Base de conocimientos de Alpha CETSA

• CETSA ®
• Tipos de objetivo/Muestra
• Condiciones del ensayo CETSA ®
• Inmunoensayos Alfa CETSA ®
• Análisis e Interpretación de datos CETSA ®

Descargo de responsabilidad: Solo para uso en investigación. CETSA ® es una marca registrada de Pelago Bioscience AB. Tenga en cuenta que se requiere una suscripción válida a CETSA® para el uso del kit.

El método CETSA ® en sí

P: ¿Qué es CETSA®?

A : El Ensayo de Desplazamiento Térmico Celular es un método que permite la cuantificación del Compromiso Objetivo (TE) de un compuesto dentro de células vivas o en células alteradas. El principio de ensayo CETSA® se basa en el cambio en el perfil de desnaturalización térmica de la proteína diana que se produce tras la unión de un compuesto. El ensayo CETSA ® se realiza incubando las células con el compuesto de prueba, seguido del calentamiento de las células tratadas con el compuesto y, a continuación, midiendo la proteína diana soluble restante.

Q: ¿Qué es el cambio térmico

A: Al calentar una proteína se encontrará con una temperatura a la que se desnaturaliza (a veces conocido como el punto de fusión). Esta temperatura de fusión es una propiedad física y una constante para cualquier conjunto de condiciones (pH, presión, sales). Los compuestos que interactúan con una proteína cambiarán la temperatura de fusión (cambio térmico). Para un sitio de unión dado dentro de una proteína, el tamaño del desplazamiento térmico se puede medir a diferentes concentraciones de compuestos (dosis-respuesta), y los valores de EC50 derivados de tales curvas se pueden usar para establecer un orden de rango de potencia de una serie de compuestos, que se correlaciona directamente con el orden de rango de afinidad de los compuestos . Hay varias variaciones en el ensayo de Desplazamiento Térmico in vitro, pero la técnica clave fue descrita por primera vez por Semisotnov et al. (1991). En este método, la proteína de fusión y despliegue expone superficies hidrofóbicas que permiten que SYPRO orange se una. La fluorescencia de estos tintes se apaga en agua, por lo que la unión a estas superficies hidrofóbicas revierte esto y hace que la fluorescencia llegue a su punto máximo cuando la proteína está completamente desplegada. Este tipo de ensayo de desplazamiento térmico solo se puede aplicar a proteínas altamente purificadas y para especies de baja abundancia, esto puede significar que se requiere un sistema de sobreexpresión para generar cantidades suficientes.

Termofluor – sistema de tintes sensibles a la temperatura (utilizando Sypro Orange)

Fluorimetría de barrido diferencial (DSF) – métodos alternativos basados en tintes

Sistemas de PCR cuantitivos (por ejemplo, el Light cycler de Roche) : estos se utilizan para entregar el evento de calentamiento y pueden medir cambios de fluorescencia

Nanotemper: es un instrumento dedicado de fabricación de la empresa que calienta la muestra y mide la fluorescencia. Ofrece un mejor rendimiento que los sistemas de PCR adaptados.

P: ¿Por qué es Importante Medir el Compromiso de los Objetivos?

R: En ausencia de confirmación de que un compuesto interactúa efectivamente con el objetivo deseado, los desarrolladores de medicamentos pueden perder tiempo y recursos preciosos moviéndose en la dirección equivocada. Por esa razón, la confirmación del Compromiso Objetivo de un compuesto se ha considerado durante mucho tiempo esencial en el descubrimiento de medicamentos. Tales ensayos permiten realizar comparaciones directas de la afinidad de un compuesto para su objetivo, por lo que es una medida esencial para seleccionar qué compuestos avanzar en todas las etapas de generación y optimización de plomo. Debido a que el compromiso del objetivo se puede correlacionar con la afinidad, permite a los investigadores seleccionar compuestos que tienen los valores de afinidad más altos. Como tal, es una medida extremadamente útil para garantizar la correcta priorización de compuestos en cada etapa del proceso de descubrimiento de fármacos.

P: ¿En qué se diferencia CETSA® de otras tecnologías de ensayo de desplazamiento térmico?

