Actividad clastogénica de 2-clorodeoxiadenosina en células somáticas de mamíferos
MUTAGÉNESIS
ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN
Actividad clastogénica de 2-clorodeoxiadenosina en células somáticas de mamíferos
Gilmara Ausech AntonucciI; Catarina Satie TakahashiI, II
Iuniversidad de Sao Paulo, Facultad de Medicina de Ribeirao Preto, Departamento de Genética, Ribeirao Preto, SP, Brazil
Iiuniversidad de Sao Paulo, Facultad de Filosofía Ciencias y Letras de Ribeirao Preto, Departamento de Biología, Ribeirao Preto, SP, Brazil
Correspondence
ABSTRACT
the base analogue 2-chlorodeoxyadenosine (2-CDA) used for therapy in chronic resistant and advanced Lymphoproliferative disorders, is cytotoxic for both dividing and non-dividing lymphocytes. El presente trabajo evaluó el potencial clastogénico de este fármaco in vitro en linfocitos humanos en cultivo e in vivo en células de médula ósea de ratones BALB/c. En linfocitos humanos, se estudió el efecto clastogénico de 2-CdA en las fases G1, S y G2 del ciclo celular, utilizando tres concentraciones diferentes (10, 20 y 40 mg/ml). Las variables analizadas incluyeron el índice mitótico( IM), el índice de proliferación (IP), el intercambio de cromátidas hermanas (SCE) y la aberración cromosómica (AC). El análisis estadístico por una prueba de varianza (ANOVA) mostró un aumento significativo (p < 0.05) en frecuencias de AC para células tratadas durante la fase S, pero el IM no varió. Las concentraciones analizadas no produjeron un aumento significativo de la frecuencia media de SCE, ni cambiaron la PI celular en las fases G1 y S. Las concentraciones analizadas in vivo fueron de 0,25, 0,375 y 0,5 mg / kg de peso corporal. En este ensayo, no se observaron alteraciones en las frecuencias de AC e IM a las dosis analizadas. Por lo tanto, los resultados indican un efecto clastogénico de 2-CdA en cultivos de linfocitos humanos.
Palabras clave: linfocitos humanos, 2-CdA, aberraciones cromosómicas, SCE, ciclo celular.
Introducción
Los análogos de purina son muy activos en el tratamiento de trastornos linfoproliferativos (Pott-Hoeck y Hiddemann, 1995). La cladribina, 2-clorodeoxiadenosina (2-CdA), es un análogo de nucleósidos con un átomo halógeno reemplazado en la posición 2 en su anillo de purina, lo que confiere resistencia a la desaminación por adenosina desaminasa (ADA). El 2-CdA es un fármaco de elección en el tratamiento de la leucemia de células pilosas, pero también es altamente eficiente en otras neoplasias linfoides malignas de bajo grado, incluida la leucemia linfocítica crónica (LLC). Los informes de la bibliografía han mostrado que la 2-AcD proporciona una tasa de respuesta completa (RC) y una tasa de respuesta general (OR) similares a la fludarabina, pero la influencia de ambos fármacos en las tasas de supervivencia de los pacientes con LLC es aún incierta. La tasa de RC inducida por 2-CD es significativamente más alta que en los pacientes tratados con quimioterapia convencional (Robak, 2001). El 2-CdA es otro nuevo análogo de purina quimioterapéutico, con toxicidad específica para los linfocitos (Schrimer et al., 1997). La citotoxicidad ocurre en células que proliferan y quiescentes, lo que resulta en eventos como la inhibición de la síntesis de ADN y proteínas, así como la inducción de apoptosis (Robertsson et al., 1993). A pesar de la toxicidad, se han obtenido buenos resultados en la respuesta terapéutica, y este medicamento es la principal opción en el tratamiento de tricoleucemia donde los pacientes muestran leucemia de células pilosas (HCL) (Tallman et al., 1992; Tallman et al., 1993).
