ARN circular: funciones, aplicaciones y prospectos
Introducción
El ARN circular (circRNA) se descubrió en virus ARN como viroides a mediados de los años 70, inicialmente hipotetizado como un error de empalme de ARN endógeno . Gracias al avance en el análisis computacional y las técnicas de secuenciación de ARN en la misma década, estas estructuras circulares incomprendidas finalmente han sido reconocidas correcta y profundamente tanto en estructura como en funcionalidad . En su núcleo, el ARN circRNA es un ARN de una sola cadena , pero difiere del ARN lineal mucho más conocido en que se cierra continuamente sobre sí mismo uniendo covalentemente sus extremos de 5′ y 3′, presentando así algunas propiedades fascinantes que no se exploran completamente: andamiaje complejo de proteínas, modulación génica parental, interacciones ARN-proteína y esponja de microRNA (miARN), solo por nombrar algunas . Ahora se considera que proporcionan una función reguladora esencial para las plantas y los animales por igual . Un número cada vez mayor de grupos de estudio ha demostrado y verificado hasta cierto punto el nivel de efectividad y eficacia mostrado en los ARN circulares que normalmente se requiere en tratamientos médicos viables y otras aplicaciones biotecnológicas. Por ejemplo, se están notificando a menudo casos de biomarcadores tradicionales con resultados muy superiores a los propuestos por sustitutos del circRNA. Con el respaldo de un creciente apoyo y evidencia sobre las capacidades de promoción de los circRNAs, se debe generar más investigación e interés como tal, no solo a partir de una comprensión biológica básica integral de sus estructuras y mecanismos, sino también a un nivel sistemático de sus interacciones con las moléculas y los entornos circundantes. Desde el punto de vista práctico, los circRNAs están a la par en cuanto a su potencial y viabilidad para atacar el cáncer y otras enfermedades malignas con otros tratamientos novedosos, como la medicina personalizada y las terapias con células madre.
Características de los ARNc
Los ARNC generalmente consisten en 1-5 exones y los intrones que flanquean los exones son hasta 3 veces más largos que su contraparte lineal. Un análisis más detallado ha revelado la presencia de muchas repeticiones de aluminio de inversor complementarias en los segmentos de intrones, lo que lleva a algunos a especular que esta disposición en particular realmente facilita que los sitios de empalme se ubiquen fácilmente entre sí y promuevan la circularización. Dado que son estructuras en bucle estrecho, no hay efectivamente estructuras finales de 5′ y 3′, como colas de poli-A y tapas de 5′ en el circRNA, lo que las hace inmunes a la escisión de exonucleasas . Empíricamente, duran 2,5 veces más que sus contrapartes lineales en células mamarias, como se ilustra en un estudio realizado por Enuka et al. . Debido a estas propiedades físicas, las técnicas de cribado de laboratorio comunes, como la degradación de la RNasa R, una enzima que degrada exclusivamente el ARN lineal, así como las pruebas de cola poli – A, pueden seleccionar con precisión estructuras de bucle cerrado sobre formas lineales. Varios grupos de investigación en los últimos años han cambiado su enfoque en la identificación de isoformas de circRNA potenciales, estructuras que se expresan originalmente a partir del mismo ADN parental, pero que son ligeramente diferentes entre sí en su forma final madura debido a la diferenciación en la especificidad de los spliceosomas para reconocer exones e intrones en la hebra pre-ARNm . Grupos notables incluyen Salzman, Jeck, Memczak, Guo y Zhang . Como tal, la increíble diversidad de circRNAs explicaba: hasta ahora se han identificado 20.000 tipos diferentes en eucariotas, un número que permanece abierto hasta el día de hoy .