A: Además de CETSA ®, hay numerosos métodos para evaluar el Compromiso del Objetivo (por ejemplo, Resonancia de Plasma de Superficie, Polarización de Fluorescencia y Desplazamiento Térmico). Sin embargo, todos estos métodos se basan en la disponibilidad de proteínas purificadas y solo se pueden aplicar in vitro, lo que significa que los valores de afinidad derivados pueden no ser predictivos de la afinidad real o el potencial de unión en células vivas. Ser capaz de ejecutar ensayos de cambio Térmico en un contexto celular relevante, donde la proteína se encuentra en su entorno nativo, en presencia de sus proteínas asociadas naturales, con concentraciones fisiológicas de sus cofactores y sustratos, produce datos mucho más relevantes, que se traducirán mejor en modelos animales y ensayos clínicos.

Mientras que el Ensayo de Cambio Térmico Celular es un método basado en el mismo principio biofísico que los ensayos de cambio térmico estándar (es decir, que proteínas específicas se desnaturalizarán a una temperatura establecida), no mide directamente la temperatura específica de despliegue, sino que se basa en el hecho de que la presencia de un compuesto en la proteína afectará la cantidad de proteína soluble presente después del calentamiento a una temperatura establecida. Como tal, CETSA ® es en esencia un ensayo de proteína total realizado después de un evento de calentamiento específico. Los compuestos con potencias de compromiso de objetivo diferentes cambiarán las cantidades relativas de proteína que sobreviven al evento de calentamiento. Debido a que el ensayo mide esta proteína residual, en lugar de un evento de fusión real, se puede aplicar a sistemas in vivo más complejos, como células y lisados (y en algunos formatos CETSA®, incluso tejido sólido). Además, CETSA ® puede identificar compuestos que desestabilizan una proteína (es decir, reducen su temperatura de fusión), esto es menos sencillo con los otros métodos de cambio térmico.

Q: ¿En qué se diferencia Alpha CETSA® de otras tecnologías de ensayo de Desplazamiento Térmico Celular u otros Ensayos de Compromiso de Objetivos Celulares?

A: Como se mencionó anteriormente, CETSA ® es básicamente un ensayo de proteína total realizado después de un choque térmico. Alpha CETSA ® utiliza un sistema de detección basado en proximidad de anticuerpos dual. Otros métodos evitan el uso de un sistema basado en anticuerpos modificando la proteína diana:

• Ensayo de cambio térmico de nanoluciferasa Promega (NaLTSA): Luciferasa Nanoluc fusionada a la proteína diana (proteína expresada recombinantemente); Cuando el objetivo de proteína con los agregados de etiqueta de enzima Nanoluc, la señal de luciferasa disminuirá.
• Ensayo de compromiso de objetivo Promega NanoBRET: Etiqueta de Fusión de luciferasa combinada con compuestos trazadores marcados que, cuando están muy cerca de la luciferasa, conducen a la Transferencia de Energía de Resonancia de Bioluminiscencia (BRET). La unión del compuesto en el mismo bolsillo desplazará el trazador y la señal BRET disminuirá. Este no es un método de choque térmico.
• Pulso Incell DiscoverX: Basado en la tecnología de Complementación de Fragmentos Enzimáticos (EFC) : la proteína diana se fusiona con un pequeño fragmento de donante enzimático de β-galactosidasa (β-gal). Una proteína reportera añadida se unirá a este fragmento para reconstituir una enzima activa, que hidrolizará un sustrato y generará una señal quimioluminiscente que permitirá cuantificar la abundancia de proteínas. Después de la desnaturalización por calor, la proteína se agregará y limitará el acceso del componente luciferasa más grande a su compañero en la proteína diana.

La diferencia clave entre estos sistemas “CETSA® recombinante” o “compromiso objetivo recombinante” y Alpha CETSA®, es que no se pueden aplicar a células nativas y no modificadas. Esto tiene una serie de consecuencias negativas:

1. Si bien el costo de desarrollar un par de anticuerpos novedoso y los costos por pocillo posteriores pueden ser más altos que la simple transfección de una sola línea celular, es probable que cualquier programa de descubrimiento desee probarse con una variedad de líneas celulares modelo, cada transfección tiene sus propios costos y la clonación de las líneas celulares posteriores tomará semanas adicionales.
2. Generar una proteína etiquetada siempre tendrá consecuencias fisiológicas en la célula y la proteína etiquetada puede estar (i) sobreexpresada (estequiometría incorrecta vs. socios), (ii) no se encuentra en el compartimento celular correcto o (iii) no está asociado con proteínas de socios clave y (iv) puede tener un comportamiento de fusión diferente al de la proteína nativa. Lo que significa que el efecto aparente de un compuesto puede no reflejar su comportamiento real en el tejido del paciente. Estos problemas se pueden magnificar en cualquier sistema de transfección temporal.
3. Los inhibidores de la luciferasa pueden dar lugar a resultados positivos falsos.
4. En etapas posteriores de optimización de plomo, cuando se requieren modelos celulares más complejos y fisiológicamente más relevantes (líneas celulares primarias, nativas y tejidos), los enfoques de proteínas etiquetadas simplemente no son aplicables.

P: ¿Qué información proporciona un ensayo CETSA®?

A: CETSA ® proporciona una medida única de los compuestos a ‘en presencia objetivo’ y se puede considerar como ocupación objetivo. Esta ocupación se verá afectada tanto por la capacidad de los compuestos para atacar al objetivo como por la capacidad del compuesto para estar presente en el lugar correcto (p. ej. tiene la solubilidad, permeabilidad, estabilidad metabólica y disponibilidad correctas en el compartimiento celular correcto). Los ensayos de compromiso objetivo no celular ofrecen medidas de afinidad que se correlacionan solo con el comportamiento de la proteína en entornos altamente artificiales, a menudo utilizando proteínas objetivo expresadas recombinantemente purificadas.

P: ¿Se puede utilizar CETSA® para estudios de análisis de SAR?

A: Todavía no hay ejemplos publicados en los que se haya utilizado CETSA® para la optimización de compuestos. Sin embargo, el potencial y la aplicabilidad de CETSA® para ser utilizado para el análisis de SAR y la confirmación de hit fueron claramente demostrados por Shaw et al. mediante la comparación de los datos del ensayo CETSA® con los datos bioquímicos y basados en células de uso común (Shaw et al. Descubrimiento de los SLA de 2018 1-12 DOI: 10.1177 / 2472555218813332). La publicación demuestra el valor añadido de CETSA® para el cribado, confirmación de aciertos y generación de SAR para dos dianas proteicas: B-Raf y PARP1.

Tipos de objetivo/muestra

P: ¿Cuántos objetivos se han validado en CETSA ® hasta ahora?

A: En CETSA ® HT (la mayoría Alfa CETSA®, algunos con HTRF) se han validado con éxito más de 30 blancos, incluidos blancos con localización nuclear, mitocondrial, citoplasmática y de membrana plasmática.

Hasta el momento, se han validado más de 100 blancos en CETSA® Classic (detección basada en Western Blot).

CETSA ® M / S genera información para 6000 a 7000 objetivos a la vez.

P: ¿Se pueden probar todas las proteínas diana en CETSA®?

R: Algunos objetivos son” ciegos ” en CETSA®, p. ej. la unión del compuesto no cambiará su estabilidad térmica. Esto puede suceder cuando la proteína tiene múltiples dominios, y el compuesto se une a un solo dominio, y si la estabilización de este dominio único no afecta globalmente la estabilidad térmica de toda la proteína. Hay algunas proteínas que no se funden en el rango de temperatura típico aplicado en los experimentos CETSA®.

Pelago tiene acceso a una gran base de datos con datos de estabilidad térmica de proyectos con lectura espectrométrica de masas (CETSA® MS), y esta información se tiene en cuenta cuando Pelago evalúa la “capacidad CETSA®” de una proteína diana antes de desarrollar un ensayo Alfa CETSA®. Póngase en contacto con Pelago para solicitar dicha información.

P: ¿Los GPCR son compatibles con CETSA® ?

A: Se han probado algunos ejemplos de GPCR en CETSA® . En una publicación reciente de Astra Zeneca (Kawatkar et al Chem Biology 2019), se establecieron ensayos CETSA® Classics para un conjunto de proteínas unidas a membrana, incluida una proteína diana GPCR. Un desafío potencial con CETSA ® en GPCR puede ser la disponibilidad limitada de anticuerpos para la detección. Además, la localización de membrana integral de los GPRCS puede conducir a un comportamiento de fusión impredecible.

P: ¿Qué tipo de muestras se pueden probar en CETSA®?