Los desoxinucleósidos de adenina inducen apoptosis en linfocitos quiescentes y son medicamentos útiles para el tratamiento de enfermedades linfoproliferativas de crecimiento lento. Se han propuesto varios mecanismos para explicar la toxicidad de la desoxiadenosina y sus análogos en células quiescentes, incluida la unión directa de dATP al factor pro-apoptótico Apaf-1 y la activación de las vías caspasa-9 y -3 (Genini et al., 2000).
Un paciente con leucemia mieloide aguda tratado con 2-CdA y Ara-C presentó recuperación medular tardía, sinusitis y sepsis por Candida tropicalis. Desarrolló insuficiencia multisistémica de órganos y murió 1 mes después de iniciar el tratamiento para la LMA. La autopsia, limitada al tórax y el abdomen, reveló candidiasis diseminada que afectaba los pulmones, el corazón, el hígado, los riñones y el bazo (Mathew et al., 2000).
Zwaan et al. (2002) observaron que los pacientes con t (9:11) parecían ser significativamente más sensibles que otros pacientes con LMA a los siguientes fármacos: citarabina (mediana: 2,9 veces), doxorrubicina (4,5 veces), mitoxantrona (8,0 veces), 2-clorodeoxiadenosina (10,0 veces).
Los análogos de nucleósidos (NA), como el arabinósido de citosina, la fludarabina, la cladribina y la gemcitabina, son componentes esenciales de la terapia de inducción de LMA (Leucemia Mieloide Aguda); también son eficaces para tratar trastornos linfoproliferativos y se han utilizado en el tratamiento de algunos tumores sólidos. Estos importantes compuestos comparten algunas características comunes, a saber, en términos de necesidad de transporte por transportadores de membrana específicos, y metabolismo e interacción con dianas intracelulares. Sin embargo, difieren en cuanto a los tipos de transportadores y su interacción preferencial con ciertas dianas que pueden explicar la efectividad contra los tumores de rápida proliferación (Galmarini et al., 2001).
Teniendo en cuenta esta información, es importante evaluar el potencial clastogénico del 2-CdA, sobre la base de informes de que este fármaco induce citotoxicidad (Tallman et al., 1992; Tallman et al., 1993) y DNA single-strand breaks (Liliemark y Juliusson, 1994). El objetivo de este estudio fue evaluar la capacidad de este agente quimioterapéutico para inducir daño cromosómico en linfocitos humanos y células de médula ósea de ratones BALB/c.
Materiales y Métodos
Agente químico
La 2-clorodesoxiadenosina antitumoral fue proporcionada amablemente por el Centro de Quimioterapia del Hospital de Clínicas de la Facultad de Medicina de Ribeirão Preto (USP) para los experimentos in vitro e in vivo.
Linfocitos de sangre periférica humana
Se obtuvieron muestras de sangre de seis voluntarios sanos no fumadores (tres mujeres y tres hombres), de 25 a 35 años de edad, sometidos a tratamiento durante las fases G1, S y G2 del ciclo celular, para analizar la anormalidad cromosómica (AC) y el índice mitótico (IM). Además, se utilizaron linfocitos de tres individuos (dos mujeres y dos hombres) para el análisis del intercambio de cromátidas hermanas (SCE) y el índice de proliferación (IP). Los linfocitos se cultivaron en un medio RPMI-1640 al 78% (Sigma Chemical Co., San Louis, EE.UU.) suplementado con suero fetal de ternera al 20% (Cultilab, Brasil) y agregado con penicilina (5 mg/ml) y estreptomicina (10 mg/ml). Las células fueron estimuladas con un 2% de fitohemaglutinina (Life Technologies, Grand Island, NY). Por cada 5 mL de medio de cultivo se añadió 1 ml de plasma, y los cultivos se incubaron a 37 °C durante 52 h para el análisis de CA. Las soluciones de 2-CdA se diluyeron en agua desionizada