Análisis genómico de la unión de condensina en Caenorhabditis elegans

Las condensinas I y II comparten las dos subunidades SMC MIX-1 y SMC-4, y se distinguen por tres subunidades no SMC (Figura 1A). La condensina IDC difiere de la condensina I en una sola subunidad, la variante DPY-27 de SMC-4. Utilizamos uno o dos anticuerpos diferentes contra cada subunidad de condensina para ChIP-seq e identificamos los sitios de unión comunes en múltiples anticuerpos y réplicas biológicas (Archivo adicional 1: Tabla S1). La validación de anticuerpos y las interacciones esperadas de co-inmunoprecipitación del holocomplejo de condensina se presentan en el archivo Adicional 2. Correlación en pares de las puntuaciones medianas de enriquecimiento de chips de las subunidades de condensina agrupada I-IDC y II por separado, confirmando la distribución de subunidades individuales entre los tres tipos de condensina (Figura 1B).

Los patrones de unión de alta resolución de los tres complejos de condensación son similares

C. la condensina elegans I y II tienen localizaciones cromosómicas parcialmente superpuestas pero diferentes en mitosis y meiosis ,y la condensina IDC está dirigida específicamente a la X. Por lo tanto, esperábamos encontrar diferentes patrones de CHIP-seq para condensina I, IDC y II. En cambio, los patrones de unión de las subunidades de condensina I, IDC y II fueron generalmente similares (Figura 1C). Esta similitud no se debió a la reactividad cruzada de anticuerpos, porque el anticuerpo HCP-6, que no muestra ninguna reactividad cruzada y no inmunoprecipita ninguna subunidad de condensina I-IDC , mostró una extensa co-localización con las subunidades de condensina I-IDC (ver HCP-6 en la Figura 1C). Además, si la superposición de condensina II se debió a la reactividad cruzada con condensina IDC, habríamos esperado un enriquecimiento de los sitios de unión de condensina II en la X, lo que no fue el caso (Figura 1D). En comparación con la condensina II, las subunidades IDC de condensina consistentemente tuvieron puntajes de ChIP más altos en la X, lo que sugiere una diferencia en la asociación cromosómica de los dos complejos de condensina capturados por ChIP (observe las diferentes escalas en X y cromosoma I en la Figura 1C). Desde que realizamos ChIP-seq en embriones en estadio mixto, la mayoría de las células (más del 95% estimado por tinción de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)) estaban en interfase. La falta de subunidades de condensina I en autosomas (Figura 1C y archivo Adicional 3: Figura S1A) y la observación previa de que la condensina I se localiza en los cromosomas mitóticos después de la ruptura de la envoltura nuclear sugieren que la mayor parte de la señal ChIP-seq proviene de la interfase. En apoyo de esto, se demostró que la condensina II era nuclear durante la interfase , y mostró una distribución más equitativa de los sitios de unión entre todos los cromosomas (Figura 1D).

KLE-2, HCP-6 y CAPG-2 son específicos de condensina II, por lo que representan la unión de condensina II. Condensin I e IDC comparten las tres subunidades que no son SMC, por lo que en adelante nos referiremos a la señal ChIP-seq de DPY-26, DPY-28 y CAPG-1 como de condensin I-IDC. Para centrarnos en los sitios que están enlazados como un complejo, promediamos la señal de ChIP de las subunidades de TAPA específicas de tipo condensina. Además de utilizar datos promediados, verificamos que cada análisis se cumplía con subunidades individuales, y presentamos HCP – 6 y DPY-28 en cifras suplementarias. Identificamos un conjunto de sitios de unión de condensina I-IDC y II de alta confianza seleccionando solo los picos de CHIP-seq que eran consistentes en dos o más subunidades que no son SMC (Figura 1D). Como se señaló anteriormente, el 97% de la unión de condensina I-IDC ocurrió en el cromosoma X. La condensina II se distribuyó de manera similar entre los autosomas y el X. La condensina II se unió a sitios de condensina I-IDC más fuertes en el cromosoma X (Figura 1E y archivo Adicional 3: Figura S1B).

