Cloranfenicol acetiltransferasa como marcador de selección para la transformación clamidial

pGFP:: SW2, el vector de transporte construido por Wang et al, contenía un gen de β-lactamasa como marcador de selección. También lleva un gen de GATO que se fusiona con el gen GFP . Encontramos que E. coli transformado con el plásmido pGFP:: SW2 fue capaz de crecer en medio que contenía cloranfenicol (concentración final: 170 µg / ml), lo que sugiere que el gen CAT también puede usarse como marcador de selección para experimentos de transformación de clamidia. Como advirtió Wang et al., un efecto adverso del cloranfenicol en las mitocondrias del huésped, como lo demuestran Li et al. puede afectar la utilidad de este antibiótico para la transformación . En Li et al.según el informe, la concentración tóxica mínima de cloranfenicol fue de 10 µg / ml, lo que causó una reducción leve del 20% de la producción de ATP. Hemos determinado que la concentración aparente de cloranfenicol más baja que inhibió completamente la formación de inclusión en el C libre de plásmidos. la cepa L2 designada L2R de trachomatis fue de solo 0,05 µg / ml (no se muestran datos), que estaba muy por debajo de las concentraciones tóxicas para las células huésped. Por lo tanto, razonamos que este antibiótico podría usarse para seleccionar transformantes que expresan GATOS sin estresar significativamente a las células huésped.

Transformamos L2R con pGFP:: SW2, y seleccionamos la mitad de las células transformadas con ampicilina, y la otra mitad con cloranfenicol. Los antibióticos (2 µg/ml de ampicilina o 0,1 µg/ml de cloranfenicol) se añadieron a los cultivos a las 10 h después de la transformación. A partir del pasaje 2, sus concentraciones aumentaron a 5 y 0,2 µg/ml, respectivamente, y se añadieron en el momento de la inoculación. La proporción de división entre pasajes permaneció 1:1 desde el pasaje 1 hasta el pasaje 4. A pesar de que la CMI del cloranfenicol, que se determinó con baja multiplicidad de infección (~0,1 unidades formadoras de inclusión por célula), fue de 0,05 µg/ml, se esperaba que algunas de las clamidias no transformadas formaran inclusiones en presencia de 0,1-0.2 µg/ml de antibiótico, ya que utilizamos una alta proporción de EB a células para la transformación, y la eficacia de la inhibición del crecimiento de la clamidia por los antibióticos está influenciada por la multiplicidad de infecciones . Con el protocolo de selección descrito anteriormente, en cultivos seleccionados con ampicilina, bajo un microscopio de contraste de fase, se encontró que casi el 100% de las células contenían una inclusión con RBs aberrante en el pasaje inicial. Las inclusiones aberrantes que contenían RB todavía estaban presentes en una pequeña proporción de células en el pasaje 2, pero fueron reemplazadas en su mayoría por inclusiones aparentemente normales en el pasaje 3. Se encontraron inclusiones normales en aproximadamente el 20% de las células, y rara vez se observaron inclusiones anormales en el pasaje 4. En el pasaje 5, que resultó de la inoculación con un 10% de cosecha del pasaje 4, se encontraron inclusiones en el 80% de las células; aparentemente, ninguna de estas inclusiones contenía RBs aberrantes.

Dado que el cloranfenicol no causa que las clamidias formen RBs aberrantes, evaluamos la resistencia al antibiótico por el tamaño de inclusión. Se detectaron inclusiones de tamaños más pequeños de lo normal en casi todas las células en el paso 1. Algunas inclusiones, pero de tamaño muy pequeño, se encontraron en el pasaje 2, y la mayoría de esas inclusiones fueron reemplazadas por inclusiones de tamaño normal por el pasaje 3. Se encontraron inclusiones de tamaño normal en más del 20% de las células en el pasaje 4. En el paso 5, obtenido después de la inoculación con una cosecha del 10% en el paso 4, y un aumento en la concentración de cloranfenicol (de 0,2 µg/ml a 0,5 µg/ml), se encontraron inclusiones de tamaño normal en casi el 100% de las células 0000000.