en las siguientes concentraciones: medio de cultivo de 10, 20 y 40 mg/ml, según Preston et al. (1987). Se incluyó un control negativo en todos los experimentos. La preparación y tinción de los portaobjetos se realizaron mediante técnicas estándar (Moorhead et al., 1960). Se obtuvieron láminas para el análisis del intercambio de cromátidas hermanas (SCE) y el índice de proliferación (IP) de cultivos paralelos a los que 5-Bromo-2′-desoxiuridina (Sigma Chemical Co. En saint Louis, estados UNIDOS; 10 mg/mL) se añadió además 2-CdA. La tinción diferencial de cromátidas hermanas se obtuvo mediante la técnica de fluorescencia más Giemsa, utilizando Hoechst 33258 (Calbiochem – Behring Corp. ; solución de Hank de 0,05 mg/ml) y Giemsa al 5% (Merck). Este método es una modificación de los publicados por Korenberg y Freedlender (1974) y Perry y Wolff (1974). Los portaobjetos se exponían a luz blanca durante la noche. Se analizaron preparaciones metafásicas con 46 ± 1 cromosomas en una prueba a ciegas. Los cromosomas se dibujaron esquemáticamente para la puntuación de SCE, así como para el análisis de CA.
Protocolos de tratamiento
Tratamiento con 2-CdA de cultivos de linfocitos en diferentes fases del ciclo celular
Aberraciones cromosómicas (CAs)
Después de siete horas de inicio del cultivo (fase G1), los cultivos de linfocitos se trataron con 2-CdA durante 1 h a 37 °C en medio de cultivo sin suero. Las células se fijaron 52 h después del inicio del cultivo. Después del tratamiento con 2-CdA, las células se lavaron dos veces en medio libre de suero y se reincubaron en medio completo. Para el tratamiento en fase S, se trataron 24 cultivos h con 2-CdA durante 6 h. Las células se lavaron dos veces en medio libre de suero, se reincubaron en medio completo y se fijaron después de 52 h de incubación. Para el tratamiento de la fase G2, se trataron 69 cultivos h con 2-CdA durante 3 h, y las células se fijaron después de 72 h de incubación. Se añadió colchicina (Merck 0,016%) 1,5 h antes de la fijación. Para determinar el IM, se puntuaron 1000 células por cultivo y se analizaron 100 metafases de cada cultivo para la AC, totalizando 6000 células y 600 metafases, respectivamente, para cada tratamiento.
Intercambios de cromátidas hermanas (SCE)
Se trataron cultivos de linfocitos de 4 donantes sanos (dos hembras y dos machos) con 5-BrdU (10 µg/mL) al comienzo de la incubación, y cuando las células alcanzaron la fase G1 (7 h después del inicio del cultivo), se añadieron 2-CdA más 5-BrdU durante 1 h a 37 °C en medio de cultivo sin suero. Después del tratamiento, las células se lavaron dos veces en medio libre de suero, se añadió de nuevo 5-BrdU y luego las células se reincubaron en medio completo. Para el tratamiento en la fase S, se trataron cultivos de 24 h con 2-CdA más 5-BrdU en medio libre de suero durante 6 h. Después del tratamiento, las células se lavaron dos veces en medio libre de suero y se reincubaron en medio completo con 5-BrdU. Para el análisis de SCE y PI, las células (fases G1 y S) se fijaron 72 h después del inicio del cultivo. Se puntuaron cincuenta metafases de segunda división por cultivo para SCE y cien metafases de cada cultivo para primera, segunda y tercera división celular, totalizando 200 metafases y 400 células por tratamiento, respectivamente. El PI se obtuvo utilizando la siguiente ecuación:
PI =
donde M1 y M3 son los números de las metafases de primera y tercera división, respectivamente (Degrassi et al., 1989).
Animales
Los animales utilizados fueron ratones BALB / c (Mus musculus), obtenidos de la Casa de Animales de la Escuela de Medicina de Ribeirão Preto.
