Cistron
Biogénesis de PTX
Las cinco subunidades PTX están codificadas por cistrones contiguos dentro de un solo operón policistrónico, cuya expresión está regulada por el sistema BvgA/S. A través de este sistema de dos componentes, la producción de toxinas puede ser modulada por la presencia de MgSO4 o ácido nicotínico, o durante el crecimiento a bajas temperaturas (para revisión, ver ). BvgS es una proteína de membrana interna que expresa múltiples actividades de quinasa. En el estado activo, activa la BvgA a través de la fosforilación. BvgA fosforilado, un regulador de transcripción citoplasmático, se une a los sitios operadores de la región promotora del gen PTX, donde interactúa con la ARN polimerasa y activa la transcripción. Aunque se han identificado moduladores que interfieren con la señalización del BvgS, no se conoce ningún ligando del BvgS requerido para activar la señalización, lo que sugiere que el BvgS se activa por defecto .
Después de la transcripción, las subunidades individuales se producen como preproteínas que contienen péptidos de señal hendibles. Tras la translocación a través de la membrana interna (muy probablemente a través de una vía dependiente de segundos), los péptidos de señal se eliminan. Aunque los péptidos señal muestran características típicas de los sustratos de la peptidasa I líder, su escisión por la peptidasa I líder de Escherichia coli es muy ineficiente. La coexpresión del gen lep de B. pertussis en E. coli aumenta sustancialmente la maduración de las subunidades PTX . Dentro del espacio periplasmático, se forman enlaces disulfuro intra-subunidad, y la holotoxina se ensambla antes de la secreción a través de la membrana externa. PTX contiene un total de 11 enlaces disulfuro intra-subunidad, uno en S1, dos en cada S4 y S5, y tres en cada S2 y S3 . Todas las cisteínas presentes en PTX están involucradas en enlaces disulfuro intra-cadena . La formación de disulfuro es importante para la biogénesis de la toxina, ya que la alteración de cualquiera de las cisteína en S1 evita que esta subunidad se reúna con el oligómero B. La formación adecuada de disulfuro depende del sistema DsbA/DsbC, que se encontró que era esencial para el ensamblaje y la secreción de PTX . Sin embargo, las mutaciones en dsbC, que codifican una de las tres isomerasas de disulfuro, aparentemente no tienen ningún efecto en el ensamblaje de la toxina, aunque perjudican su secreción, lo que sugiere que DsbC actúa sobre un componente que se requiere específicamente para la secreción de PTX.
La secreción no es necesaria para las actividades biológicas de PTX, pero el ensamblaje completo de la holotoxina es importante para una secreción eficiente, ya que las cepas diseñadas para producir solo S1 o solo el oligómero B muestran un defecto en la secreción . Sin embargo , un oligómero B completamente funcional puede secretarse hasta cierto punto en ausencia de S1, lo que indica que la presencia de S1 no es un requisito absoluto para la secreción de oligómeros B. En contraste, S1 por sí solo no se puede secretar en ausencia del oligómero B, lo que sugiere que los determinantes de la secreción se encuentran dentro del oligómero B, aunque la presencia de S1 ciertamente puede mejorar la eficiencia de la secreción. Ciertas mutaciones en el gen S1 tienen un fuerte efecto perjudicial en la secreción, particularmente en el área alrededor de Arg-57 , lo que sugiere que esta región de S1 juega un papel en la secreción de PTX. En ausencia del oligómero B, lo más probable es que S1 se divida a la membrana externa, quizás a través de su dominio hidrofóbico terminal C. Este puede ser el sitio de ensamblaje con el oligómero B antes de la secreción a través de la membrana externa .
Los pasos moleculares en el ensamblaje de holotoxinas todavía no se conocen bien. Las subunidades individuales en cepas mutantes que no producen las otras subunidades se degradan rápidamente. Ciertas combinaciones de subunidades parecen estabilizarse mutuamente . Por ejemplo, la estabilidad de la subunidad S2 se ve reforzada en gran medida por la presencia de S4 y viceversa, lo que es consistente con la formación de dímeros S2–S4 revelada por la estructura cristalina de la holotoxina. También es posible que se formen subconjuntos del dímero S2–S4 con la subunidad S1 en ausencia de S3 y S5. No se ha encontrado que el dímero S2–S4 esté secretado en B. tos ferina, mientras que la adición de S1 a este dímero puede resultar en algún nivel de secreción.