Los sitios de unión de condensina se enriquecen en promotores activos

Para identificar las regiones donde las condensinas se unen preferentemente, analizamos los sitios de unión de condensina con respecto a varias anotaciones genómicas. Los sitios de unión de condensina se enriquecieron significativamente en promotores, genes cercanos a ARNt y ARN no codificantes (Figura 2A, Archivo adicional 4: Figura S2). Para eliminar la posibilidad de que los genes de ARNt unidos a condensina solo se produzcan en promotores, eliminamos los genes de ARNt que se encontraban dentro de 1 kb de un sitio de inicio de transcripción (TSS) y determinamos que la superposición de los sitios de unión de ARNt y condensina seguía siendo significativa (23% y 6% de ARNt se superpusieron con los sitios de condensina I-IDC y II, respectivamente, P = 0,0002). La unión de la condensina en los genes del ARNt sugiere que el reclutamiento de condensina mediado por TFIIIC puede conservarse entre C. elegans y la levadura .

Los sitios de condensina se enriquecen en promotores y ARNt, y la unión se correlaciona positivamente con la transcripción. A) Enriquecimiento o agotamiento de los puntos de unión de condensina en diversas anotaciones genómicas. El enriquecimiento aleatorio y los valores de p se calcularon mediante una prueba de permutación que distribuyó aleatoriamente los picos de condensación 10.000 veces. Tanto para la condensina I-IDC como para la II, hay un enriquecimiento significativo de los sitios de unión con promotores de 1 kb y ARN casi no codificantes (P = 0.0002), agotamiento dentro de los cuerpos genéticos (sitio de inicio de transcripción (TSS) a sitio de final de transcripción (TES)) (P = 0,0002), y no hay enriquecimiento o agotamiento significativo en el 3′ de genes (P > 0,05). (B) La señal de ChIP de condensina está alineada en el TSSs de genes expresados (25% superior por nivel de ARN, líneas sólidas) y genes no expresados (25% inferior por nivel de ARN, líneas discontinuas). Los puntos circundantes representan el nivel de confianza del 95%. Como control, la señal de chip de inmunoglobulina G (IgG) en el TSSs se representa en gris. C) El coeficiente de correlación de rango de Spearman entre la puntuación mediana del ChIP a promotores de 500 pb y el nivel de ARN en los genes respectivos se indican para todo el genoma y el cromosoma X. Existe una ligera correlación positiva entre la unión de condensina y la transcripción. (D) La puntuación mediana de ChIP dentro de 500 pb aguas arriba del TSS se representa contra el nivel de ARN de cada gen. Los genes unidos a promotores de condensina (definidos por superposición con un sitio de condensina dentro de 1 kb del TSS) se resaltan en naranja (condensina I-IDC) y azul (condensina II). E)El contenido de CG de ventanas de 50 pb se representa en las cumbres de condensación I-IDC y II. Como control, se determinó el contenido de CG sobre 1500 coordenadas aleatorias y se trazó de la misma manera que las cumbres de condensación reales. El contenido promedio de GC es alto alrededor del pico de unión de condensina.

La unión fue más alta dentro de los 500 pb del TSS (archivo adicional 5: Figura S3A) y el 45% de los picos de condensina I-IDC y el 62% de los picos de condensina II se ubicaron en los promotores. La unión de condensina en los promotores se correlacionó positivamente con la actividad transcripcional del gen aguas abajo (Figura 2B,C), pero no todos los promotores activos se vincularon (Figura 2D). El análisis de términos de ontología génica de promotores unidos mostró un enriquecimiento leve (1,3 veces) pero significativo (P = 3,5 e-17) para genes con función de desarrollo embrionario (Archivo adicional 6: Tabla S2). Aproximadamente el 20% de los genes altamente expresados (cuartil superior por nivel de ARN) tenían un sitio de unión de condensina II dentro de 1 kb, y alrededor del 70% de los genes del cromosoma X tenían un sitio de unión de condensina I-IDC dentro de 1 kb. Por lo tanto, aunque la actividad transcripcional es importante, no es suficiente explicar la especificidad de la unión de condensina en ciertos promotores.