Ensayo in vivo con células de médula ósea de ratones Balb/c
Los ratones con un peso aproximado de 30 g (5-6 semanas) se dividieron en grupos de 8 animales (4 machos y 4 hembras) y se trataron mediante inyección intraperitoneal con 0.5 ml / volumen final de solución de 2-CdA diluida con agua destilada en las siguientes concentraciones: 0,25, 0,375 y 0,5 mg / kg de peso corporal. Veintidós horas después del tratamiento (es decir, dos horas antes del sacrificio), se inyectó a los ratones 0,3 ml/volumen final de una solución de colchicina al 1% (Sigma) y se los mató por inhalación de éter 2 h más tarde. El grupo de control negativo recibió agua destilada 0,5 ml / volumen final / animal, y el grupo de control positivo recibió ciclofosfamida (PC), 25 mg/kg de peso corporal. Los preparados de médula ósea para células metafásicas se obtuvieron mediante la técnica estándar (Ford y Hamerton, 1956). Los portaobjetos se analizaron a ciegas y se dibujaron esquemáticamente 100 metafases por animal. El IM se obtuvo contando el número de células mitóticas en 1000 células analizadas por animal, y se puntuaron 100 células para AC.
Análisis estadístico
Se realizó un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) sobre el número de metafases anormales y el número total de CA, MI, SCEs y PI, con cálculos de los valores de P para cada fase del ciclo celular. Siempre que p < 0.se encontró 05, los valores medios de cada tratamiento fueron comparados por la prueba de Student-Newman Keuls. El análisis estadístico se realizó utilizando los paquetes de software Sigma Stat (Jandel Corporation).
Resultados
Linfocitos humanos
Los linfocitos de sangre periférica se trataron con diferentes concentraciones (10, 20 y 40 mg/ml) de 2-CdA en las fases G1, S y G2 del ciclo celular. Se analizaron las aberraciones cromosómicas (AC) y el índice mitótico (IM) en linfocitos tratados de seis individuos sanos (tres mujeres y tres hombres) (Tabla 1). Para las células tratadas durante la fase S, se observó un aumento significativo en las frecuencias de CA (p < 0,05) en todas las concentraciones, en comparación con las frecuencias de control. Los tipos más comunes de aberración cromosómica observados fueron brechas cromátidas e isocromáticas (datos no mostrados) y roturas, seguidas de minutos dobles, fragmentos dobles y fragmentos individuales. Para las células tratadas durante las fases G1 y G2, las frecuencias de CA no mostraron ninguna diferencia estadísticamente significativa entre los cultivos tratados y los valores de control. Aunque hubo una ligera variación para el IM, no se observó una diferencia estadísticamente significativa (p < 0,05) en ninguno de los tratamientos en relación con los índices de control.
Las frecuencias medias de intercambio de cromátidas hermanas (SCE) e índice de proliferación (IP) se determinaron en cuatro controles y en cultivos de linfocitos tratados con 2-CdA durante las fases G1 y S en cultivos cosechados después de 72 h (Tabla 2). Las concentraciones analizadas (10, 20 y 40 mg/ml) no provocaron un aumento significativo de la frecuencia media de SCE, ni modificaron la PI celular durante las fases G1 y S (Tabla 2).
Sistema de médula ósea de ratón Balb/c
Se analizaron las frecuencias de CA y MI en células de médula ósea de 8 ratones Balb/c (4 hembras y 4 machos) después de un tratamiento intraperitoneal con 0,25, 0,37 y 0,50 mg/kg de peso corporal de 2-CdA (Tabla 3). En el ensayo in vivo, el 2-CdA no mostró efectos citotóxicos para ninguna de las dosis analizadas en relación con las frecuencias de AC ni con los valores de IM, cuando se compararon todos los grupos de tratamiento. La mayoría de las aberraciones fueron cromátidas tipo de saltos. No se encontró diferencia significativa (p < 0,05) entre los animales ni entre machos y hembras para los parámetros analizados.