A : Hay ejemplos de ensayos CETSA® que utilizan muchos tipos diferentes de matrices, incluidas líneas celulares inmortalizadas, células primarias, células iPS, PBMCS derivadas de pacientes, esferoides, fracciones nucleares de células cultivadas, tejidos tratados ex vivo, tejidos de estudios en animales in vivo, bacterias, levaduras, peces cebra e insectos.

P: ¿Se pueden congelar las muestras después del paso de calentamiento?

A: Esto es posible, sin embargo, esto requiere una validación caso por caso, ya que el proceso de congelación puede desnaturalizar algunas proteínas.

P: Mis células necesitan recubrir la placa de cultivo con algunas proteínas (p. ej. colágeno o Matrigel); ¿se necesitan cuidados especiales para evitar la preparación de muestras?

A: No hemos encontrado ningún problema con las células cultivadas en placas recubiertas.

Condiciones del ensayo CETSA ®

P: ¿Cuáles son los puntos típicos de optimización del ensayo Alfa CETSA®?

A: Si se comienza desde cero, el inmunoanálisis debe desarrollarse y optimizarse primero. Es importante y vale la pena invertir en el desarrollo de un ensayo Alfa muy sensible, ya que permitirá reducir el número de células por pozo necesario en el ensayo CETSA®. Debido a que el ensayo CETSA® está destruyendo parte de la proteína que necesita ser detectada, normalmente se necesitan más células/pocillos en un ensayo CETSA® en comparación con otros ensayos basados en células. Consulte las guías de PerkinElmer para el desarrollo de ensayos alfa para saber cómo proceder y para obtener consejos útiles, y los manuales de CETSA® toolbox si utiliza el enfoque toolbox (anti mouse Ig X anti rabbit Ig beads).

A continuación, los puntos de optimización de ensayos CETSA ® incluyen:

• Valoración de la densidad celular
• Selección del tampón de lisis celular
• Tiempo de incubación de las células con el compuesto de prueba
• Temperatura para incubación de células con el compuesto de prueba
• Establecer curvas de fusión y desplazamiento
• Selección de temperatura para experimentos isotérmicos de respuesta a la dosis
• Configuración de flujo de trabajo y automatización

P: ¿Por qué se proporcionan diferentes búferes de lisis celular CETSA® y cuál es el impacto de usar diferentes búferes de lisis celular?

A: El tampón de lisis es importante en varios aspectos del ensayo. Su función es múltiple: lisar las células y liberar potencialmente la proteína diana de proteínas asociadas que pueden interferir con el reconocimiento de anticuerpos, para que la diana esté disponible para su detección por los anticuerpos; estabilizar la proteína diana para que el ensayo sea estable; evitar o minimizar el efecto potencial de epiturbancia; proporcionando las condiciones físico-químicas correctas (pH, fuerza iónica y naturaleza de las sales, tipo y concentración de detergente, … ) para el inmunoensayo, As Como diferentes inmunoensayos pueden tener diferentes condiciones óptimas, y como diferentes objetivos de proteínas, y diferentes tipos de células pueden tener diferentes requisitos para un rendimiento óptimo del ensayo, estamos poniendo a disposición 5 tampones de lisis celular diferentes. Estos proporcionan una variedad de condiciones de lisis celular. Sin embargo, esto no implica que se puedan agregar componentes adicionales en casos específicos, como tipos de detergentes adicionales, para mejorar el rendimiento de los ensayos.

P: ¿Hay inhibidores de proteasa en los tampones de lisis celular CETSA®?

A: Los tampones de lisis celular CETSA ® 1, 4 y 5 contienen algunos quelantes de cationes divalentes, que se espera que inhiban las proteasas que requieren dichos cationes divalentes para su actividad (Metaloproteinasas de matriz, por ejemplo). Además de esto, no se incluyen otros inhibidores de la proteasa en los tampones de lisis celular CETSA®, ya que generalmente no son necesarios para el rendimiento de los ensayos Alfa CETSA®. Sin embargo, para tipos específicos de células o muestras de tejido, es posible que desee agregar inhibidores de proteinasa típicos, como la leupeptina.

P: ¿Cuáles son las temperaturas de fusión típicas?