Biogénesis y clasificación del ARNc
La formación de ARNc surge del posicionamiento y la mezcla de los grupos exón e intrón, que son segmentos que se reservan y eliminan en el producto final modificado después de la transcripción, respectivamente . Normalmente, un ARN mensajero maduro se forma cuando un complejo de proteína-ARN llamado spliceosoma cataliza la escisión de los segmentos de intrón en una molécula de ARNm precursora, generalmente por reconocimiento de secuencias específicas que flanquean el segmento de intrón en ambos extremos. Los segmentos de exón se fusionan, mientras que los segmentos intrónicos se extraen y degradan consecuentemente. Esta percepción convencional no tiene en cuenta la desviación y la diferencia de potencia en todos los sitios de empalme , algunos de los cuales, como resultado, el empalme puede ignorar e inevitablemente conducir a la síntesis de circRNA. Además, la contribución de la disposición espacial del sitio de empalme de 5′ y 3′ no debe ignorarse, ya que si el primero se coloca aguas abajo del segundo, entonces el spliceosoma construye favorablemente una estructura circular covalentemente cerrada sobre una molécula exónica lineal . Este mecanismo, comúnmente conocido como” Scrambling de Exones ” da lugar a diferentes tipos de circRNAs, incluyendo exónicos, intrónicos, exon-intrónicos e intergénicos . En casos específicos de cáncer, la estructura interna es aún más difícil de determinar debido a la naturaleza expansiva y, por lo tanto, invasiva de los tumores malignos . Describimos brevemente la biogénesis y la funcionalidad de los circRNAs en la Fig. 1.
Visión general de la Biogénesis y la Funcionalidad del ARN Circular. Explicación y Notas al pie: a A ARN mensajero en su forma madura, en la que la interacción entre los exones y los intrones está ausente. circularización Impulsada Por El Lazo. El exón aguas arriba (exón 1) y el exón aguas abajo (exón 4) están unidos covalentemente debido al empalme del ARNm. Esto facilita la producción de un lazo de ARN junto con exones emparejados que permanecen, que son Exones 2 y 3. Circularizaciones Impulsadas por Proteínas de Unión al ARN y por pares intrones. En ambos casos, los intrones aguas arriba y aguas abajo (intrones 1 y 3) se emparejan para proporcionar la oportunidad de que los exones intercalados (exones 2 y 3) interactúen, la única diferencia es que con el primer caso, una molécula externa de RBP se une a la ecuación para facilitar activamente la reacción, mientras que con la Circularización Impulsada por el emparejamiento de intrones, el grupo hidroxilo y el grupo fosfato de los intrones aguas arriba y aguas abajo respectivamente se emparejan de forma independiente. d ecircRNA o ElcircRNA se produce independientemente de la vía de circularización. En algunos casos, los segmentos intrónicos residen en el bucle, dando lugar a ElcircRNAs en lugar de ecircRNA que contiene segmentos puramente exónicos. las funcionalidades e de los circRNAs maduros incluyen la esponja de miRNA, que actúa como un doble inhibidor para algunas reacciones químicas; La traducción de proteínas es posible, aunque es bastante rara, y se están llevando a cabo investigaciones para comprender cómo difiere de las traducciones lineales de ARN; las formaciones complejas de proteínas RBP ayudan a regular y moderar las vías e impactan indirectamente en la producción de otros circRNAs; Interacciones con ARNm, ya sean facilitadoras o inhibidoras
Función del ARNc: esponjas de microRNA
Debido a la singularidad en las estructuras del ARNc, no codifican para proteínas como las formas lineales . Los estudios han demostrado, con evidencia empírica de apoyo, que ciertos circRNAs actúan como esponjas de microRNA y obstruyen efectivamente su mecanismo. Los microRNAs son secuencias de ARN largas no codificantes de 21 nt que ayudan en la regulación post-transcripcional de la expresión génica, típicamente al engancharse a los ARNm e inhibir su traducción a proteína a través de la moda competitiva o no competitiva. Se clasifican en familias por sus regiones de semilla, dependiendo de si comparten la misma secuencia de nucleótidos de las posiciones 2 a 7 . Los circRNAs poseen la complementariedad de contra-unirse a los microRNAs, reconociendo las regiones de semilla de los miRNAs y desactivándolos competitivamente. Dos circRNAs en particular, respectivamente CDR1as y circSRY, son el centro de atención de la investigación científica en la actualidad. Se observa que el CDR1as contiene 70 sitios de unión conservados para el miARN-7, muy significativos que cualquier otra esponja de miARN lineal. Su capacidad de esponjado es confirmada por Memczak et al. , que utilizó el secuestro de moléculas de CDR1as contra la expresión elevada de miR-7 en cerebros de peces cebra para obtener pruebas de apoyo de actividades inhibidoras de CDR1as contra el miARN objetivo mediante el monitoreo de los desarrollos posteriores del cerebro medio del pez cebra. CircSRY, por otro lado, se prueba en testículos murinos y se nota su ataque complementario en la región de semilla miR-138 . Como contiene 16 sitios de unión específicos, un número aún impresionante entre todas las moléculas de esponja, se confirma su hipótesis de funcionalización de la esponja .