El transporte de PTX a través de la membrana externa de B. pertussis depende de un sistema de secreción tipo IV (T4SS) compuesto de nueve proteínas diferentes, llamadas PtlA a través de PtlI . Estas proteínas son homólogas a las de T4SSs de otras bacterias, incluyendo Agrobacterium tumefaciens, Bartonella tribocorum, Brucella suis, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila y Rickettsia prowasekii . Los genes ptl se encuentran directamente aguas abajo de los cinco genes PTX estructurales y están bajo el control del promotor ptx . Sin embargo, las proteínas Ptl parecen producirse a niveles más bajos que las subunidades PTX, como lo demuestran las fusiones traslacionales del gen phoA con varios genes ptx y ptl . La producción de ciertas proteínas Ptl parece ser un paso limitante en la secreción de PTX. Durante el crecimiento exponencial, se ha estimado que las bacterias secretan tres moléculas de toxinas / min / célula bacteriana, y se ha encontrado que las subunidades se acumulan dentro del espacio periplasmático, tanto como subunidades individuales como ensambladas en holotoxinas. La acumulación de subunidades ocurre a lo largo del crecimiento exponencial a pesar de que los niveles de ciertas proteínas Ptl aumentan a entre 30 y 1.000 moléculas por célula. Por lo tanto, la producción o ensamblaje de secreciones en lugar de toxinas puede limitar la velocidad. Curiosamente, en ausencia de las proteínas Ptl, algunas combinaciones de subunidades, como el dímero S2–S4 en presencia de S1 , pueden ser secretadas, aunque la secreción de la holotoxina depende fuertemente de la presencia de las proteínas Ptl.
Se cree que las proteínas Ptl forman un complejo que abarca tanto la membrana interna como la externa , y todas ellas (al menos PtlA-H) parecen ser necesarias para la secreción de toxinas, según lo investigado por mutaciones en cada gen ptl individual . Algunas de las mutaciones introducidas en trans en cepas de tipo natural ptl + resultaron en un fenotipo de secreción negativa dominante, confirmando que al menos PtlC a PtlH son parte de un complejo multimérico. Un paso clave en la secreción de PTX es obviamente su capacidad para cruzar la capa de peptidoglicano, y se ha demostrado que la PtlE expresa la actividad de la peptidogicanasa . Esta proteína de 276 residuos contiene similitudes en el sitio activo con otras glucohidrolasas, y se ha demostrado que las sustituciones de alanina en este sitio disminuyen en gran medida la actividad de la peptidoglicanasa de la PtlE recombinante. Las mismas sustituciones en PtlE natural también suprimen la secreción de PTX por B. pertussis, lo que sugiere fuertemente que PtlE es la peptidoglicanasa necesaria para que la toxina cruce la capa de peptidoglicano.
La secreción de PTX también probablemente requiere energía. Dos de las proteínas Ptl, PtlC y PtlH, contienen supuestos sitios de unión al trifosfato de adenosina (ATP) y, por lo tanto, podrían proporcionar la energía necesaria para la secreción de toxinas. Se ha demostrado que ambas proteínas son necesarias para la secreción , y en ambos casos, los sitios de unión a ATP putativos son esenciales para la función. Para ambos, se observa un fenotipo negativo dominante cuando los alelos mutantes se coexpresan con el alelo de tipo salvaje, lo que sugiere que ambos funcionan como multimeros o forman parte del complejo de secreción. Se demostró que la PtlH está asociada con la membrana interna, y las mutaciones en el sitio de unión a ATP de la PtlH afectan su ubicación celular y suprimen sus interacciones con otras proteínas Ptl . El papel preciso del PtlC aún no se conoce. PtlD es también una proteína de membrana interna y contiene cinco dominios transmembrana. Se requiere para la estabilidad de PtlE, PtlF y PtlH a través de sus residuos C-terminal 72. Sin embargo, esta región C-terminal no es suficiente para la secreción de toxinas . El PtlF muestra características de las proteínas de la membrana externa (OMP), pero también puede estar asociado con la membrana interna. En condiciones de no reducción, el PtlF y el PtlI migran como un complejo durante la electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio y poliacrilamida, lo que indica que el PtlI se une al PtlF mediante la formación de enlaces disulfuro . La formación adecuada de enlaces disulfuro entre PtlI y PtlF podría depender del DsbC, ya que las mutaciones en el gen dsbC afectan la secreción sin afectar el ensamblaje de toxinas .
