plasmid zur konstitutiven Expression eines synthetischen Operons bei der Herstellung von Shikiminsäure

Unveröffentlichte Nachweise aus unserem Labor deuten darauf hin, dass die Produktion von aromatischen Verbindungen im im Labor entwickelten Stamm PB12 höhere Werte erreichen kann, wenn die transkriptionelle Induktion der Gene, die an der Kanalisierung des Kohlenstoffflusses in den AAA-Weg beteiligt sind, zu Beginn der Fermentationen erfolgt. Unter Berücksichtigung dieser Beobachtung wurde eine neue Strategie zur Optimierung der Produktion von SA in PB12 mit inaktiven aroK- und aroL-Genen entwickelt (Abbildung 1). Diese Strategie beinhaltete das Design und die Konstruktion eines Plasmids für die starke und stabile Expression von sechs Schlüsselgenen, die in Form eines synthetischen Operons angeordnet sind und ausschließlich von einem einzelnen Trc-Promotor gesteuert werden. Um die metabolische Belastung zu verringern, wurde ein einzelnes Plasmid, das von pBR327 abgeleitet war und den par-Locus für eine erhöhte Plasmidstabilität trug, als Vektor verwendet, nachdem ein Fragment eingebaut worden war, das den Promotor, den Polylinker und die transkriptionellen Terminatoren von pTrc99A enthielt (Abbildung 2).

Der initiale Teil des Operons wurde durch sequentielle Amplifikation und Ligation der ersten 4 kodierenden Sequenzen (aroB, tktA, aroGfbr und aroE) in den als Klonierungsgerüst verwendeten Polylinker des Plasmids pBRINT-Ts Cm konstruiert (siehe Methoden). Später wurde die 4-Gen-Konstruktion in Verbindung mit 2 weiteren Genen (aroD und zwf) auf das Hybridplasmid pTrc327par übertragen, was zu einem 8-KB-Operon führte, das in einem 12-KB-Plasmid enthalten war (Abbildung 2). Das resultierende Plasmid, pTrcAro6 genannt, wurde in den PB12 aroK-aroL-Stamm ohne das lacIq-Gen transformiert, was eine konstitutive Expression der interessierenden Gene ermöglichte (Tabelle 1). Der Einfachheit halber wurde der erzeugte PB12 aroK-aroL-lacI-Stamm als AR2 bezeichnet. Nachdem das pykF-Gen in AR2 inaktiviert wurde, wurde der resultierende Stamm AR3 genannt. Von AR2 und AR3 abgeleitete Stämme, die das Plasmid pTrcAro6 tragen, wurden als AR26 bzw. AR36 bezeichnet (Tabelle 1).

Die räumliche Anordnung der kodierenden Sequenzen, die das synthetische Operon in pTrcAro6 bilden, flankiert vom Trc-Promotor und transkriptionellen Terminatoren, ist in Abbildung 2 dargestellt. aroB ist das erste Gen im Operon, da mehrere Beweise darauf hindeuten, dass seine geringe Expression einer der limitierenden Schritte bei der Herstellung von aromatischen Verbindungen ist . Plasmid pTrcAro6 trägt auch die Gene tktA und aroGfbr, deren Produkte an der E4P-Synthese und deren Kondensation mit PEP zu DAHP, der ersten aromatischen Verbindung, beteiligt sind (Abbildung 1). aroD- und aroE-Gene wurden ebenfalls eingeschlossen, um eine effiziente Umwandlung von DHQ in SA zu fördern. Zusätzlich trägt dieses Plasmid das zwf-Gen, das für das erste Enzym des PPP kodiert (Abbildung 1). Die Entscheidung, dieses Gen aufzunehmen, basierte auf folgenden Beobachtungen: 1) die Überexpression von zwf hat den Verlust der Wachstumsrate aufgrund der Plasmid-metabolischen Belastung in Stamm JM101, der auf Glucose als einzige Kohlenstoffquelle wächst, im Wesentlichen wieder wettgemacht; 2) Es wurde berichtet, dass Stamm PB12 eine besonders niedrige Kohlenstoffflussverteilung am Glucose-6-Phosphat (G6P) -Knoten in Richtung PPP aufweist (5% des verbrauchten G6P im Vergleich zu 22% im elterlichen Stamm JM101) . Daher sollte eine Überexpression dieses Gens die NADPH-Verfügbarkeit erhöhen, die in katalytischen Mengen vom Enzym Shikimatdehydrogenase (AroE) benötigt wird, und kann potenzielle Wachstumseffekte lindern, indem mehr G6P in Richtung Nukleotid- und Aminosäurebiosynthese in Stämmen umgeleitet wird, die von PB12 abgeleitet sind . Die in diesem Bericht vorgestellten Experimente zielten jedoch nicht darauf ab, die spezifische Wirkung eines verwendeten Gens zu sezieren, sondern die Konsequenzen der Expression aller Gene als Operon zu charakterisieren.