Notamos que todos los sitios de unión de condensina mostraron un enriquecimiento prominente del contenido de CG en comparación con las regiones circundantes y las coordenadas aleatorias (Figura 2E). En C. elegans, el contenido de CG de los promotores del cromosoma X es mayor que el de los promotores autosómicos . Es posible que un mayor contenido de GC sea una característica de secuencia de ADN para la unión de condensina, y los promotores X evolucionaron para contener un mayor contenido de GC para soportar la unión de condensina IDC.

Los sitios de unión de condensina coinciden significativamente con un subconjunto de factores de transcripción

Para determinar factores adicionales que distinguen a los promotores unidos a condensina, comparamos los sitios de unión de condensina y TF, y encontramos un subconjunto de TFs que se unen a los mismos promotores que las condensinas (Figura 3A). Estudios previos mostraron que múltiples TFs se unen a un conjunto de sitios de unión de alta ocupación (HOT) . Hubo una superposición de 5% y 22% de los sitios de condensina I-IDC y condensina II con sitios CALIENTES, respectivamente (P = 0,0002). La importancia del solapamiento con los SPt siguió siendo la misma cuando se eliminaron los sitios CALIENTES del análisis (archivo adicional 5: Figura S3B). Los porcentajes de superposición para cada FT dependieron del número de sitios de unión, y se muestran en el archivo Adicional 5: Figura S3C. Entre los TFs individuales, encontramos que el 69% de los sitios de condensina II y el 53% de los sitios de LIN-13 se solaparon entre sí, haciendo que LIN-13 fuera el TF superior que se solapó significativamente con la condensina II.

La unión de Condensina II se superpone con factores de transcripción no aleatoriamente, y el análisis de expresión sugiere una función represiva para la condensina II. (A) Los sitios de factores de transcripción de modENCODE se clasifican por el enriquecimiento de pliegues de la superposición con los sitios de unión de condensina. El enriquecimiento de pliegues se determina como la proporción de superposición porcentual en las distribuciones aleatorias observadas en comparación con el promedio de los sitios de condensina 10.000 veces a lo largo del genoma. Los resultados indican que la unión de condensina no es aleatoria con respecto a los sitios de unión de TF. (B) Los diagramas Venn muestran la superposición de los sitios de unión de condensina II con LIN-13 (modENCODE_3342, embriones) y LIN-35 (modENCODE_3925, embriones tardíos) (arriba), con LIN-13 solamente (abajo a la izquierda) y con LIN-35 solamente (abajo a la derecha). La proporción de superposición entre condensina II y LIN-13 y LIN-35 es mayor en los sitios que están ocupados por ambas proteínas. El solapamiento dado representa el número de picos de condensina II que se superponen con los sitios respectivos LIN-13 y LIN-35. C) El enriquecimiento medio de las partículas seq de condensina II, LIN-13 y LIN-35 se traza a lo largo de la cumbre de cada pico de condensina II. Los sitios de unión de condensina II se dividen en cuatro grupos. El grupo superior consiste en sitios de unión de condensina II que se superponen con LIN-13 y LIN-35, el segundo se superpone con LIN-13 solamente, el tercero con LIN-35 solamente y el último grupo no se superpone con LIN-13 ni con LIN-35. Los picos están en disminución ordenados en función de su enriquecimiento de chips. Un gran número de sitios de condensina II muestran un alto enlace de LIN-13, pero no de LIN-35. La unión de condensina II es más fuerte en sitios unidos por LIN-13 y LIN-35. D) Análisis de expresión diferencial (ARN-seq) en larvas heterocigotas nulas kle-2 versus larvas homocigotas en estadio 2/3 (L2/L3). Se muestran las proporciones de genes unidos o no por KLE-2 con aumento o disminución en el nivel de transcripción en mutante homocigoto. Los niveles de transcripción de más genes aumentan proporcionalmente en el mutante kle-2. TF, factor de transcripción.

