Detección e identificación por PCR de Clostridium chauvoei en aislados clínicos, heces y sustratos bovinos de planta de biogás
Muestras de casos sospechosos de lombriz negra
Para muestras musculares de casos sospechosos de lombriz negra, los resultados del cultivo en placas de el material de la colonia estaba de acuerdo con el método de identificación bioquímica o se desempeñaba incluso mejor que éste (Tabla 2). Estos resultados son consistentes con Uzal et al. . Este estudio demostró que la preparación de ADN a partir de cultivos antes de la PCR dio mejores resultados que la PCR aplicada directamente a la biomasa.
El cultivo seguido de métodos de identificación bioquímica es complicado en muestras con un alto contenido de flora contaminante debido a la necesidad de cultivo puro y la sensibilidad fue sustancialmente menor que para el cultivo y la PCR. En ocho casos fue imposible detectar C. chauvoei por cultivo e identificación bioquímica, pero el organismo se detectó por PCR (Tabla 2). Para hacer un diagnóstico de glande negro, se toma tejido muscular en la autopsia, ya que la cantidad de C. chauvoei probablemente es más alta en tejido muscular que en sangre. La única muestra de sangre fue tomada incorrectamente, pero la pregunta era de color negro.
Asimismo, en un estudio previo de un brote de mosca negra, el cultivo y la detección por PCR dieron mejores resultados que el análisis bioquímico . En uno de los casos, el cultivo primario de un músculo en una placa de agar sanguíneo fue cubierto por C. septicum, pero dio resultados positivos claros para C. chauvoei en la PCR.
En la mayoría de los casos clínicos de blackleg la cantidad de C. chauvoei en el tejido infectado es alto y se puede detectar fácilmente por el método de PCR independiente de la flora contaminante. Además, el método de PCR es mucho más rápido que el método de detección bioquímica tradicional, que tarda al menos cinco días, y es importante tener un cultivo puro de la cepa, que podría requerir tiempo adicional para el cultivo. Para evitar contaminar la flora, el tejido muscular no debe ser demasiado pequeño; aproximadamente 100-200 g serían adecuados. Sin cultivo puro, no se pueden realizar cepas para estudios posteriores en el futuro, lo que es una desventaja de usar la detección por PCR como único método.
En bovinos infectados experimentalmente con C. chauvoei, se realizaron análisis de PCR en músculo picado y otros órganos y se detectó C. chauvoei en todos los órganos analizados . Las piezas musculares picadas de casos sospechosos de barbilla negra se probaron directamente mediante PCR y se compararon con el cultivo. La detección por PCR dio mejores resultados que el cultivo y la identificación bioquímica, lo que está en desacuerdo con los resultados del presente estudio, donde solo el 12% (3 de 24) de las piezas sanguíneas o musculares estaban por encima del umbral de detección de PCR, mientras que el 9% de las muestras de jugo de carne estaban por encima del umbral de detección (Tabla 2). Las sustancias inhibidoras están probablemente presentes en los tejidos musculares. Se han identificado inhibidores de la reacción enzimática de la amplificación de la PCR en el hígado, el bazo y el riñón, y puede haber inhibidores similares presentes en el tejido muscular. Los resultados de las piezas musculares maceradas en muestras salinas fisiológicas estériles (26%) no se correspondieron bien con los de la prueba bioquímica. La PCR directa en tejido muscular u otras muestras similares probablemente no sea adecuada para reemplazar los pasos de cultivo seguidos por pruebas bioquímicas o por PCR.
Muestras musculares recogidas por hisopos
Para investigar si es necesario enviar tejido muscular para el análisis de C. chauvoei o si es suficiente usar hisopos para la recolección de muestras, se simuló un servicio postal. De los 22 tejidos musculares investigados, el 64% estaban por encima del umbral de detección de PCR. Para las hisopas de las mismas muestras después de la simulación del servicio postal, entre el 36% y el 47% de las hisopas estaban por encima del umbral de detección (cuadro 3). Sería más práctico tomar muestras con hisopos en lugar de tejidos musculares si los hisopos son suficientes para el análisis de C. chauvoei. Sin embargo, los tejidos musculares dieron más muestras positivas que los hisopos cuando ambos fueron analizados por cultivo y PCR (Tabla 3). La incidencia de C. chauvoei en hisopos de los casos positivos de tejido muscular parecía ser aleatoria. Sin embargo, parecía haber poca o ninguna diferencia si los hisopos se almacenaron durante 1, 3 o 6 días.
Se detectaron muestras de plantas de biogás
Clostridium chauvoei en 3 muestras de 11 en sustrato de biogás antes de la pasteurización, pero no se pudo detectar después de la pasteurización o de la digestión (Cuadro 4). Las bacterias de este tipo de muestras podrían provenir del estiércol o de subproductos animales del matadero, ya que ambas fuentes se utilizan para la producción de biogás. Ninguna de las granjas muestreadas en este estudio envía su estiércol a las plantas de biogás debido a la distancia geográfica, pero los animales se envían al matadero local. También se han notificado casos de gas negro en la zona de captación de la planta de biogás.