Discusión
En los últimos años, varios estudios han demostrado el efecto antiproliferativo de los fármacos utilizados en el tratamiento de neoplasias linfoides malignas. 2-CdA es un análogo de base empleado en la quimioterapia para un tipo particular de leucemia, la leucemia de células pilosas. También hay algunos datos que demuestran que el 2-CdA se puede usar en combinación con otros fármacos, en el tratamiento del linfoma no Hodgkin (LNH) de bajo grado resistente y recidivante (Laurencet et al., 1999; Robak et al., 1999). En el presente trabajo, se realizó un estudio citogenético in vitro para evaluar el potencial clastogénico de 2-CdA en linfocitos humanos con respecto a la inducción de AC y SCE. De acuerdo con Moore y Bender (1993), el CAS estructural puede resultar en pérdida de material cromosómico. El tipo de CA formado depende de la naturaleza de la lesión inducida en el ADN y de la fase del ciclo celular durante la cual las células fueron expuestas (Natarajan et al., 1996).
Se trataron cultivos de linfocitos con tres concentraciones de 2-CdA (10, 20 y 40 mg/ml) durante diferentes fases del ciclo celular. El efecto clastogénico del fármaco se demostró por el aumento significativo (p < 0,05) en las frecuencias de CA para todas las concentraciones probadas durante la fase S del ciclo celular. Para el tratamiento durante esta fase, se dejó 2-CdA durante 6 horas en los cultivos. Para los agentes que actúan durante una fase específica del ciclo celular, la secuencia de administración puede determinar la eficacia y toxicidad de un tratamiento combinado (Smorenburg et al., 2001).
Estos resultados son consistentes con los reportados por otros autores (Carson et al., 1983), sugiriendo que el 2-CdA se incorpora al ADN produciendo roturas de una sola hebra (SSB). Los SSB pueden surgir tanto directamente, de la desintegración de azúcares dañados, o indirectamente, a través de la escisión enzimática de la columna vertebral del fosfodiéster. Los SSB directos surgen principalmente de un ataque de radicales libres como las especies reactivas de oxígeno, mientras que los SSB indirectos son principalmente intermedios normales de la reparación de escisión de bases de ADN (BER). Los SSB también son las lesiones más comunes inducidas por genotoxinas exógenas, como la radiación ionizante, los agentes alquilantes y la camptotecina venenosa topo1 y sus derivados anticancerosos (Caldecott, 2004).
Algunos informes muestran que el análogo de base necesita un período de tiempo más largo para que ocurra la fosforilación (Gandhi et al., 1997). Este mecanismo puede explicar el aumento de la frecuencia de aberraciones cromosómicas totales durante la fase S del ciclo celular. El mismo mecanismo ocurre en las células tratadas con mitomicina C, un compuesto dependiente de S, que requiere la replicación del ADN para convertir los daños del ADN en aberraciones cromosómicas (Evans y Scott, 1964; Traganos et al., 1980). Otros agentes antitumorales representan el mismo mecanismo y acción de la 2-CdA, como la fludarabina y la 1-b-D-arabinosilcitosina (ara-C).