Función del CircRNA: interacción con los RBPs y traducción de proteínas
Algunos han encontrado que el circRNA regula la transcripción y expresión génica a través de otras vías. Pueden interactuar con proteínas de unión al ARN (RBPs) como circ-Foxo3 y juntas forman un complejo que afecta la supervivencia y proliferación celular al interactuar con p21 y CDK2 ; algunas fortalecen la estabilidad del ARNm al formar estructuras dúplex, como en el caso de CDR1as. En una nota más controvertida, grupos como Legnini I. et al. and Pamudurti N. R. et al. descubrió que ciertos circRNAs pueden traducirse para proteínas, uno en mioblastos murinos y otro en cabezas de mosca . Tales noticias traen una nueva hipótesis sobre las capacidades del circRNA, que convencionalmente se cree que no son de codificación . Desde el primer descubrimiento de proteínas traducidas del virus de la hepatitis, un ARN monocatenario, algunos han verificado la activación de la capacidad de traducción del ARN mediante la inserción de un IRES (sitio de entrada de ribosomas internos) aguas arriba del codón de inicio . Se necesita hacer mucho más para comprender completamente el mecanismo de traducción exacto de estos ARR, y por qué funcionan mientras que la mayoría de los demás no lo hacen.
Potencial de aplicación de ARNc
En una nota más práctica, los ARNC son biomarcadores viables para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades, ya que no pueden degradarse fácilmente por exonucleasas debido a su estructura circular cerrada. En algunos casos, se ha encontrado que los circRNAs superan a los biomarcadores convencionales. Por ejemplo, la regulación ascendente de circ-PVT1 en tejidos de Cáncer Gástrico (GC) aumenta la actividad de esponja de miR-125 y, posteriormente, fomenta la proliferación de GC ; hsa_circ_0000190 también ha atraído la atención al operar de la manera opuesta: la regulación descendente se produce cuando entra en contacto con GC, y se prueba que es más sensible y específico que los biomarcadores como CEA y CA 19-9 . Otro ejemplo es el carcinoma hepatocelular (CHC), donde el biomarcador presente en uso predominante es la alfafetoproteína (AFP) . La AFP muestra poca sensibilidad, por lo que el 40% de todos los pacientes con CHC probaron niveles normales de AFP. La forma constructiva de aumentar esta sensibilidad es mediante la combinación con otros marcadores, lo que no es una solución efectiva. Alternativamente, Xingchen Shang et al. ha sugerido la correlación entre circ_005075 y el tamaño del tumor , enumerándolo como un biomarcador pronóstico viable que es superior tanto en eficacia como en potencial debido a su estabilidad y especificidad. Esto sugiere que el desarrollo y la invasión de HCCS están estrechamente vinculados a los circRNAs, aunque su mecanismo completo aún no está claro. Sin embargo, la lista de biomarcadores circRNA viables aplicables a la investigación del cáncer no se limita únicamente a estas dos enfermedades. Resumimos los estudios disponibles relativos a los ARR-C implicados en diversas enfermedades humanas que se pueden encontrar en la Tabla 1.
Estudios recientes adicionales han identificado y están tratando de decodificar el enriquecimiento y la estabilidad de los circRNAs en los exosomas, una combinación que podría mejorar aún más la capacidad de selección de los circRNAs. Los exosomas son vesículas extracelulares cuya función principal es transportar diversos contenidos celulares, químicos y factores, permitiendo así la interacción y respuesta de célula a célula . Como tal, un número considerable de cambios celulares y respuesta tisular son una consecuencia de si su vesícula correspondiente de la misma compatibilidad ha llegado con éxito a su destino y respuestas inducidas incorrectamente o factores transportados . Obtener una comprensión del mecanismo del exosoma puede ayudar a derivar mediaciones en microambiente tumoral y redes intercelulares, por lo tanto, despertando un gran interés en el circRNA del exosoma recientemente a la luz de la posibilidad de una mayor eficacia y capacidad de orientación en células malignas o que funcionan mal.