La Lin-13 tiene un motivo de interacción con la proteína del retinoblastoma (pRb) y funciona en el desarrollo vulvar con el homólogo único de la pRb LIN-35 en C. elegans . En D. melanogaster, la unión de la subunidad dCAPD3 de condensina II a la cromatina se reduce con la mutación pRb . Si, en C. elegans, LIN-13 recluta condensina II a LIN-35, entonces aquellos sitios LIN-13 que también están unidos por LIN-35 (576) deberían solaparse con condensina II más que aquellos sitios LIN-13 que no están unidos por LIN-35 (1,033). La superposición de los sitios coocupados de LIN-13 y LIN-35 con los sitios de condensina II fue solo ligeramente mayor que la de los sitios de LIN-13 sin LIN-35, 60% y 50%, respectivamente (Figura 3B). Por el contrario, la superposición de LIN-35 con condensina II fue mayor en los sitios que también estaban unidos por LIN-13 (45%) en comparación con los sitios no unidos (9%). Esto sugiere que la interacción potencial entre LIN-13 y condensina II es en su mayoría independiente de LIN-35. LIN-35 funciona dentro de un complejo multiproteico conservado llamado DRM en C. elegans (hDREAM en humanos) que también contiene EFL-1 y DPL-1 . Los 555 sitios de unión de DRM que estaban unidos por LIN-13 mostraron una mayor superposición con condensina II (63%) en comparación con los 787 sitios de DRM que no estaban unidos por LIN-13 (13%). Dividimos los sitios de condensina II en cuatro grupos de acuerdo con la superposición del sitio de unión con LIN-13 y LIN-35 (Figura 3C). Esta agrupación indicó que un gran número de sitios de condensina II muestran una alta unión a LIN-13, pero no a LIN-35, lo que sugiere que si el reclutamiento de condensina II mediado por pRb se conserva en C. elegans, la LIN-35 puede depender de la presencia de LIN-13 para el reclutamiento de condensina II.

La mutación de Condensina II causa defectos transcripcionales que sugieren una función represiva

En levadura y D. melanogaster, la condensina ha sido implicada en la represión transcripcional . Un estudio reciente en D. melanogaster indicó que la subunidad de condensina II CAPD3 es necesaria para la activación transcripcional de un grupo de genes peptídicos antimicrobianos . Para entender el papel de la condensina II en la regulación de la transcripción, realizamos ARN-seq en larvas L2/L3 mutantes nulos kle-2. El KLE-2 cargado maternalmente permite que el mutante nulo kle-2 (alelo ok1151) crezca hasta convertirse en adultos estériles. Se comparó la expresión génica en mutantes kle-2 heterocigotos y homocigotos en larvas L2/L3 antes de que proliferara la línea germinal, conteniendo así núcleos de interfase casi en su totalidad. El análisis de expresión diferencial mediante el uso de DESeq2 identificó 356 genes cuya expresión fue significativamente diferente en larvas homocigotas en comparación con larvas heterocigotas (tasa de falso descubrimiento < 5%; los resultados de DESeq2 se presentan en el archivo adicional 7: Tabla S3). La mayoría de los genes expresados diferencialmente aumentaron (70%) en lugar de disminuir (30%) en la expresión. El análisis de términos de ontología de genes no reveló un grupo particular de genes afectados por la mutación KLE-2. Al igual que los datos publicados para el IDC de condensina, no hubo correlación directa entre la unión a KLE-2 y los cambios en la expresión génica. Es importante destacar que entre los 46 genes diferencialmente expresados y unidos a KLE-2, el 83% aumentó en la expresión en comparación con el 67% de los 310 genes que no estaban unidos a KLE-2 (Figura 3D), lo que sugiere que el efecto directo de la unión de condensina II es en gran medida represivo.

Las modificaciones de histonas asociadas con la cromatina abierta se correlacionan positivamente con la unión de condensina