Um eine effiziente Translation jedes Gens zu fördern, wurde jede kodierende Sequenz unter Verwendung bestimmter Primer amplifiziert, die eine Konsensus-Shine-Dalgarno-Sequenz einführten, die sich 8 bp stromaufwärts der Translationsstartstelle befand. Die Nukleotidsequenz des konstruierten Operons ist in der zusätzlichen Datei 1 dargestellt.

Bewertung der Auswirkungen der pykF-Inaktivierung in Stämmen, die das Aro6-Operon exprimieren

Zur Bewertung der Auswirkungen der pykF-Inaktivierung auf die Produktion von SA wurde die Leistung der Produktionsstämme AR26 (pykF+) und AR36 (pykF-) unter Verwendung von Schüttelkolben mit 15 g / l Glc und 5 g / l YE verglichen. Als Kontrolle wurden die gleichen Stämme, die ein leeres pTrc327par-Plasmid (ohne das Aro6-Operon), AR2e und AR3e, enthielten, ebenfalls eingeschlossen.

Obwohl sich SA in allen Fällen akkumulierte, wie für Mutanten in aroK und aroL erwartet, erreichten die Stämme, die pTrcAro6 enthielten, höhere SA-Konzentrationen als diejenigen mit einem leeren Plasmid (Abbildung 3b). Darüber hinaus war der SA-Titer in AR36 fast doppelt so hoch wie in AR26 (6,1 g / l vs. 3,3 g / l). Eine Abnahme des Glc-Verbrauchs wurde in Stamm AR26 nach etwa 18 h Kultur beobachtet, was mit einer hohen Acetatkonzentration und einem Stillstand der SA-Produktion korrelierte. Im Gegensatz dazu zeigte der Stamm AR36 einen konstanten Glc-Verbrauch und es wurden vernachlässigbare Mengen Acetat produziert (Abbildung 3c, 3d). Diese Ergebnisse zeigen, dass die im künstlichen Operon vorhandenen Gene funktionell sind und die Produktion von SA seit Beginn der Kultur fördern. Ihre konstitutive Expression verringerte die spezifische Wachstumsrate (μ) im pykF + -Hintergrund um 25% und erhöhte sie in der pykF- Variante geringfügig, verursachte jedoch keine signifikanten Änderungen der maximal produzierten Biomasse (Xmax) im Vergleich zu Stämmen mit einem leeren Plasmid (Abbildung 3a). Bemerkenswert ist, dass in den Operon-exprimierenden Stämmen unter diesen Wachstumsbedingungen die Inaktivierung des pykF-Gens die Produktion von SA erhöhte, die Akkumulation von Acetat eliminierte und einen stetigen Glc-Verbrauch ermöglichte.

Verhalten der Stämme AR26, AR36 und ihrer Leerplasmid-Derivate AR2e (pykF+) und AR3e (pykF-) unter Verwendung von Schüttelkolben mit 15 g/l Glc und 5 g/L YE (a,b, c, d) und 1 L Fermentatoren mit 100 g/L Glc und 15 g/L YE (e). a) Wachstum; b) SA-Produktion; c) Glc-Verbrauch; d) Acetatproduktion; e) Glc-Verbrauch und SA-Produktion von AR26 und AR36 in Fermentern. Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung.