Los análogos de nucleósidos citotóxicos tienen un amplio uso clínico. Se encontraban entre los primeros agentes quimioterapéuticos utilizados en el tratamiento de enfermedades malignas. Los nucleósidos anticancerosos incluyen análogos de los nucleósidos fisiológicos de pirimidina y purina. Estos agentes actúan como antimetabolitos, compitiendo con nucleósidos naturales durante la síntesis de ADN o ARN y como inhibidores de enzimas celulares clave(Szafraniec et al., 2004), son específicos de S, y deben ser fosforilados para activar trifosfatos (Plunkett et al., 1980). Durante la fase S del ciclo celular, cuando el material genético es duplicado por la maquinaria de replicación del ADN, las células son especialmente vulnerables al insulto genotóxico. Mientras que los puntos de control G1 y G2/M detienen la progresión del ciclo celular en puntos bien definidos a través de la inhibición de las quinasas dependientes de ciclinas, se sabe que los puntos de control intra-fase S ocurren en cualquier momento dentro de la fase S e involucran múltiples vías de señalización (Sidorova y Breeden, 2003; Andreassen et al., 2003)
Es muy importante analizar el mecanismo de respuesta al fármaco durante las diferentes fases del ciclo celular. El alto nivel de lesión cromosómica puede deberse a la citotoxicidad de 2-CdA causada por su conversión a 2-CdATP, que induce la inhibición de la síntesis y reparación del ADN, involucrando las enzimas ribonucleótido reductasa y ADN polimerasas. Este compuesto muestra resistencia a la actividad de la adenosina desaminasa (ADA), que es conferida por un átomo de cloro y el reemplazo de hidrógeno en la posición 2 del anillo de purina adenosina (Baltz y Montello, 1993).
A menudo se consideran parámetros para evaluar la genotoxicidad, ya que su frecuencia aumenta claramente por la exposición a muchas sustancias químicas mutagénicas y carcinógenas. En el presente experimento, las frecuencias de SCE en cultivos tratados con 2-CdA presentaron un ligero aumento en relación a los cultivos control. El aumento observado durante ambas fases no varió significativamente.
Dado que muchos fármacos se activan después de ser metabolizados, se recomiendan pruebas de mutagenicidad in vivo para evaluar la actividad clastogénica de los compuestos que requieren activación metabólica. Este enfoque también proporciona condiciones similares a las que se encuentran en los seres humanos (Legator y Ward Jr., 1991). Aunque existen diferencias entre los roedores y los seres humanos, se recomienda que cualquier evaluación se base en estudios tanto in vitro como in vivo, y no simplemente en ninguno de ellos (Huggett et al., 1996).
En el presente estudio, también se analizó el efecto clastogénico de 2-CdA en células de médula ósea de ratones BALB/c a concentraciones de 0,25, 0,375 y 0,5 mg / kg de peso corporal. Los resultados mostraron que el 2-CdA no era eficiente para inducir aberraciones cromosómicas. La falta de efecto in vivo puede deberse a la cantidad limitada de 2-CdA disponible, ya que fue donado en condiciones diluidas. Se han notificado efectos genotóxicos del análogo de base gemcitabina en células de médula ósea de ratón utilizando los sistemas de prueba de micronúcleos y de aberración cromosómica. Aydemir y Bilaloglu (2003) mostraron que la gemcitabina no inducía ningún CAs significativo ni causaba una reducción del IM en un período de tratamiento de 6 horas a dosis de 2,0, 4,0 y 8,0 mg / kg de peso corporal, en comparación con el control negativo; por el contrario, la frecuencia de CAs total aumentó significativamente con gemcitabina (p < 0,0001) en un periodo de tratamiento de 24 horas con las mismas dosis.
En conclusión, el 2-CdA mostró un efecto clastogénico en cultivos de linfocitos humanos tratados in vitro durante la fase S del ciclo celular, pero no se observó un efecto clastogénico significativo en las células tratadas durante las fases G1 y G2. En el ensayo in vivo en ratones, el 2-CdA no mostró ningún efecto clastogénico a las dosis analizadas.
Agradecimientos
Agradecemos al Prof. Dr. A. T. Natarajan, Dr. Elza T. Lusania G. Antunes por sus valiosos comentarios sobre el manuscrito y al Sr. Luiz Augusto da Costa Jr., al Sr. Silvio A. dos Santos y a la Sra. Sueli A. Neves por su valiosa asistencia técnica. El proceso CAPES y FAPESP n. 99/10643-7 apoyó esta investigación. El Comité de Ética en Investigación aprobó el proyecto (Proceso: CONEP n. 25000.074430/2001-88).
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