Para comprender el contexto de la unión de condensina en la cromatina, analizamos la relación entre los sitios de unión de condensina y las características de la cromatina mapeadas por modENCODE . Se observó una correlación positiva general entre la unión de condensina y las marcas de cromatina activa. En la levadura, el número de sitios de unión de condensina a lo largo del ciclo celular se correlaciona directamente con la longitud de los cromosomas. El número de C. los sitios de unión de condensina II de elegans no fueron proporcionales a la longitud de los cromosomas (Figura 4A), sino que se correlacionaron positivamente con la longitud de los cromosomas asociados con marcas de histonas activas (Figura 4B). El cromosoma X fue una excepción, quizás debido a los mecanismos de compensación de dosis que alteran su cromatina . La unión de condensina I-IDC y II a través del genoma se correlacionó positivamente con marcas de cromatina abierta como H3K27ac y negativamente con marcas de heterocromatina como H3K27me3 y H3K9me3 (Figura 4C y archivo adicional 8: Figura S4). Esta correlación fue a nivel de todo el dominio (como se analizó en ventanas de 1 kb), ya que no vimos una modificación de histonas en particular que alcanzara su punto máximo en los sitios de condensina en un tipo de análisis de “metageno” (no se muestran los datos). En estudios de inmunofluorescencia, las proteínas del centrómero se solaparon con la unión de condensina II en células mitóticas . No observamos una correlación positiva entre las señales CENP-A y condensina II ChIP-seq en embriones de etapa mixta, lo que sugiere que, en los núcleos de interfase (la mayoría de los núcleos en células embrionarias de etapa mixta), no hay superposición. Alternativamente, dado que CENP-A se une a solo un pequeño subconjunto de regiones positivas CENP-A en el genoma por célula, la superposición de CENP-A con condensina II solo podría ser evidente en células individuales. Para comprender qué factores de cromatina predicen mejor la unión de condensina, utilizamos un enfoque de aprendizaje automático. En C. elegans, H4K20me1 está altamente enriquecido a través del cromosoma X por DCC, y por lo tanto H4K20me1 fue el factor más discriminativo para la unión de condensina IDC (Figura 4D). Para condensina II, las características de cromatina altamente predictivas son H3K27ac y CBP, ambos marcadores de potenciadores activos, lo que sugiere que la unión de condensina se enriquece en potenciadores activos . De los 201 sitios de unión de condensina II que estaban a 2 kb de un TSS anotado, 58 se superpusieron con un sitio de unión CBP (P = 0,0002).

Los factores de cromatina asociados con la cromatina abierta y los potenciadores se correlacionan positivamente con la unión de condensina. A) El número de picos de condensina II se representa en función de la longitud lineal de cada cromosoma. B) El número de picos de condensina II se representa en función de la longitud del cromosoma cubierto por los picos H4K8Ac y H4K16Ac. Una línea de tendencia ajustada a los datos autosómicos indica una correlación positiva (R2 = 0,9). C) La unión de condensina en ventanas contiguas de 1 kb a través del cromosoma X (izquierda) y autosomas (derecha) se correlaciona positivamente con marcas activas (por ejemplo, H3K27ac, H2A.Z) y negativamente con marcas represivas (por ejemplo, H3K27me3, H3K9me3). D) Se aprendió a utilizar un clasificador de conjuntos (bosques aleatorios) para predecir la unión de condensina a través del genoma. Las 20 características principales (entre un total de 92 características, archivo 1 adicional: Tabla S1) con la mayor potencia predictiva se representan para condensina I-IDC (izquierda) y condensina II (derecha) con la característica más importante en la parte superior. Las entidades se clasifican en función de la disminución media de la precisión, que describe la diferencia entre la tasa de error de la clasificación real y la tasa de error después de permutar la entidad, promediada en todos los clasificadores (árboles).

Los motivos de secuencias de ADN enriquecidos en los sitios de unión de condensina muestran características específicas

Aunque la condensina II se une a los sitios de condensina I-IDC en la X, la condensina I-IDC no se une a la mayoría de los sitios de unión de condensina II autosómicos (Figura 1D). Para comprender la especificidad del reclutamiento de condensina IDC y II, buscamos características de secuencia de ADN que distingan la unión de condensina II y condensina IDC. Estudios previos han demostrado que la condensina IDC se recluta primero en aproximadamente 100 sitios y luego se disemina a otros sitios cromosómicos . Se enriqueció un motivo de secuencia de ADN de 10 pb en los sitios de reclutamiento de condensina IDC (Figura 5A) y la mutación del motivo abolió el reclutamiento de condensina IDC en matrices extracromosómicas , lo que indica que el motivo de secuencia de ADN de condensina IDC desempeña un papel importante en el reclutamiento de condensina IDC.