El origen de los circRNAs depende en última instancia de los niveles de miARN correspondientes en sus células donadoras, que pueden ser tanto inmunes como no inmunes. Los ARN exosómicos pueden minimizar el daño al ADN acelerando el ciclo celular, como se muestra en un caso reciente de sobreexpresión de miR-217, lo que resulta en la reducción de las expresiones de clclin-D1 y EZH2. Se cree que este comportamiento está relacionado con la proliferación desregulada en las formaciones de neoplasmia . Además, muchos resultados experimentales han concluido la relación directa entre los exosomas y la transformación neoplásica, así como el efecto mecanicista del ARNc en el microambiente tumoral . Tomando adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) por ejemplo, se ha asociado la alta expresión anormal del exosoma circ-PED8A ; el exosoma circNRIP1 promueve metástasis en Cáncer Gástrico (GC) al esponjar miR-149-5p, en otro estudio. Tal vez lo más significativo es el papel que el CIRCTGR1 del exosoma tiene en el desarrollo del carcinoma Hepatocelular (CHC) , por lo que la regulación ascendente del circRNA del exosoma alentó la invasión tumoral. Debido a estos hallazgos altamente correlacionados, los ARN de exosomas se proponen como indicadores de diagnóstico para sus tumores malignos correspondientes en función de la forma en que responden a los cambios en los niveles de expresión y su excelente estabilidad, junto con su mecanismo innato de administración dirigida . Hasta la fecha, se han identificado más de 1000 circRNAs en exosomas en todo el cuerpo humano, y se están llevando a cabo más investigaciones para descubrir combinaciones adicionales de exosoma, circRNA y cáncer.
Retos y perspectivas del CircRNA
A pesar de que se han llevado a cabo cada vez más investigaciones en paralelo con el aumento de la popularidad del circRNA, la función biológica de la mayoría de los circRNAs sigue siendo un misterio. Por ejemplo, se observa que la mayoría de los circRNAs patrullan en el citoplasma, pero se originan en el núcleo de la célula, por lo que se plantea la cuestión de cómo encajan a través del diminuto poro nuclear. Además, queda por investigar el hecho de que muchos de los exones circularizados (85%) se solapan con secuencias codificantes de proteínas, pero la mayoría de los circRNAs no codifican para proteínas. Desde un punto de vista más clínico, requieren pruebas adicionales para poder reemplazar por completo los procedimientos de diagnóstico tradicionales. Preocupaciones como la extracción de tejido del paciente causante de trauma y la costosa detección de ARNc en el tejido aún deben abordarse junto con la obtención de una comprensión completa y completa de sus estructuras secundarias y sus diferentes roles entre sí. Si no se administran adecuadamente biomarcadores adecuados de ARNC en los pacientes, se pueden confundir los resultados clínicos, que deben superarse obteniendo una mejor imagen de la generación, localización y degradación de los ARNc propuestos.
Sin embargo, los CIRCRNA siguen siendo opciones atractivas para el desarrollo de una gama de herramientas terapéuticas biológicas. Ya hay informes de construcción de ARN in vitro e in vivo utilizando secuencias de intrón-exón permutadas del grupo I (PIE) para la orientación complementaria de secuencias de flanqueo de sitio de la lámina posterior del spliceosomal, y este mecanismo puede extrapolarse para incluir cualquier secuencia o proteína de estructura conocida, si así lo deseamos. Como nota al margen, hay mucho margen de mejora en la ampliación de la diversidad de las posibilidades de diagnóstico de circRNA. En un ejemplo, el análisis molecular actual de la sangre se retiene al analizar fragmentos de ADN genómico libres de células; Una gran perspectiva de futuro sería considerar el muestreo de vesículas extracelulares específicas de la enfermedad para monitorear el inicio y la progresión de la enfermedad con más detalle. Estas ideas sientan las bases para nuevas sugerencias de regulación selectiva de proteínas y señalización celular programada. Como se ha demostrado una y otra vez en los experimentos en curso, los circRNAs han mostrado con confianza su potencial de esponjado y biomarcador, lo que debería impulsarnos a desbloquear los secretos de los circRNAs incomprendidos durante mucho tiempo.