Tras el tratamiento del biogás, los residuos digeridos se utilizan como abono. Las bacterias formadoras de esporas pueden sobrevivir a la pasteurización y digestión en las plantas de biogás y, por lo tanto, los residuos digeridos de las plantas de biogás pueden propagar el gas negro a nuevas áreas. Sin embargo, no C. chauvoei se detectó en el producto procesado, por lo que tal vez el medio ambiente en el digestor no es adecuado para C. chauvoei, o la flora en el digestor supera a C. chauvoei. Las esporas clostridiales pueden sobrevivir durante largos períodos en el suelo , lo que debe tenerse en cuenta en estudios posteriores sobre C. chauvoei en digestor.
Muestras de granjas
A pesar de que todas las granjas investigadas habían reportado casos sospechosos de lagarto negro en los últimos años, todas las muestras de heces, suelo y ensilaje dieron negativo para C. chauvoei. Podría haber varias explicaciones para esto. Las esporas todavía podrían estar presentes en el material, pero por debajo del nivel de detección. Además, los inhibidores de la PCR pueden estar presentes en las muestras y la PCR puede verse obstaculizada . Las heces de ganado bovino contienen ácidos grasos volátiles (AGV) y las muestras de suelo pueden contener trazas de metal, que se sabe que interfieren con la reacción de PCR. Sin embargo, el paso de cultivo antes de la PCR reduce la influencia de sustancias inhibidoras.
Desde C. chauvoei es una bacteria del suelo puede ocurrir alguna variación estacional, por ejemplo, las fuertes lluvias pueden contribuir a la propagación de las esporas y la cantidad de esporas en el suelo puede ser más accesible para el ganado. La mayoría de los muestreos se realizaron a principios de otoño, cuando el clima era soleado, por lo que se esperaba que la concentración de esporas en las muestras fuera baja. El número de muestras puede haber sido insuficiente para detectar la contaminación ambiental. Sin embargo, por razones prácticas, rara vez se dispone de un gran número de muestras ambientales sobre el terreno.
Los casos sospechosos de lagarto negro en las granjas se habían producido principalmente en terneros y novillas, pero una granja informó de un caso en una vaca adulta. Siete de las once granjas A-K tenían rutinas de vacunación en el momento de la toma de muestras (Tabla 1).
Dos de las explotaciones almacenaron estiércol antes de esparcirlo y las demás no lo hicieron, pero ninguna de las explotaciones esparció estiércol en los pastos. Según se informa, los veterinarios locales han visto más casos de algas negras después de la limpieza de arbustos en la isla de Öland, especialmente en Alvaret (una llanura de piedra caliza estéril, de casi 40 km de largo y 10 km de ancho, con una flora especial que depende del suelo delgado y el pH alto). Alvaret se utiliza generalmente como pasto en las granjas vecinas. No se había realizado mucha limpieza de arbustos en el año del muestreo.
PCR
Los procedimientos culturales son costosos y requieren mucho tiempo, y la contaminación con otras bacterias anaeróbicas que superan a C. chauvoei con frecuencia causa problemas . Al usar PCR, el ADN de las células viables y no viables se amplifica. Si solo se detectan células viables, se puede aplicar una etapa de enriquecimiento . En este estudio se utilizó cultivo en placas de FAA antes de la PCR para evitar la detección de bacterias inviables y reacciones de PCR falsos positivos. El ADN es fácil de amplificar a partir de cultivos puros, pero surgen problemas con muestras contaminadas, como muestras de residuos biológicos. La detección de ADN por PCR puede verse obstaculizada por numerosas sustancias, incluidos ácidos húmicos, AGV, grasas y proteínas . Sin embargo, la etapa de cultivo antes de la PCR se utilizó como etapa de enriquecimiento y, por lo tanto, reduce la influencia de sustancias inhibidoras. Debido a la flora enjambrada, no se pudo hacer ninguna purificación de las placas de la FAA.
Umbral de detección del método PCR
El nivel de detección fue de 200 ufc / g. Esto puede parecer un nivel de detección deficiente, pero puede explicarse por el hecho de que muestras como estiércol, suelo y sustrato de biogás están muy contaminadas por la flora circundante. Sasaki reportó un nivel de detección de 10 ufc/g, aparentemente en muestras más limpias. Sin embargo, dado que el nivel de detección en nuestro estudio fue de 200 ufc/g y que se esperaba que dichas muestras contuvieran un bajo número de C. chauvoei. Por lo tanto, el método utilizado en el presente estudio no es aplicable en la práctica.
Aspectos medioambientales
El umbral de detección del método PCR tras el precultivo apenas es, en la fase actual, adecuado para garantizar que los animales están libres de infección o para determinar el estado de los pastos. En su lugar, deben utilizarse las recomendaciones actualmente aplicadas, ya que el método no puede utilizarse como base para las rutinas de vacunación. En las zonas donde la peste negra es endémica, se recomienda la vacunación anual antes del pastoreo, a pesar de los costos y el tiempo necesarios.
Este estudio dio algunos indicios de que C. chauvoei no pasa por el proceso de biogás. El número de C. chauvoei en los residuos biológicos tal vez haya disminuido en el digestor hasta situarse por debajo del umbral de detección del método, por lo que el riesgo de dispersión de los residuos digeridos es insignificante. Se necesitan más estudios sobre la supervivencia clostridial a través del proceso de biogás antes de que se puedan extraer conclusiones definitivas. Sin embargo, las ventajas de los residuos digeridos como fertilizante tal vez superen el riesgo de propagación de la gema negra.