A: La temperatura de fusión (Tm) se define como la temperatura a la que se ha desnaturalizado la mitad de la población proteica diana (es decir, en Alpha CETSA®, a la que se ha perdido la mitad de la señal Alfa). Dependiendo del objetivo, las temperaturas de fusión suelen estar entre 40°C y 60°C, con una temperatura de fusión promedio de 52°C. Algunas proteínas, como las proteínas asociadas a la membrana, suelen ser más estables y pueden tener una temperatura de fusión más alta. Los datos del ensayo CETSA® para proteínas que tienen una temperatura de fusión superior a 65°C pueden verse afectados por el hecho de que la permeabilidad de la membrana y la integridad celular se perturban cuando las células se calientan, lo que afecta la importancia fisiológica del ensayo.

En nuestra experiencia, la temperatura de fusión es específica del objetivo y depende de la matriz de ensayo y del tampón de lisis utilizado.

P: ¿Se espera que el Tm sea el mismo cuando se trabaja con células intactas y células interrumpidas?

A: No necesariamente, como cuando se alteran las células, las interacciones proteína-proteína que estabilizan las proteínas se pueden perder, lo que puede conducir a un cambio en la temperatura de fusión en comparación con las células intactas. Para ver un ejemplo, consulte los datos del ensayo Alpha CETSA® MEK1.

P: ¿Qué temperatura de calentamiento debo seleccionar para la prueba de compuestos?

A: Para la estabilización de compuestos, se recomienda seleccionar la temperatura más baja con la ventana de ensayo más grande, ya que se espera que proporcione el ensayo más sensible (valores de EC50 más bajos). Para compuestos desestabilizadores, se recomienda seleccionar la temperatura más alta con la ventana de ensayo más grande. Las temperaturas superiores a 65°C pueden tener un impacto en la permeabilidad celular y reducir la importancia de los datos.

P: ¿Debo esperar la misma temperatura de fusión en CETSA ® Classic (Western Blot) y Alpha CETSA®?

A: No necesariamente: la temperatura de fusión aparente puede variar entre ambos métodos, porque los métodos de detección son diferentes.

P: ¿Es importante tener un control estricto de los tiempos de calentamiento de las muestras?

R: Sí, esto es extremadamente importante de controlar, ya que los tiempos de calentamiento más largos pueden dar lugar a un cambio correcto de la curva dosis-respuesta (consulte a continuación los comentarios sobre el tiempo de residencia). El tiempo de calentamiento estándar es de 3 minutos.

Compuestos con un tiempo de residencia corto (es decir, koff constante de alta tasa de disociación; tiempo de residencia T igual a 1 / koff) se disociará más rápido del objetivo cuando se calienta, en comparación con los compuestos que tienen un tiempo de residencia largo. Por esa razón, se espera que el valor EC50 o ITDRF50 aumente con el aumento de los tiempos de calentamiento. Para obtener más explicaciones sobre la teoría CETSA®, consulte Seashore-Ludlow B, Axelsson H, Almqvist H, Dahlgren B, Jonsson M, Lundbäck T. (2018) Interpretación Cuantitativa de la Cinética y Unión Intracelular de Fármacos Utilizando el Ensayo de Desplazamiento Térmico Celular. Biochemistry 57: 6715-6725. https://dx.doi.org/10.1021/acs.biochem.8b01057. En teoría, la detección de diferentes tiempos de residencia de compuestos en el objetivo, variando el tiempo de calentamiento, podría ser posible, pero aún no hay informes publicados disponibles sobre esto.

P: El manual indica que debe enfriarse en hielo o durante 3 minutos a 25°C después del choque térmico. ¿Es importante este paso de enfriamiento y es importante tener un control estricto del tiempo de enfriamiento?

A: El enfriamiento de la muestra garantiza rápidamente que la fase de choque térmico esté bien controlada. El simple hecho de permitir que las temperaturas se enfríen sin ayuda produciría, sin duda, diferentes velocidades de enfriamiento en diferentes pozos y afectaría la cantidad de choque térmico entregado al sistema. La fase de enfriamiento no es tan crítica como la fase de calentamiento, pero debe llevarse a cabo de forma rápida y consistente.

P: ¿Puedo usar kits de “Biomarcador” y “Seguro” (no CETSA® ) de PerkinElmer para realizar un ensayo CETSA®?