Um festzustellen, ob die höhere Acetatproduktion und niedrigere SA-Produktion in AR26 im Vergleich zu AR36 eine Folge der inhärent geringen Sauerstoffverfügbarkeit und Ansäuerung des Mediums in Schüttelkolbenkulturen ist, wurden beide Stämme in 1 L-Batch-Fermentern unter kontrollierten Bedingungen von pH kultiviert und gelöste Sauerstoffspannung (DOT). Als Ansatz zur Erhöhung des SA-Titers wurde die Anfangskonzentration von Glc in diesen Experimenten auf 100 g / l erhöht, und die YE-Konzentration wurde gleichzeitig auf 15 g / l erhöht, um eine höhere Biomasseerzeugung zu ermöglichen.

Unter diesen Bedingungen produzierte der Stamm AR36 in 60 h 42 g/L SA, verbrauchte das gesamte Glc und akkumulierte 12 g/L Acetat. Im Gegensatz dazu produzierte Stamm AR26 nach 47 h maximal 13 g / L SA, erschöpfte die Glc nicht und akkumulierte 29 g / L Acetat (Abbildung 3e und Tabelle 2). Unabhängig von den kontrollierten Bedingungen in den Fermentern, wo der pH-Wert bei 7 gehalten wurde und der DOT zu jeder Zeit höher als 20% war, ähnelten die Produktionsprofile beider Stämme dem Verhalten, das in Schüttelkolben beobachtet wurde, wobei AR26 mehr Acetat und weniger SA produzierte. Selbst wenn die globale volumetrische Glc-Verbrauchsrate (Qsglobal), μ und Xmax, die von beiden Stämmen erreicht wurden, ähnlich waren, waren Produktivität, Ausbeute und Titer in AR36 mehr als doppelt so hoch wie in AR26 (Abbildung 3e und Tabelle 2).

Es ist bemerkenswert, dass solche großen Unterschiede in der Acetat- und SA-Produktion durch Unterbrechung nur eines Gens beobachtet wurden, was die Vorteile der kombinierten Inaktivierung von PTS und pykF bei Verwendung eines konstitutiven Expressionssystems in einem entwickelten E. coli-Stamm demonstriert. Um die beobachteten Verbesserungen der SA-Produktion zu berücksichtigen, schlagen wir vor, dass die frühe und konstante Expression von Enzymen, die im Operon kodiert sind, einen stetigen Verbrauch von glykolytischen Zwischenprodukten in den Kulturen aufrechterhalten und hohe Schwankungen ihrer intrazellulären Konzentrationen verhindern könnte. Wir nehmen an, dass die Kombination dieses Steady Metabolic State mit a reduzierter Fluss von PEP zu Pyruvat verursacht durch die Inaktivierung des pykF-Gens kann die Verfügbarkeit von PEP und anderen glykolytischen Vorläufern für die SA-Produktion erhöhen, ohne die Glc-Verbrauchsrate zu verringern. Wir erkennen jedoch an, dass diese Bemerkungen in Abwesenheit gemessener intrazellulärer Metabolitenkonzentrationen spekulativ sind.

Fermentationsprofile von AR36 in Batchkulturen

Unter Berücksichtigung der bisherigen Ergebnisse wurde AR36 zur weiteren Charakterisierung seiner kinetischen und stöchiometrischen Leistung in 1-L-Fermentern ausgewählt. Um diesen Zweck zu erreichen, wurde die Herstellung von SA mit drei verschiedenen Hochsubstratkulturbedingungen getestet. Wachstum, Glc und Nebenprodukte wurden jeweils gemessen, was wiederum einen Vergleich der Produktivitäten und Ausbeuten ermöglichte.

