a) El ciclo de vida sexual de Chlamydomonas reinhardtii consiste… / Descargar Diagrama Científico

… la naturaleza de las sustancias genéticas que desafiaron la ley de Mendel. Amplios estudios realizados a lo largo del siglo pasado, utilizando numerosas técnicas, incluida la microscopía electrónica, la genética, la biología molecular y la bioquímica, han revelado que las sustancias genéticas son, de hecho, genomas dentro de cloroplastos y mitocondrias (Kuroiwa 1991; Birky 1995). Se cree que los cloroplastos (cp) y las mitocondrias (mt) surgieron de relaciones endosimbióticas ancestrales entre células nucleadas y bacterias de vida libre, cianobacterias y bacterias alfa púrpura, respectivamente. Contienen sus propios genomas, que son presumiblemente vestigios de sus progenitores (Gray 1992). Hoy en día, sabemos que los genes cp y mt se transmiten a la progenie únicamente del padre materno en los diversos taxones de plantas superiores, helechos, musgos, algas (Kuroiwa 1991), hongos (Mitchell y Mitchell 1952; Kawano et al. 1987), y animales (Hutchison et al. 1974), incluidos los humanos. Durante mucho tiempo se pensó que la herencia uniparental de los genomas cp/mt era un resultado pasivo basado en el hecho de que los huevos contienen múltiples números de orgánulos, mientras que los gametos masculinos, en el mejor de los casos, contribuyen solo unos pocos (Gyllensten et al. 1991). Sin embargo, es probable que el proceso de herencia uniparental sea más dinámico. Un ejemplo clásico y llamativo sería la aparición de herencia no mendeliana en el alga verde unicelular Chlamydomonas reinhardtii, que produce gametos de tamaños idénticos (isógamos) (Sager 1954). El ciclo de vida de C.reinhardtii es exquisitamente simple. Hay dos tipos de apareamiento de C. reinhardtii, tipo de apareamiento más (mt+) y tipo de apareamiento menos (mt), controlados por un único loci de tipo de apareamiento complejo en el grupo de enlace VI (Ferris et al. 2002). C. reinhardtii experimenta un ciclo de vida sexual, que incluye etapas definidas de diferenciación (Figura 1). Las células vegetativas se diferencian en gametos en condiciones de inanición de nitrógeno e irradiación de luz(Pan et al. 1996). A los pocos minutos de mezclarse, los gametos de tipos de apareamiento opuestos se adhieren entre sí por sus flagelos y se fusionan para formar cigotos. Después de un período obligatorio de latencia, el cigoto sufre meiosis y germinación para producir cuatro progenie haploide. Más del 90% de la progenie que se forma heredan rasgos de cloroplastos (pc), preferentemente del padre mt+, un fenómeno descrito por primera vez hace más de 50 años (Sager 1954). Sager describió los patrones de herencia de dos mutaciones inducidas por UV, sr1 y sr2 . La mutación sr1 confiere resistencia a niveles bajos del antibiótico estreptomicina, y la mutación sr2 confiere resistencia a niveles altos de estreptomicina. Cuando el sr1 se cruzó a una cepa sensible a la estreptomicina, se heredaron bajos niveles de resistencia a la estreptomicina, siguiendo la ley de Mendel. Por el contrario, cuando un progenitor con mt+ que portaba la mutación sr2 se cruzó a un progenitor con mt sensible, toda la progenie meiótica era resistente a altos niveles de estreptomicina. En el cruzamiento recíproco, la progenie meiótica era sensible a la estreptomicina (Sager 1954). En 1962, la evidencia de la existencia de ADNcp provino del trabajo de microscopía de luz y electrónica de Ris y Plaut (Ris y Plaut 1962). Solo un año después, Sager e Ishida describieron el aislamiento del ADNcp mediante centrifugación de gradiente de densidad de cloruro de cesio (CsCl) (Sager e Ishida 1963). En 1989, se demostró que la mutación sr2 se localizaba dentro del gen rps12 del genoma cp (Liu et al. 1989). En 1972, un estudio bioquímico mostró que la cantidad de ADNc – mt disminuyó en relación con el ADNc-mt+, 6-24 h después del apareamiento (Sager y Lane 1972). El ADN de los gametos mt+ y mt – se etiquetó con 14 N – o 15 NH 4 Cl, y se utilizó centrifugación de gradiente de densidad CsCl para monitorear el destino del ADN nuclear y el adNPC en cigotos de 6 y 24 horas. Seis horas después del desarrollo del cigoto, la señal que representaba el ADNc – mt fue claramente inferior al ADNc-mt+, lo que indica una reducción preferencial del ADNc – mt en relación con el ADNc-mt+. En 1980, Grant et al.proporcionaron la primera evidencia molecular de la reducción preferencial del ADNc – CPT de mt. (Grant et al. 1980). Los autores monitorearon el comportamiento de mt + y mt – cpDNA, aprovechando los polimorfismos de longitud de fragmento de restricción (RFLPs), en una cepa mutante de C. reinhardtii ac-u-g-23 que lleva dos pequeñas deleciones en su ADN de cloroplastos. Los autores encontraron que tanto las eliminaciones en el adNPC como el fenotipo no fotosintético se heredaron de forma uniparental. El genoma de cloroplastos de 203 kb de C. reinhardtii (Maul et al. 2002) está presente en ~80-100 copias por célula, y se organiza en 5-10 complejos de proteínas de ADN, que se llaman nucleoides de cloroplastos(Kuroiwa et al. 1981). En 1982, Kuroiwa et al. se encontró que los nucleoides mt-cp teñidos con DAPI (dsDNA específico de fluorocromo, 4′,6-diamidino-2-fenilindol) desaparecieron preferentemente en cigotos jóvenes dentro de los 50 minutos de apareamiento (Kuroiwa et al. 1982). En 1999, se observó la desaparición preferencial