A: En teoría, cualquier ensayo de proteína total puede ser adecuado para su uso en un protocolo CETSA®, aunque cada sistema debe optimizarse y validarse. Sin embargo, el método CETSA® está patentado y se necesitará el permiso de Pelago Bioscience. Además, PerkinElmer solo admite el uso de los kits de destino designados. El uso del kit de caja de herramientas es compatible con Pelago Bioscience y solo está disponible para los titulares de licencias.

P: ¿Es posible leer la señal Alfa directamente de la placa de PCR utilizada para calentar las muestras?

R: Esto proporcionaría ventajas en términos de número de pasos de pipeteo, consumo de muestra y facilidad de automatización, pero la posibilidad de usar placas de PCR para todo el proceso, desde el tratamiento de la muestra hasta la detección, aún no está demostrada. Las placas de PCR a menudo son muy flexibles, lo que lleva a una señal no uniforme sobre la placa, o no tienen las dimensiones adecuadas para permitir que los lectores de placas las manejen. La conversación cruzada de pozo a pozo también puede ser un problema en tales placas de PCR.

P: ¿Se puede utilizar desnaturalización química (por ejemplo, utilizando urea o guanidina) en lugar de calor?

A: La ventaja de usar la temperatura para entregar el choque térmico es que se realiza de una manera altamente controlada que es probable que sea constante entre muestras y limitada en un marco de tiempo bien controlado. Un proceso de desnaturalización química podría funcionar en un extracto de proteína purificado; pero en el entorno celular complejo, la variación en el volumen celular, la capacidad de amortiguación, el contenido de lípidos, etc., es probable que signifique que diferentes líneas de células muestran diferentes características de desnaturalización para cualquier proteína dada.

Como la desnaturalización (tiempo de calentamiento) es crítica, esto puede ser bastante difícil de controlar si se usa desnaturalización química. Además, se puede aplicar calor sin alterar las células, lo que permite realizar pruebas en un contexto celular real. Este no sería el caso de la desnaturalización química, ya que las células tendrían que interrumpirse para permitir el acceso objetivo al agente desnaturalizador, por lo tanto, perderían concentraciones intracelulares, asociaciones de proteínas, etc.. Por lo tanto, no recomendamos reemplazar el choque térmico por desnaturalización química.

Inmunoanálisis Alfa CETSA®

Q: Al desarrollar un ensayo CETSA®, ¿necesito anticuerpos monoclonales o también se pueden usar anticuerpos policlonales?

A: Se pueden utilizar anticuerpos monoclonales o policlonales, dependiendo, por supuesto, de la calidad de los anticuerpos. Los anticuerpos monoclonales presentan una ventaja en términos de suministro de reactivo estable, al igual que cualquier otro método de detección que utilice anticuerpos.

P: Cuando se utilizan anticuerpos policlonales, ¿funcionará el siguiente lote de la misma manera en un ensayo CETSA®?

A: En nuestra experiencia, nunca nos enfrentamos a una situación en la que el siguiente lote de un anticuerpo policlonal se comportara de manera diferente en el ensayo CETSA® en comparación con los lotes anteriores. Sin embargo, el ensayo CETSA® necesita ser re-validado con el siguiente lote del anticuerpo policlonal.

P: ¿Hay otra recomendación para la selección de anticuerpos?

A: Si está disponible, se deben seleccionar anticuerpos para que cubran diferentes epítopos de la proteína diana, con el fin de maximizar las posibilidades de encontrar un par de anticuerpos adecuado que funcione en el ensayo Alpha CETSA®.

Se prefieren pares de anticuerpos que producen curvas más pronunciadas (pendiente de colina más alta) y menos fondo, ya que generalmente proporcionan una señal más específica. La pendiente baja de una colina puede ser el signo de la capacidad de un par de anticuerpos para reconocer la proteína plegada nuevamente.

P: ¿Son los anticuerpos Alfa CETSA® únicamente contra la proteína diana endógena o la proteína diana endógena más una molécula pequeña unida?

A: De acuerdo con los kits desarrollados hasta ahora, los anticuerpos solo están contra la proteína diana.

Q: ¿Puedo esperar que las afinidades de los anticuerpos de detección sean diferentes entre la molécula pequeña unida y la no unida a la proteína objetivo?