Zunächst wurden 50 g/l Glc und 15 g/L YE verwendet (Abbildung 4a). Das Wachstum erfolgte während der ersten 10 h und erzeugte 6,3 g / L Trockenzellengewicht mit einem μ von 0,53 h-1. Unter dieser Bedingung wurden 24 g / L SA in 32 h hergestellt. Der Glc-Verbrauch und die SA-Produktion traten seit Beginn der Fermentation auf und dauerten bis zur Glc-Erschöpfung, obwohl die spezifische Glc-Verbrauchsrate (qs) und die spezifische SA-Produktivität (qp) in exponentieller Phase höher waren (Tabelle 3). Die resultierende Ausbeute an SA auf Glc (YSA/Glc) betrug 0,47 mol/mol und die globale volumetrische SA-Produktivität (Qpglobal) betrug 0.74 gSA/L*h (Tabelle 3). In Bezug auf die Akkumulation von Nebenprodukten im SA-Weg waren am Ende der Fermentation Konzentrationen von 2,4 g / L DAHP, 2,1 g / L DHS, 1,4 g / l QA, 0,4 g / L GA und 0,3 g / L DHQ im Überstand vorhanden (Abbildung 5a). Unter diesen Bedingungen wurde im Verlauf der Fermentation praktisch kein Acetat gebildet, das nach 32 h eine maximale Konzentration von 1,5 g/L erreichte (Abbildung 4a).

Fermentationsprofil des Stammes AR36 kultiviert in 1 L Bioreaktoren mit drei verschiedenen Substratkonzentrationen. a) 50 g/l Glc und 15 g/L YE; b) 100 g/L Glc und 15 g/L YE; c) 100 g/L Glc und 30 g/L YE. Glc: Kreise; SA: Quadrate; Azetat: offene Dreiecke; Biomassekonzentration: umgekehrte Dreiecke. Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung.

Aromatische Nebenprodukte des SA-Weges in 1 L Fermentorkulturen des Stammes AR36 unter Verwendung von drei verschiedenen Substratkonzentrationen nachgewiesen. a) 50 g/l Glc und 15 g/L YE; b) 100 g/L Glc und 15 g/L YE; c) 100 g/L Glc und 30 g/L YE. Diamanten: DAHP (3-desoxy-D-arabinoheptulosonat-7-phosphat); Quadrate: DHQ (3-dehydrochinsäure); Kreise: DHS (3-dehydroshikiminsäure); Dreiecke: QA (Chinasäure); umgekehrte Dreiecke: GA (Gallussäure). Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung.

Da 50 g/l Glc vollständig verbraucht wurden, wurde ein zweiter Batchversuch mit 100 g/L Glc und 15 g/L YE gestartet. Wie im Vergleich zu AR26 im vorherigen Abschnitt angegeben, produzierte AR36, das unter diesen Bedingungen gezüchtet wurde, ungefähr 42 g / L SA in 60 h (Abbildung 4b). In diesem Fall erzeugte der Stamm nach dem Verzehr von etwa 100 g / l Glucose und dem Erreichen der maximalen Konzentration von SA 12 g / l Acetat. Die erhaltenen Werte für YSA/Glc, Qpglobal, Qsglobal, Xmax und μ waren ähnlich denen, die mit 50 g/l Glc und 15 g/l YE erhalten wurden (Tabelle 3). Diese Experimente zeigen, dass bei Verwendung der gleichen Glucosekonzentration die doppelte Menge an Glc in fast der doppelten Zeit verbraucht wird, was darauf hinweist, dass die durchschnittliche Glucoseverbrauchsrate zwischen beiden Kulturbedingungen aufrechterhalten wird. Konzentrationen von 4,8 g/l DAHP, 2,8 g/l DHS, 3,4 g/l QA, 0.Im Überstand befanden sich nach 60 h 7 g/L GA und 0,9 g/L DHQ (Abbildung 5b). Interessanterweise stiegen bei Verdoppelung der Glc-Konzentration die Zwischenprodukte des AAA-Pfades ziemlich proportional zur SA an, was darauf hindeutet, dass der Verbrauch von 100 g / l Glc anscheinend keine neuen Engpässe beim Kohlenstofffluss verursachte. Infolgedessen betrug die Menge an gebildetem SA in Bezug auf die insgesamt erzeugten aromatischen Verbindungen in beiden Experimenten nahe 80% (Abbildung 6).

Molprozent jeder in Stamm AR36 hergestellten aromatischen Verbindung bezogen auf die Gesamtmenge in Chargenkulturen beginnend mit: a) 50 g/l Glc und 15 g/L YE; b) 100 g/L Glc und 15 g/L YE; c) 100 g/L Glc und 30 g/L YE. Unter jedem Balken sind berechnete Ausbeuten und Molverhältnisse der hergestellten aromatischen Verbindungen angegeben. Die Vergleiche erfolgten mit den am Ende der Fermentationen im Überstand gemessenen Konzentrationen. YSA/Glc = Ausbeute von SA aus Glc; YTAC/Glc = Ausbeute an gesamten aromatischen Verbindungen aus Glc; Ymax = maximale theoretische Ausbeute an aromatischen Verbindungen.