Encontramos un motivo de secuencia de ADN que contiene GCGC que se enriqueció bajo sitios de unión de condensina II (Figura 5A). Es interesante notar que tanto el motivo de condensina II como el de condensina IDC incluían el núcleo de GCGC, pero el motivo de condensina IDC fue extendido por un lado por AGGG, lo que sugiere que la especificidad X del reclutamiento de condensina IDC se logra mediante cofactores que reconocen a AGGG. En todo el genoma, el 11% de los motivos de la condensina II estaban unidos por la condensina II. Por lo tanto, de manera similar a otros TFs (por ejemplo, ), solo una parte de los motivos potenciales de la secuencia de ADN estaban unidos por la condensina II. Otros factores, como la accesibilidad a la cromatina y los cofactores desconocidos, pueden estar involucrados en la especificidad de la unión. De hecho, si tomamos aquellos motivos que estaban en una ventana de 2 kb significativamente enriquecidos para una marca de histona activa, como H4K16ac, el porcentaje de motivos que estaban encuadernados aumentó del 11% al 29%. Además, al igual que el motivo de condensina IDC, que está más agrupado en los sitios enlazados , encontramos que las ventanas genómicas de 1 kb que contenían más de un motivo de condensina II tenían aproximadamente 2,5 veces más probabilidades de estar enlazadas por condensina II, en comparación con las que solo tenían un motivo. Por lo tanto, la agrupación de motivos y el contexto abierto de cromatina ayudan a especificar la selección de los motivos que están encuadernados.

El reclutamiento cromosómico de condensina IDC y condensina II implica reguladores compartidos y distintos. A) Se muestran logotipos de motivos de secuencias de ADN de 10 pb enriquecidos en los sitios de condensación superiores. B) Se muestra la superposición entre los puntos de unión de la condensina I-IDC, la condensina II y el SCC-2. Los números debajo de cada factor indican el número total de sitios de unión. Los números superpuestos se basan en el número de picos SCC-2. (C) Vista de navegador de la Universidad de California en Santa Cruz (UCSC) que ejemplifica la señal SCC-2 ChIP-seq, que en su mayoría está restringida a promotores. D) Unión de SCC-2 y condensina II en un sitio de reclutamiento de condensina IDC bien definido en el X (rex-1). (E) En sdc-2 mutante nulo (TY1072), la unión de condensina I-IDC (DPY-26), condensina II (HCP-6, KLE-2) y SCC-2 disminuye en rex-2 (panel izquierdo), pero permanece en gran medida similar en autosomas (panel derecho). F) Gráfico de caja de la relación de enriquecimiento de chips en sdc-2 mutante versus tipo salvaje dentro de los picos de unión de SCC-2. Los sitios de unión se clasifican como autosomas, en el X con baja unión SDC-2 y alta unión SDC-2. G) Análisis qPCR del enriquecimiento de chips DPY-27 en embriones aislados de adultos alimentados con vectores (control) y iARN PQN-85. El enriquecimiento de chips se expresa en relación con el locus de control negativo. Las barras de error son las desviaciones estándar de tres a cinco réplicas biológicas. ChIP, inmunoprecipitación de cromatina; DCC, complejo de compensación de dosis.

No todos los sitios de unión de condensina II tienen el motivo. En aquellos sitios de condensina II sin el motivo, otros factores pueden ser responsables de la unión. Alternativamente, la baja proporción de sitios de condensina II (27%) que contienen un motivo puede explicarse por la posible propagación de la condensina II después del reclutamiento. No se espera que los lugares de propagación contengan el motivo. Por ejemplo, en el caso de la condensina IDC, un alto porcentaje de posibles sitios de reclutamiento (56%) contienen el motivo, pero no los sitios de propagación (8%) . Es necesario realizar un análisis sistemático de la capacidad de captación de los emplazamientos de condensina II identificados para hacer frente a la posible propagación.