A: Las pequeñas moléculas que influyen en el plegamiento de proteínas en los sitios del epítopo, de hecho, corren el riesgo de alterar la unión de anticuerpos. Este fenómeno se denomina “epiturbancia” y puede ser una limitación de CETSA® basado en anticuerpos . En general, la epiturbancia no se observa en el formato de ensayo CETSA ® Classic (Western Blotting), ya que en este caso la proteína está completamente desnaturalizada antes de la fase de detección de anticuerpos.

P: ¿Solo se puede usar IgG con los kits de herramientas CETSA®?

A: De hecho, los anticuerpos en las perlas anti-conejo y anti-ratón son específicos de IgG, y no reconocerían otras clases de anticuerpos (es decir, IgA, IgM, etc. no deben seleccionarse).

P: ¿Hay alguna ventaja en el uso de Alpha CETSA ® en comparación con CETSA ® Classic (Western Blotting)?

A: Además de una mayor sensibilidad del ensayo Alpha CETSA® y consideraciones de rendimiento y automatización, debido a la posible dificultad en el análisis de proteínas de membrana en el método CETSA® Classic, Alpha CETSA® puede funcionar mejor para tales objetivos, ya que no necesita ningún paso de separación.

Análisis e Interpretación de datos de CETSA ®

P: ¿Qué resultados positivos falsos se pueden obtener en CETSA®?

A: La estabilidad térmica de algunas proteínas puede verse afectada después del tratamiento con compuestos, aunque no estén directamente unidas por el compuesto de prueba. Estos efectos indirectos pueden ser el resultado de, por ejemplo, la fosforilación de proteínas, el reclutamiento de proteínas por una proteína asociada o el cambio general del estado Redox de la célula. La ejecución del ensayo CETSA® en paralelo en células intactas y en células alteradas puede discriminar entre efectos directos e indirectos, ya que no se esperan tales efectos indirectos cuando se interrumpen las células y se detienen los procesos metabólicos.

La intereferencia de ensayos de compuestos se puede encontrar en Alpha CETSA®, ya que los compuestos están presentes en la etapa de detección a una concentración relativamente alta. Esto puede dar resultados engañosos y es importante realizar una pantalla de contador para identificar estos compuestos.

P: ¿Cómo se puede interpretar la desestabilización objetivo?

A: La desestabilización puede ser el resultado de la interrupción por la unión de compuestos de un complejo de proteínas que estaba estabilizando la proteína objetivo. En nuestra experiencia, las proteínas de membrana generalmente tienen una temperatura de fusión más alta y están más bien desestabilizadas que estabilizadas por la unión de compuestos. Para las quinasas, también podría ser el resultado del desplazamiento de ATP. En tal caso, puede ser útil comparar el resultado de los ensayos CETSA® cuando se realizan en células intactas (concentraciones fisiológicas de ATP) y células interrumpidas (pérdida de ATP). Para algunos objetivos (ver el manual del kit ErbB2 Alpha CETSA®) hemos observado que los inhibidores irreversibles desestabilizaban el objetivo mientras que un inhibidor reversible estabilizaba el objetivo.

P: ¿Hay alguna forma de evitar el efecto de epiturbancia?

A: Agregar una pequeña cantidad de detergente, como un 0,01% de SDS, puede prevenir el fenómeno de la epiturbancia. Una explicación podría ser que el SDS está proporcionando acceso al anticuerpo incluso en presencia del compuesto. Algunos de los tampones de lisis celular CETSA® contienen una pequeña cantidad de SDS y, por lo tanto, pueden evitar la epiturbancia sobre otros tampones de lisis. No podemos excluir que en algunos casos sea necesario añadir más FDS.

Cabe señalar que este efecto de epiturbancia no se limita a los ensayos CETSA®, sino que también se puede encontrar en cualquier inmunoensayo.

P: Contador de pantalla / ¿Cómo comprobar si mi coincidencia con CETSA ® es un falso positivo?

A: En CETSA®, hay un método simple que permite determinar si el compuesto está actuando sobre la propia estabilización de la proteína diana (des), o está interfiriendo con el método de detección: se puede hacer una comparación entre (1) la adición de los compuestos a las células, luego la incubación y el tratamiento térmico y (2) el calentamiento de las células primero y la adición del compuesto solo después. Si la actividad del compuesto se encuentra solo en la prueba 1, entonces es realmente activa en el objetivo. Si se encuentra actividad compuesta en 1 y 2, entonces muestra que interfiere de alguna manera con la tecnología de detección (consulte la guía de interacción Proteína-proteína de PerkinElmer para obtener una lista de posibles interferencias alfa).