Der Effekt der Erhöhung des YE auf die SA-Produktivität wurde mit einem dritten Versuchssatz unter Verwendung von 100 g / l Glc und 30 g / l YE untersucht. Obwohl die Biomasse bei Verwendung der doppelten Konzentration von YE verdoppelt wurde, waren der SA-Titer, μ und YSA / Glc denen, die in der Kultur mit 100 g / l Glc und 15 g / l YE erhalten wurden, sehr ähnlich (Abbildung 4b und Abbildung 4c). In Verbindung mit Daten aus den beiden anderen Bedingungen legen diese Ergebnisse nahe, dass die Menge an YE in erster Linie die maximale Biomasse bestimmt, die erreicht werden kann. Darüber hinaus veränderte eine Erhöhung der anfänglichen YE-Konzentration den SA-Titer nicht und stützt die Beobachtung, dass SA hauptsächlich aus Glucose hergestellt wird. Die direkte Beziehung zwischen der anfänglichen YE-Konzentration und der maximal erzeugten Biomasse, unabhängig von der anfänglichen Glc-Konzentration, die unter diesen Wachstumsbedingungen getestet wurde, legt nahe, dass ein oder mehrere limitierende Nährstoffe von der YE geliefert werden. Es scheint auch, dass solche Nährstoffe nicht aus Glc synthetisiert werden können, daher begrenzt ihre Erschöpfung das Wachstum, lange bevor Glc erschöpft ist. Es wird erwartet, dass die aromatischen Aminosäuren und Vitamine im YE, die benötigt werden, um der AR36-Auxotrophie entgegenzuwirken, limitierend werden; Andere Verbindungen in diesem komplexen Medium können jedoch auch eine Rolle bei der Wachstumsbeschränkung im Laufe der Zeit spielen.

Bei einer YE-Ausgangskonzentration von 30 g/L wurden insgesamt 106 g/L Glc und 43 g/L SA in etwa der Hälfte der Zeit als die Fermentation mit 15 g/L YE verbraucht bzw. hergestellt. Mit 30 g/l YE erhöhten sich Qsglobal und Qpglobal im Vergleich zu den Fermentationen mit 15 g/L YE, obwohl der SA-Titer unverändert blieb (Tabelle 3). Da sich die Biomasse ebenfalls verdoppelte, waren die berechneten qp und qs zwischen den drei Experimenten sowohl in exponentieller als auch in stationärer Phase ähnlich und zeigten die metabolische Robustheit des entwickelten Stammes unter den getesteten Bedingungen.

Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse, dass eine Erhöhung der YE-Konzentration die Konzentration von SA-Pathway-Intermediaten nicht signifikant erhöhte (Abbildung 5c). In diesem Zusammenhang wurde anerkannt, dass die Anwesenheit hoher Mengen an Zwischenprodukten die Rückgewinnung von SA aus der Fermentationsbrühe negativ beeinflussen kann . Diese Besorgnis hat einige Anstrengungen in das Thema gelenkt, was zur Prüfung von Kulturbedingungen, genetischen Hintergründen und der Verwendung von nicht metabolisierbaren Glucoseanaloga führte, um die Nebenproduktbildung zu minimieren .