SDC-2 es necesaria para la unión de condensina I-IDC, condensina II y el cargador de cohesina a los sitios de reclutamiento de DCC cromosómicos X

En metazoos, las proteínas que participan en el reclutamiento de condensina a los cromosomas no se comprenden bien. En la levadura, la unión de la condensina se superpone con la del complejo de carga de cohesina Scc2/4, lo que aumenta la asociación de la condensina con los cromosomas . Para comprobar si el solapamiento con Scc2/4 se conserva entre la levadura y la C. elegans, realizamos un análisis ChIP-seq de SCC-2 (también conocido como PQN-85) y encontramos que un notable 95% de los sitios de SCC-2 se superponían con condensina I-IDC en el X, y 60% con condensina II en todo el genoma (Figura 5B). El solapamiento se mantuvo similar cuando se excluyeron las regiones CALIENTES (Archivo adicional 9: Figura S5A). No todos los sitios de condensina se solaparon con el SCC-2, lo que sugiere que, a diferencia de la levadura, la condensina no depende del SCC-2 para su unión . La unión de SCC-2 fue mayor en los promotores y se correlacionó positivamente con la transcripción (archivo adicional 9: Figura S5B). Un motivo de secuencia de ADN que contiene GAGA estaba presente en el 58% de los sitios de unión de SCC-2 (Archivo adicional 9: Figura S5C). A diferencia de Drosophila Nipped-B , y similar a S. cerevisiae Scc2 , la unión de SCC-2 no fue alta dentro de las regiones transcritas, pero permaneció intergénica (Figura 5C).

La superposición casi completa (96%) de los sitios de unión de condensina II con condensina I-IDC en el cromosoma X apoya la existencia de mecanismos comunes para la unión cromosómica de diferentes condensinas. Desde que condensina II y SCC-2 se unen a los sitios de reclutamiento de condensina IDC en la X (Figura 5D y archivo adicional 9: Figura S5D), planteamos la hipótesis de que los reclutadores de condensina IDC también reclutan condensina II y SCC-2. El reclutamiento específico de hermafrodita de condensina IDC al cromosoma X se logra mediante SDC-2, SDC-3 y DPY-30 . Realizamos HCP-6 y KLE-2 (condensina II), DPY-26 (condensina I-IDC) y SCC-2 ChIP-seq en embriones mutantes nulos sdc-2. En el mutante sdc-2, se abolió la unión DPY-26, HCP-6, KLE-2 y SCC-2 en un sitio de reclutamiento de condensina IDC específico para X (rex-2) (Figura 5E). No está claro por qué la unión de HCP-6 y KLE-2 en rex-2 se redujo en lugar de parecerse a un sitio de condensación autosómica. La unión de SCC-2 en autosomas y sitios del cromosoma X que son independientes de SDC-2 se mantuvo similar en el mutante SDC-2 en comparación con los sitios que fueron unidos por SDC-2 (Figura 5F). Nuestros resultados sugieren que SDC-2, el TF específico de hermafrodita que recluta condensina IDC al cromosoma X, también recluta condensina II y la subunidad del complejo de carga de cohesina SCC-2 a los mismos sitios (archivo adicional 10: Figura S6). Estudios genéticos previos establecieron que una mutación nula de SDC-2 no causa letalidad embrionaria en hombres, por lo que la función de la condensina II y el reclutamiento de SCC-2 por parte de SDC-2 no es esencial para la condensación y segregación cromosómica general . Es posible que el reclutamiento de SCC-2 y condensina II por el SDC-2 tenga una función reguladora génica específica de hermafrodita.

Para probar si el SCC-2 tiene un efecto en la asociación cromosómica de la condensina IDC en el sitio de reclutamiento, realizamos un análisis de PCR cuantitativo del chip DPY-27 en control versus embriones derribados de SCC-2. Al alimentar a los ARNi, pudimos derribar los niveles de SCC-2 en aproximadamente un 80% (Archivo adicional 9: Figura S5E). Tras la caída del SCC-2, no vimos un cambio significativo en la unión del DPY-27 en rex-1 o rex-2 (Figura 5G). Consistentemente, el análisis de inmunofluorescencia de la unión de condensina I y II a los cromosomas meióticos no mostró una diferencia significativa entre los mutantes de tipo salvaje y scc-2 .