Anatomía y Fisiología

Se realizó el presente estudio, con reglas y regulaciones para el cuidado y uso de animales de laboratorio de la casa de animales y el respectivo experimento fue aprobado por el Comité Central de Ética Animal. 25 ratones albinos suizos hembras con una edad promedio de 45 días y un peso de 25 a 35 g fueron elegidos aleatoriamente de la casa de animales, de diferentes colonias de reproducción. Estas hembras adultas no embarazadas fueron copuladas intencionalmente por ratones machos de la misma variedad con el objetivo de obtener 10 crías de generación posterior. En la jaula de policarbonato de plástico con coberturas de acero inoxidable, se colocó un macho heterocigoto fuerte y robusto con una sola hembra en una atmósfera mantenida continuamente a 20-25C y 55±5% de humedad, 12 horas, posteriormente, ciclo claro y oscuro. Se examinó a los ratones hembra en busca de tapón cruzado vaginal y la presencia de tapón well visualize se marcó como embarazo comprobado y se asignó el día cero de gestación. En los días 7, 8 y 9 de gestación, las hembras tapadas fueron chequeadas para embarazo por palpación abdominal.

La caracterización de nanopartículas de plata AgNPs

de fuentes de compra de investigación se evaluó por su tamaño primario mediante TEM y por su aglomeración en medio celular mediante espectroscopia de correlación cruzada de fotones (PCCS) y espectroscopia ultravioleta visible (UV–Vis), Dispersión dinámica de luz y potencial Zeta. Se mostraron imágenes TEM representativas de los AgNPs. Las imágenes TEM de los AgNPs recubiertos de PVP se dispersaron y suspendieron en 1.NaCl de 5M confirmó el tamaño de partícula primario indicado por los fabricantes. Las nanopartículas de plata sin recubrimiento encontraron una distribución heterogénea dentro del rango de 50 a 100 nm, la mayoría de ellas alrededor de 71 nm.

En el caso de AgNPs en polvo suspendido, las imágenes TEM mostraron que en un entorno acuoso las nanopartículas de plata se agrupan y forman grandes agregados, muchos de los cuales son más grandes que 50 nm. Este resultado es consistente con los resultados de la distribución de tamaños hidrodinámica que se obtuvo del método de dispersión dinámica de luz (zeta sizer). Los análisis de EDX confirmaron que solo se presentaba plata elemental en AgNPs coloidales y en polvo seco. De acuerdo con los resultados de ICP-AES, las concentraciones de iones Ag en las reservas digeridas ácidas de AgNPs en polvo coloidal y en suspensión fueron de 1908,1 y 447,2 mgl-1, respectivamente. También los resultados del patrón XRD confirman la cristalinidad de AgNPs de tipo en polvo y la presencia de plata cristalina elemental, también otras fases, excepto la plata metálica, no estaban presentes en la muestra. Además, los resultados de la FRX mostraron que la pureza de los AgNPs en polvo era del 97,86%.

La exposición de la solución coloidal de AgNPs a través de gavages orales repetidos

Se administró doble a ratones preñados con solución salina normal (control simulado) como vehículo y en una dosis de 5, 10, 15, 20 mg/kg de peso corporal a través de gavages orales repetidos, de 7 a 12 días de gestación con la ayuda de una aguja de alimentación de eje curvo de punta roma y una furgoneta acoplada. Los animales de control simulados se incluyen en los experimentos con animales tratados y animales no tratados.

Disección y evisceración

En GD 18, los cuernos derecho e izquierdo del útero de la madre embarazada se exteriorizaron después de una laparotomía ventral bajo anestesia profunda con éter/cloroformo y se lavaron 250 presas recién recolectadas mediante disección con agua del grifo en una placa de Petri para eliminar la sangre y el líquido amniótico, y se secaron con papel de filtro y se deshidrataron en alcohol al 95% durante 48 horas al fin expuestas al 1% de KOH para evisceración de consistencia y Alizarina protocolo de tinción para la visualización adecuada de huesos normales o anormales.13

Método (Evaluación de la dismorfología esquelética mediante la técnica de evisceración y tinción de alizarina) -:

El estudio de la dismorfología esquelética se realizó mediante la técnica de evisceración y tinción de alizarina. Todas las muestras ( 50 crías) de cada grupo se deshidrataron en un 95% de alcohol (alcohol rectificado) durante 48 horas y luego se retiraron y lavaron con agua corriente del grifo y luego se evisceraron con solución de KOH al 1% (KOH 1 g+100 ml d.p.). Después de hacer una laparotomía ventral, se extirpan los órganos vitales. Las muestras se sumergieron completamente en abundante solución de hidróxido de potasio (KOH) al 1% durante al menos 2 a 4 días hasta que la carne, los tendones, los músculos y las vísceras fueron transparentes & y se disolvieron, seguido de una visibilidad cristalina de los huesos y cartílagos. Cada día la solución fue cambiado cuando decolorarse y desechos.

El espécimen visible de hueso y cartílago cristalino se colocó en el mismo KOH al 1% y luego se agregaron de 6 a 8 gotas de tinción de alizarina al 1% para teñirlo de rojo violáceo profundo. La solución se agitaba suavemente un par de veces por hora. Luego, el mismo procedimiento se continuó durante otros 2-3 días para dar un color rojo violáceo profundo a los huesos y cartílagos. Para eliminar cualquier mancha excesiva y suavizar las muestras, las mismas se pasan a través de 40%, 80% (40 ml de glicerol+60 ml de agua destilada, 80 ml de glicerol+20 ml de agua destilada) y 1 a 2 timol de cristal agregado para preservación a largo plazo, finalmente mantenido en 100% de glicerol, servido para fotografía & observación con lentes de mano potentes.

