¿Cómo diseñar gRNA para la edición del genoma CRISPR?
El gRNA guía el sistema CRIPR Cas9 a la ubicación genómica correcta para realizar una rotura de doble hilo.La especificidad de targerting del sistema CRISPR Cas9 está determinada por los 20 nucleótidos en el extremo 5′ del gRNA. La base del gRNA se empareja con la cadena complementaria de la secuencia objetivo y la nucleasa Cas9 realiza una ruptura de doble cadena.
Al diseñar un gRNA, se deben tener en cuenta las siguientes cosas.
1) Contenido de GC: El rango típico está entre el 40% y el 80%. Un mayor contenido de GC estabiliza el dúplex ARN-ADN mientras desestabiliza hibridaciones fuera del objetivo
2) Longitud: La longitud podría ajustarse y oscilar entre 17 y 24 pares de bases. Una secuencia más corta conduce a minimizar los efectos fuera del objetivo. (17 pb es el límite más bajo en la longitud de la secuencia de guía, cualquier longitud de la secuencia de guía cualquier longitud menor que 17 tiene una probabilidad estadística de apuntar a múltiples loci genómicos.)
3) Efectos potenciales fuera de objetivo: La tolerancia al desajuste y el sitio objetivo es lo que conduce a efectos fuera de objetivo. Esto se puede reducir mediante búsquedas de efectos objetivo de amplitud genómica.
Hay muchos sitios web que ayudan en el diseño de gRNAs. Algunos de ellos son Chop Chop (Harvard), el diseñador de Broad Institute sgRNA y Biotools.
Estoy explicando cómo usar el sitio web de Chop Chop aquí,
1) ir a https://chopchop.cbu.uib.no/
2) Seleccionar Especie
3) Seleccionar la identificación genética específica de la especie o cortar y pegar el nucleótido de interés, y comenzar el análisis.
Una vez realizado el análisis, se mostrará la representación gráfica del gRNA específico del sitio. Cada gRNA potencial también mostrará los posibles efectos fuera del objetivo. Selecciona los que tengan menos efectos fuera del objetivo.