P: ¿Qué resultados negativos falsos se pueden obtener en CETSA®?

A: Si un compuesto no está alcanzando el objetivo en un contexto celular, puede aparecer como positivo en ensayos bioquímicos, y aún así ser negativo en CETSA® . Esto no es un falso negativo, sino que refleja el hecho de que el compuesto no es capaz de acceder al objetivo en condiciones celulares reales, lo que es parte de la potencia del método.

P: ¿Cómo se comparan los valores de CETSA® con los ensayos funcionales / hay un significado de la amplitud de desplazamiento térmico?

A: Al analizar los datos de CETSA®, se debe tener en cuenta que el principio del ensayo es bastante diferente de los ensayos funcionales típicos, como la fosforilación de proteínas, las concentraciones de iones, el cAMP y otros marcadores de transducción de señales, o el análisis fenotípico en el cribado de alto contenido, y por lo tanto los datos deben interpretarse en consecuencia.

La amplitud del desplazamiento térmico NO es una medida de afinidad compuesta.

Los valores EC50, o ITDRF50, son específicos para ciertas condiciones de ensayo (temperatura, tiempo de calentamiento, …). Esto no es diferente de los ensayos funcionales, donde los valores de EC50 son, por ejemplo, específicos para los tiempos de estimulación.

P: ¿Es posible discriminar antagonistas vs agonistas en ensayos CETSA®?

A: Normalmente no se trata de información extraída de ensayos CETSA®, sino de la publicación de Shaw et al. (2018) INFORMES CIENTÍFICOS / (2018) 8:163 / DOI: 10.1038 / s41598-017-18650-x. informes de que solo los agonistas fueron capaces de estabilizar el receptor de andrógenos en el ensayo CETSA®, mientras que los antagonistas no tuvieron un efecto directo en el ensayo CETSA®, pero pudieron detectarse como competidores del efecto de los agonistas en el ensayo CETSA®. Por lo tanto, en este caso en particular, el ensayo CETSA® fue capaz de discriminar entre agonistas y antagonistas de los receptores de andrógenos. Esto no implica que esto sea posible para cualquier objetivo, ya que hay numerosos ejemplos en los que el ensayo CETSA® detecta directamente tanto agonistas como antagonistas.

Q: ¿Se puede utilizar CETSA® para detectar la toxicidad de un compuesto?

A: Se espera que los compuestos que ejercen algún efecto tóxico en una célula produzcan cambios en el nivel de algunas proteínas (a través de la degradación y/o efectos transcripcionales) y cambios en la termoestabilidad de algunas proteínas (a través de modificaciones postraduccionales o cambios generales del estado Redox de las células). Pelago está explorando la posibilidad de generar “huellas dactilares CETSA®” que podrían vincularse a diferentes tipos de toxicidad, a partir de datos de CETSA® MS. Esto también podría generar conocimiento de objetivos que los medicamentos no deberían alcanzar para evitar dicha toxicidad. Si un objetivo específico parece estar relacionado con la toxicidad, el uso de Alpha CETSA® puede convertirse en un método de elección para la industria farmacéutica.

P: ¿Se puede utilizar una proteína de limpieza para normalizar los ensayos CETSA®?

A: Normalmente no se necesita normalización en los ensayos CETSA®, ya que la salida importante del ensayo es el valor EC50. Sin embargo, en algunos casos, por ejemplo, cuando se trabaja con muestras de tejido, la cantidad de material utilizado por punto de datos puede variar significativamente y, en ese caso, se puede desear la normalización. En CETSA® Classic (Western blotting), SOD1 se usa comúnmente ya que su punto de fusión de 80°C lo convierte en una buena referencia invariable para cualquier objetivo, y su peso molecular de 18 kDa facilita su detección en Western blots. GAPDH no se recomendaría debido a su temperatura de fusión más baja (55 °C), por lo que no es un control posible para objetivos con una temperatura de fusión más alta.

Si se desea normalizar el ensayo Alpha CETSA®, se podría probar la cofilina (hay un kit AlphaLISA SureFire ultra para cofilina total, con datos preliminares de CETSA®, pero aún no hay un kit completamente validado)