En total se recolectaron 250 fetos de 25 madres de 1, 2, 3, 4 y 5 grupos, de los cuales todas las muestras fueron expuestas a experimentación con dismorfología esquelética. se observó reabsorción de 60 fetos.

Estadística

Se evaluó el porcentaje de malformación esquelética de cada grupo y se evaluó por el número de huesos implicados en la dismorfología y, finalmente, se compararon los porcentajes entre el grupo y dentro del grupo para el factor de teratogenicidad dependiente de la dosis. Prueba de ANOVA múltiple y estadística descriptiva (análisis post hoc) utilizada para este propósito.

Observación y hallazgos

El porcentaje de dismorfología esquelética fue mayor y mayor en las crías de los grupos tratados con 15 mg de AgNPs y 20 mg de AgNPs / kg de peso corporal (Tabla 1).

La dosis más baja AgNps en los grupos tratados (0.5 & 1 mg/kg b.w. se observaron porcentajes muy mínimos de anomalías esqueléticas, por lo que estos grupos tratados se consideraron casi como fetos del grupo control (Figura 1).

Figura 1 Tinción de alizarina del feto de control vista dorsal (A) y vista lateral (B).

Uno de los cachorros del grupo tratado con AgNPs de 5 mg/ kg de peso corporal mostró un 5o segmento esternal no osificado de la barra esternal y un segmento manumbrial no osificado que se diagnostica como hendidura esternal. Otros fetos mostraron hipoplasia maxilar y mandibular, hueso frontal, parietal y nasal no osificado, falla de fusión del segmento posterior del hueso de la cadera, 10,11 y 12 costillas rudimentarias en el lado izquierdo de uno de los fetos. La ausencia de eje medio de la costilla 6 a 12 junto con el aumento del espacio entre las costillas sucesivas se denotaron en múltiples fetos de diferentes grupos y se diagnosticaron como aumento del espacio de la tela, la ausencia de cuerpo & el proceso espinoso se observa en segmentos vertebrales torácicos completos, que se diagnostica como defecto del tubo neural de tipo cercano en el 1% de los casos de fetos de este grupo tratado. El porcentaje de dismorfología esquelética calculado en este grupo fue del 32% (Figura 2).

Figura 2 Tinción de alizarina para feto del grupo tratado con AgNPs de 5 mg vista dorsal (A) y (B), vista lateral (C) vista ventral (D) y vista dorsal (E)

Los fetos del grupo tratado con AgNPs de 10 mg demostraron dismorfología esquelética en forma de ausencia de vértebras lumbares y sacras, ausencia de huesos de cadera, costillas severamente degeneradas sin cartílagos, hueso frontal y parietal sin osificación ni desarrollo, se observa escoliosis en la región torácica y lumbar en uno de los fetos, se observa ausencia de vértebra cervical, hipoplasia maxilar, revelación de sagital y también se ven suturas coronales. Los huesos de las extremidades inferiores no desarrollados se ven a ambos lados de uno de los fetos. El porcentaje de dismorfología esquelética calculado en este grupo fue del 44% (Figura 3).

Figura 3 Tinción dorsal de alizarina del feto del grupo tratado con AgNPs de 10 mg (A, B).

Entre las crías del grupo 8 tratadas con 15 mg de AgNPs se observó ausencia de vértebras cervicales con ausencia de 12 costillas y resto de las vértebras se observó proceso espinoso no desarrollado, hendidura metatarsiana también se observa en la vista dorsal del pie de uno de los fetos, hueso de cadera no osificado en la vista ventral con ausencia de segmento & también se observa fibrosis, hueso temporal no osificado que se encuentra fibroso en la vista lateral del cráneo, ausencia de segmento proximal de hueso innominado, anomalía de la columna vertebral 6ª y 9ª costilla y se observa ausencia de 10ª,11ª y 12ª costillas en uno de los fetos, también se observó hueso parietal no osificado, se observó anencefalia con vértebras de escoliosis en L1-L5 en uno de los fetos, hueso de cadera no osificado, escápulas no osificadas de ambos lados en la vista dorsal de uno de los fetos, Ausencia de cartílago en la costilla 6 a 12 en uno de los fetos. El porcentaje de dismorfología esquelética calculado en este grupo fue del 60% (Figura 4).

Figura 4 Visión dorsal (A, B) y ventral (C) del feto del grupo tratado con AgNPs de 15 mg de alizarina)

Los 20 mg / kg de peso corporal Los fetos del grupo tratado con AgNPs presentaron el mayor porcentaje de dismorfología esquelética (76%). Se observó escoliosis en la región lumbar en uno de los fetos, un feto demostró hueso occipital no osificado, escápula y hueso de cadera no osificado, se observa fibrosis grande en maxilar, huesos frontales y parietales, lo mismo también se observa en el segundo al sexto segmento del esternón., se observa hendidura en la articulación del tobillo, se observa un aumento del espacio entre la 1ª y la 2ª costilla y la 5ª a la 8ª costilla del lado izquierdo de uno de los fetos, también se observa hendidura en la articulación de la sinfisis pubis de uno de los fetos , hipoplasia mandibular no osificada, también se observa ausencia de proceso espinoso con costillas onduladas, en un feto observamos fusión completa de la 2ª a la 8ª vértebra cervical que está claramente diferenciada del resto de la 1ª vértebra cervical. También observamos escoliosis leve y hueso occipital y parietal no osificado y ausencia de escápulas en el lado derecho de uno de los fetos, también se observan vértebras hipoplásicas (Figura 5).

Figura 5 Tinción dorsal de alizarina del feto del grupo tratado con AgNPs de 20 mg.