de nucleoides mt – cp en un cigoto vivo, utilizando SYBR Green I (fluorocromo específico de dsDNA que puede penetrar en las células vivas) (Figura 1) (Nishimura et al. 1999). La interpretación de este dramático fenómeno, sin embargo, fue controvertida porque la desaparición preferencial de nucleoides fluorescentes mt – cp ocurrió mucho antes de que se detectara la reducción de ADN por métodos bioquímicos o biológicos moleculares (6-24 h después del apareamiento) (Sager y Lane 1972). Se propusieron dos posibilidades principales para explicar esto. Una posibilidad era que la desintegración de cp nucleoides podría conducir a la dispersión de cpDNA moléculas, y la segunda posibilidad era que la rápida digestión de cpDNA moléculas pueden conducir a la desaparición de cpDNA nucleoides. Un problema al abordar esta pregunta es que la reacción de apareamiento se realiza utilizando millones de gametos mt+ y mt – (Figura 2). La población celular es inevitablemente una mezcla heterogénea de células, como gametos mt+ y mt – no emparentados, cigotos con o sin nucleoides mt – cp, y cigotos meitóticos excepcionales (1~5%) que no forman cigotos meitóticos (Ebersold 1967). En general, los métodos moleculares y bioquímicos requieren grandes cantidades de muestras homogéneas para análisis precisos, y cualquier heterogeneidad en las muestras confundiría los resultados. En otras palabras, las “personalidades” de células u orgánulos individuales dentro de una población se diluirían y probablemente se perderían en el proceso de análisis. Por otro lado, la microscopía puede revelar las “personalidades” a nivel morfológico, pero no a nivel molecular. Para estudiar la condición de las moléculas de adNPC durante la desaparición de nucleoides de mt – cp, fue necesario recolectar cigotos en función de la presencia o ausencia de nucleoides de mt – cp, y analizar los cigotos individuales utilizando técnicas biológicas moleculares. Para ello se emplearon pinzas ópticas (Figura 3). El uso de pinzas ópticas es una técnica novedosa para manipular células vivas u orgánulos bajo observación microscópica directa(Ashkin et al. 1987). En este estudio, se recolectó un solo cigoto con o sin nucleoides de cp con pinzas ópticas, y la presencia o ausencia de moléculas de ADNcp – mt se determinó mediante análisis de PCR anidado. Los destinos individuales de mt+ y mt – ADNCPC cigótico se siguieron por separado utilizando un transformador de cloroplastos LO3c, que alberga el gen bacteriano aadA (aminoglucósido adenil transferasa). Los cigotos individuales que se obtuvieron con las pinzas ópticas se sometieron a un análisis de PCR anidado altamente sensible para aadA (Figura 4) (Nishimura et al. 1999). Cuando los gametos mt + L03c se cruzaron con gametos mt de tipo salvaje, se detectaron secuencias de genes aadA en todos los cigotos examinados. Por el contrario, cuando los gametos mt L03c se cruzaron con gametos de tipo salvaje, las secuencias aadA solo se amplificaron en cigotos más jóvenes (10 y 30 minutos después de la formación del cigoto). Después de que desaparecieran los nucleoides fluorescentes mt-cp, las secuencias aadA ya no se detectaron en los cigotos (90 y 120 minutos después de la formación del cigoto). Estos resultados indican que las moléculas de mt – cpDNA se digieren completamente en 10 minutos, durante los cuales los nucleoides de mt – cp desaparecen, y también que al menos una nucleasa altamente efectiva se activa en el cloroplasto de mt justo después de la formación de cigotos. Esta digestión activa del ADNc – MT es probablemente la base de la herencia materna del ADNc-MT. El modelo más simple para la herencia uniparental del ADNcp es que el proceso consiste en dos eventos distintos que probablemente ocurran en diferentes etapas del ciclo de vida: una “protección” de ADNcp+ mt, quizás durante la gametogénesis, y un “destructor” de ADNcp – mt no protegido durante el desarrollo temprano del cigoto. A) Hipótesis de restricción-metilación En 1972, Sager y sus colegas propusieron que el ADNc – mt era digerido por la acción de enzimas de restricción, mientras que el ADNc – mt+ estaba protegido por metilación, un modelo análogo al sistema de restricción-metilación bacteriana (Sager y Lane 1972). Sager y sus colegas acumularon rápidamente pruebas convincentes que muestran un aumento en el nivel de metilación de mt+ adNPC, que se detectó 7 h después del apareamiento (Burton et al. 1979; Royer y Sager 1979; Sano et al. 1980). Además, se ha informado de la purificación de metiltransferasas de ADN específicas de gametos mt+, con pesos moleculares de 60 kDa y 20 kDa (Sano et al. 1981). Este evento de metilación específico de mt+ gametos fue aparentemente reversible, como se esperaría para la protección(Sano et al. 1984). El gen de la metiltransferasa de ADN residente en cloroplastos se identificó finalmente en 2002, y se confirmó su expresión específica de gametos mt+ y localización de cloroplastos(Nishiyama et al. 2002). Por otro lado, una serie de artículos de grupos independientes han argumentado posteriormente que la metilación de mt+ adNPC no podía explicar adecuadamente la protección. Bolen et al. aisló un mutante nuclear me1 que metila constitutivamente el ADNcp a un nivel más alto en células mt+ y mt – (Bolen et al. 1982). Cuando se utilizaron gametos me1 para cruces, se observaron patrones de herencia uniparental normales, inconsistentes con el…