In diesen Experimenten wurde ein hoher Anteil an SA in Bezug auf Nebenprodukte nachgewiesen, ohne dass weitere Modifikationen am Stamm oder Prozess vorgenommen wurden. Die Konzentration jedes aromatischen Zwischenprodukts wurde mit der Summe aller aromatischen Zwischenprodukte verglichen, und ihre Prozentsätze wurden verwendet, um das molare Verhältnis von SA zu jedem Nebenprodukt am Ende der Fermentationen zu berechnen (Abbildung 6). Das Verhältnis von SA erwies sich als höher als 10 für DHS, QA oder DAHP und höher als 40 für GA oder DHQ für alle getesteten Substratkonzentrationen. Bemerkenswerterweise lagen unter allen Bedingungen die erhaltenen SA-Ausbeuten nahe 50% des theoretischen Maximums und die Ausbeuten an Gesamtaromaten (TAC) über 60% des theoretischen Maximums, geschätzt als 0.86 molTAC/molGlc (siehe Methoden und Abbildung 6). Dies spiegelt die effiziente Umleitung von Glucose auf den AAA-Weg in Stamm AR36 wider, selbst wenn Batchkulturen mit hohem Glucosegehalt verwendet werden. Das Verhältnis von SA zu Nebenprodukten sowie die erhaltenen SA- und TAC-Ausbeuten sind für alle untersuchten Bedingungen ziemlich konstant und stellen unseres Wissens die höchsten gemeldeten Werte für einen SA-Produktionsfermentationsprozess dar. Diese Verbesserungen können dadurch gerechtfertigt werden, dass berücksichtigt wird, dass die im gentechnisch veränderten Stamm vorhandene Plattform eine homogenere Expression der notwendigen Enzyme auf einem effizienten genetischen Hintergrund ermöglicht. Dies steht im Gegensatz zu anderen Expressionssystemen, bei denen die erforderlichen Gene aus separaten Plasmiden, unter verschiedenen Promotoren oder in Stämmen exprimiert werden, die nicht für die effiziente Verwendung hoher Glc-Spiegel optimiert sind. Neben den Vorteilen hinsichtlich der Dynamik der Genexpression stellt die Tatsache, dass IPTG nicht benötigt wird, um das Aro6-Operon zu induzieren, einen wichtigen wirtschaftlichen Vorteil für den Produktionsprozess dar, da der hohe Preis von IPTG seine Verwendung in Großfermentationen einschränkt.

Einblicke in den glykolytischen und Acetatmetabolismus von Stamm AR36 durch RT-qPCR

Um einen tieferen Einblick in die metabolischen Veränderungen zu erhalten, die durch die konstitutive Expression des synthetischen Aro6-Operons in Stamm AR36 induziert werden, wurden Transkriptspiegel mehrerer Gene in drei verschiedenen Wachstumsstadien in Kulturen mit 50 g / l Glc und 15 g / l YE gemessen. Wie in Methoden beschrieben, wurden Daten, die aus der frühen exponentiellen Phase (EE), der späten exponentiellen Phase (LE) und der stationären Phase (ST) erhalten wurden, gegen die Werte normalisiert, die aus dem Stamm AR3E bei EE gemessen wurden, der unter denselben Kulturbedingungen gezüchtet wurde.

Die Ergebnisse zeigen, dass die Anwesenheit und Expression des Operons im Stamm AR36 die Transkriptionsniveaus mehrerer Gene erhöht, die für glykolytische Enzyme während der EE- und LE-Phasen kodieren (Abbildung 1 und Abbildung 7a). Der Anstieg der Expression der Gene galP und glk ist besonders interessant, da berichtet wurde, dass ihre Produkte den Import und die Phosphorylierung von Glucose in PB12, dem Elternstamm von AR36, steuern . Darüber hinaus gibt es einen signifikanten Anstieg der Transkriptionsniveaus von pgi und eno, nicht jedoch von pykA. Diese Änderungen können zu einer höheren Verfügbarkeit von PEP und Fructose 6-P führen (die durch Plasmid-kodierte Transketolase direkt in E4P umgewandelt werden können), wodurch die Ausbeute an aromatischen Verbindungen erhöht wird. Wir vermuten, dass die beobachtete Hochregulation glykolytischer Gene im Stamm AR36 eine der Folgen für niedrige Spiegel einiger glykolytischer Zwischenprodukte (Glucose-6-Phosphat, Fructose-6-phosphat und PEP) sein könnte, die durch die starke und konstitutive Expression der operon-kodierten Enzyme verursacht werden, die diese Metaboliten konsumieren.