Además de la resistencia aparente a los agentes de selección, utilizamos la expresión de GFP y la restauración de la síntesis de glucógeno como marcadores adicionales para una transformación exitosa . Los EBs recolectados del pasaje 5 se utilizaron para infectar células McCoy a una velocidad de dilución de 1:100 (equivalencia del número de células) para experimentos que determinaban la expresión de GFP y la síntesis de glucógeno (Figura 2). Como se esperaba, ni C. trachomatis L2 (434/bu) plásmido de tipo salvaje (Figura 2A) ni L2R libre de plásmido no transformado (Figura 2B) expresaron GFP. Consistente con los hallazgos establecidos de que la síntesis de glucógeno en C. trachomatis requiere su plásmido, la tinción de yodo mostró que el glucógeno se acumuló en las inclusiones de L2 de tipo silvestre (Figura 2A), pero no en las de L2R (Figura 2B). En presencia de ampicilina de 5 µg/ml, que inhibe la división del RB, L2R no transformado (Figura 2C) formó inclusiones que contenían RBs gigantes sin producir glucógeno; mientras que el cloranfenicol (concentración final: 0,5 µg/ml) inhibió completamente la formación de inclusiones visibles en las células infectadas con L2R (Figura 2D). Consistente con los datos publicados por Wang et al. , pGFP::L2R transformada en SW2 seleccionada con ampicilina formada con inclusiones GFP positivas con glucógeno (Figura 2E). pGFP:: L2R transformado en SW2 seleccionado con cloranfenicol también formó inclusiones positivas a GFP que contenían glucógeno (Figura 2F). Como era de esperar, los transformantes seleccionados con ampicilina fueron capaces de formar inclusiones de tamaño normal, GFP positivo, que contienen glucógeno en presencia de cloranfenicol (Figura 2G); asimismo, los transformantes seleccionados con cloranfenicol fueron completamente resistentes a la ampicilina, expresaron GFP y produjeron glucógeno (Figura 2H). Estos resultados sugieren que el gen CAT en el pGFP::El plásmido SW2 es funcional en clamidia, y la resistencia al cloranfenicol se puede usar como marcador de selección para la transformación de clamidia.

Inclusión, expresión de GFP y síntesis de glucógeno de pGFP:: transformantes SW2 de C. trachomatis L2. La cepa plásmida no transformada 434/bu (A), la cepa sin plásmido no transformada L2R (B-D) y la L2R transformada seleccionada con ampicilina (E, G) o cloranfenicol (F, H) se cultivaron con un medio que contenía un antibiótico indicado o con un medio sin antibióticos. Las imágenes de inclusiones en cultivos sin teñir y teñidos con yodo se obtuvieron con microscopía de contraste de fase o microscopía de fluorescencia 48 h después de la inoculación. En todos los paneles, el contraste de fase y las imágenes GFP son superponibles.

A continuación, eliminamos el gen β-lactamasa del pGFP::Plásmido SW2 como se describe en la sección “Métodos”, y utilizó el plásmido resultante pGFP-CAT::SW2 para transformar L2R. Las clamidias transformadas se sometieron a selección con cloranfenicol utilizando el mismo régimen descrito anteriormente. Inclusiones resistentes al cloranfenicol surgieron en aproximadamente el 20% de las células infectadas en el cultivo de pasaje 4. La microscopía de fluorescencia y la tinción de yodo revelaron inclusiones positivas a GFP y glucógeno en células infectadas con EBs cosechadas del pasaje 5 y cultivadas en presencia de cloranfenicol (Figura 3, panel superior). Sin embargo, como resultado de la falta de β-lactamasa en el plásmido pGFP-CAT::SW2, los transformantes no pudieron formar inclusiones normales en presencia de ampicilina; en cambio, sus inclusiones se llenaron con RBs aberrantes. Si bien las inclusiones irregulares todavía eran positivas para GFP, estaban en gran medida libres de glucógeno (Figura 3, panel inferior). Después del pasaje 5, los transformantes pGFP-CAT::SW2 se cultivaron con 0,5 µg/ml de cloranfenicol para cuatro pasajes adicionales a una proporción de división de 1:100 para cada pasaje. Todas las inclusiones en el pasaje 9 tenían la misma apariencia que las inclusiones de clamidias plásmidas y no la de L2R libre de plásmidos, y se encontró que todas expresaban GFP (datos no mostrados). Estos resultados prueban que el gen CAT en el plásmido pGFP-CAT::SW2, similar al plásmido pGFP:: SW2, funciona como marcador de selección para la transformación de C. trachomatis.

Inclusión, expresión de GFP y síntesis de glucógeno en L2R transformado con pGFP-CAT:: SW2. Las células infectadas con transformantes seleccionados con cloranfenicol se expusieron al cloranfenicol o a la ampicilina. Las imágenes de inclusiones en cultivos sin teñir y teñidos con yodo se obtuvieron con microscopía de contraste de fase o microscopía de fluorescencia 48 h después de la inoculación. Las imágenes de contraste de fase y GFP son superponibles.

cabe señalar que Tam et al. ha intentado previamente desarrollar un sistema de transformación con el gen CAT como marcador selectivo . En ese estudio, un vector de lanzadera que contenía un gen CAT fue electroporado en EBs de C. trachomatis E (cepa UW-5/CX) y L2 (cepa 434/Bu). Aunque tanto el ARNm de GATO como la actividad enzimática fueron detectables en los cultivos iniciales de clamidias transformadas, los autores no obtuvieron transformantes estables después de la selección con cloranfenicol para 4 pasajes. Es importante tener en cuenta que ambas cepas electroporadas contienen un plásmido nativo que comparte el mismo origen de replicación con el plásmido recombinante utilizado para la transformación . Desde Wang et al. fueron capaces de obtener transformantes resistentes a la penicilina estables solo a partir de L2R, un C libre de plásmidos. la variante trachomatis L2, pero no la 434/Bu repleta de plásmidos de tipo salvaje, en entornos experimentales idénticos, retrospectivamente no es sorprendente que Tam et al. no se obtuvieron clamidias estables resistentes al cloranfenicol.