Citotoxicidad dependiente del complemento
Antidiabéticos terapéuticoseditar
El desarrollo de anticuerpos terapéuticos antitumorales implica un análisis in vitro de sus funciones efectoras, incluida la capacidad de provocar que los CDC destruyan las células diana. El enfoque clásico consiste en incubar anticuerpos con células diana y fuente de complemento (suero). Luego, la muerte celular se determina con varios enfoques:
- Método radiactivo: las células diana se etiquetan con 51Cr antes del ensayo de los CDC, se libera cromo durante la lisis celular y se mide la cantidad de radiactividad.
- Medición de la actividad metabólica de células vivas (tinción de células vivas): tras la incubación de las células diana con anticuerpos y complemento, se añade un tinte permeable a la membrana plasmática (por ejemplo, calceína-AM o resazurina). Las células vivas lo metabolizan en un producto fluorescente impermeable que puede detectarse mediante citometría de flujo. Este producto no se puede formar en células muertas metabólicamente inactivas.
- Medición de la actividad de las enzimas intracelulares liberadas: enzima de liberación de células muertas (p. ej. LDH o GAPDH) y la adición de su sustrato conduce a un cambio de color, que generalmente se cuantifica como cambio de absorbancia o luminiscencia.
- Tinción de células muertas: un tinte (fluorescente) entra en las células muertas a través de su membrana plasmática dañada. Por ejemplo, el yoduro de propidio se une al ADN de las células muertas y la señal fluorescente se mide por citometría de flujo.
Test de tipificación de HLA y pruebas de cotejo cruzado
Los ensayos de los CDC se utilizan para encontrar un donante adecuado para trasplante de órganos o médula ósea, es decir, un donante con fenotipo compatible del sistema de histocompatibilidad HLA. Al principio, la tipificación de HLA se realiza para que el paciente y el donante determinen sus fenotipos de HLA. Cuando se encuentra una pareja potencialmente adecuada, se realiza una prueba de emparejamiento cruzado para excluir que el paciente produzca anticuerpos anti-HLA específicos del donante, que podrían causar rechazo del injerto.
Los CDC utilizan un lote de anticuerpos anti-HLA a partir de antisueros alogénicos caracterizados o anticuerpos monoclonales. Estos anticuerpos se incuban uno a uno con los linfocitos del paciente o del donante y la fuente de complemento. La cantidad de células muertas (y, por lo tanto, el resultado positivo) se mide mediante la tinción de células muertas o vivas. Hoy en día, la tipificación de los CDC está siendo reemplazada por la tipificación molecular, que puede identificar secuencias de nucleótidos de moléculas HLA a través de PCR.
El ensayo de los CDC se utiliza generalmente para realizar pruebas de emparejamiento cruzado. La versión básica implica la incubación del suero del paciente con linfocitos del donante y la segunda incubación después de agregar complemento de conejo. La presencia de células muertas (prueba positiva) significa que el donante no es adecuado para este paciente en particular. Hay modificaciones disponibles para aumentar la sensibilidad de la prueba, incluida la extensión del tiempo mínimo de incubación, la adición de globulina antihumana (AHG), la eliminación de anticuerpos no unidos antes de agregar complemento, la separación del subconjunto de células T y células B. Además de los CDC cruzada hay citometría de flujo-cruzada disponible, que es más sensible y puede detectar incluso complementar la no activación de anticuerpos.