Transkriptionsänderungen, die sich aus der Expression des synthetischen Operons Aro6 im Stamm AR36 ergeben. Zum Vergleich wurde der Transkriptionsgrad jedes Gens an drei verschiedenen Punkten in der Wachstumskurve des Stammes AR36 bestimmt, der mit 50 g / l Glc und 15 g / l YE gezüchtet wurde (siehe Abbildung 4a). Alle Daten wurden gegen die Werte des Stammes AR3E in der frühen exponentiellen Wachstumsphase normalisiert. a) Gene, die für glykolytische Enzyme kodieren; b) Gene, die an der Acetatassimilation und Biosynthese beteiligt sind; c) Gene, die im synthetischen Aro6-Operon enthalten sind (siehe Abbildung 1 und Abbildung 2). Schwarze Balken: frühe exponentielle Phase; graue Balken: späte exponentielle Phase; weiße Balken: stationäre Phase. Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung.

Auf der anderen Seite wurden die Transkriptionsniveaus von Genen, die für Enzyme kodieren, die an der Acetatbiosynthese beteiligt sind (poxB, ackA und pta), nicht durch das Vorhandensein des synthetischen Operons modifiziert, während actP und acs, die für Enzyme kodieren, die an der Acetatassimilation beteiligt sind, in den EE- und LE-Phasen stark hochreguliert waren (Abbildung 7b). Eine Hochregulation von actP- und acs-Genen wurde auch in der exponentiellen Wachstumsphase im Elternstamm PB12 nachgewiesen, der in der Lage ist, Glc und Acetat in minimalem Medium gemeinsam zu nutzen . Diese Befunde korrelieren mit den niedrigen Acetatspiegeln in der untersuchten Wachstumsbedingung (Abbildung 4a). Wichtig ist, dass die Transkriptionswerte dieser Gene, die an der Acetatassimilation beteiligt sind, in der ST-Phase niedrig waren (Abbildung 7b). Wenn diese Reaktion für die anderen verwendeten Wachstumsbedingungen repräsentativ ist, könnte sie teilweise die Acetatakkumulation erklären, die in Fermentationen mit 100 g / l Glc beobachtet wurde, die während der stationären Phase höhere Mengen an Glc verbrauchen (Abbildung 4b und Abbildung 4c). Diese Ergebnisse heben actP und acs als potenzielle Genziele hervor, um ihre Expression in späten Kulturstadien künstlich zu erhöhen, wobei die erwarteten Fähigkeiten des Stammes AR36 genutzt werden, gleichzeitig Glc und Acetat zu verwenden, die in seinem Elternstamm PB12 vorhanden sind .

Die im synthetischen Operon vorhandenen Gene zeigten sehr starke Expressionsniveaus (auch in stationärer Phase), was die konstitutive Natur des Promotors und die hohe Kopienzahl des Plasmids widerspiegelt (Abbildung 7c). Diese Ergebnisse korrelieren mit dem ununterbrochenen Glc-Verbrauch und der SA-Produktion, die während der gesamten Fermentation beobachtet wurden (Abbildung 4a), was darauf hindeutet, dass die von den Genen im Operon kodierten Enzyme während der gesamten Kultivierungszeit vorhanden sind. In Abbildung 7c ist zu sehen, dass die Transkriptspiegel von aroD und zwf vergleichsweise höher bzw. niedriger sind als die der anderen vier Gene im Operon. Diese Beobachtung sollte mit Vorsicht erfolgen, da die sechs Gene im Operon mit denen im Chromosom des Referenzstamms AR3E verglichen werden. Da die erhaltenen Werte für die sechs Gene zwischen ihnen nicht normalisiert sind, können Variationen ihrer chromosomalen Expression in Stamm AR3e die relativen Vergleiche mit Stamm AR36 verändern. Dennoch stimmen die transkriptomischen Daten mit dem hohen Verhältnis von SA zu aromatischen Zwischenprodukten überein, das unter den getesteten Bedingungen erhalten wurde, was zu erwarten ist, wenn alle Gene im Operon ausreichend exprimiert wurden. Zusammen mit kinetischen und stöchiometrischen Daten unterstreichen diese Ergebnisse die Vorteile der Verwendung eines konstitutiv exprimierten synthetischen Operons als alternative Strategie zur Erhöhung der Ausbeute an SA aus Glc in einem entwickelten Stamm, dem PTS und pykF fehlen.