Diagnóstico de inflamación e infección en el sistema urinario a través de proteómica

Fuentes de muestras para evaluar los datos proteómicos urinarios con fines de diagnóstico de orina

La recolección de 120 muestras de orina perfiladas en este estudio no se limitó al diagnóstico, la evaluación de la progresión o el tratamiento de una enfermedad específica. El análisis de orina (AI) de las muestras fue ordenado por los médicos responsables por varias razones, incluyendo lesión aguda, sangrado vaginal, mareos/náuseas, hiperlipidemia, diabetes tipo II y complicaciones asociadas, dolor abdominal/náuseas, hipertensión no especificada, hipertensión de la vejiga, poliuria idiopática y sospecha deTI. Dado que la infección urinaria es una enfermedad infecciosa altamente prevalente relacionada con algunos de los síntomas clínicos mencionados anteriormente (por ejemplo, dolor abdominal/náuseas) y factores de riesgo (por ejemplo, diabetes), esperábamos un diagnóstico frecuente de bacteriuria o infección urinaria a partir de estas muestras. Los análisis proteómicos se limitaron a muestras donde los informes de análisis de orina proporcionaron apoyo provisional para infecciones urinarias causadas por bacterias (ver Métodos). No se analizaron muestras de orina en los casos en que se disponía del diagnóstico específico de bacteriuria asintomática. Se obtuvieron amplios datos de AI para todas las 120 muestras. Esto incluyó pruebas con tiras reactivas, examen microscópico de sedimentos urinarios para varios tipos de células y moco y, en el 46% de los casos, datos de cultivo de orina (CU). También se revisaron los datos sobre la apariencia de la orina, como la turbidez, el color y el color y el volumen de los gránulos de orina. Los resultados del análisis de orina permitieron una comparación exhaustiva de los métodos convencionales para diagnosticar enfermedades del tracto urinario con los datos de las encuestas metaproteómicas (Archivo adicional 3: Tabla A3).

Los neutrófilos, los efectores dominantes de las respuestas inmunitarias innatas en el tracto urinario, explican los altos niveles de inflamación en muchas muestras

Los datos proteómicos arrojaron pruebas sólidas del importante papel de los neutrófilos como efectores y mensajeros de la inflamación en el tracto urinario. Los neutrófilos liberan moléculas antimicrobianas e inflamatorias a partir de gránulos secretores que producen y matan patógenos invasores en los fagolisosomas después de su fagocitosis. Un análisis de agrupamiento jerárquico optimizado para el orden de hojas de muestra (HCLSO) identificó cuatro grupos de muestras con perfiles de abundancia de proteínas humanas dominados por neutrófilos (23 de 111 casos; grupos de NAD1 en la Figura 1) y dos grupos con cantidades de proteínas específicas de neutrófilos comparables a las asociadas con el citoesqueleto (25 casos; grupos de NAD2 en la Figura 1). Las proteínas del citoesqueleto están altamente expresadas en las células epiteliales que recubren el tracto urogenital y constituyen la mayoría del proteoma del sedimento urinario en ausencia de condiciones fisiopatológicas en el tracto urinario. Treinta y cinco de los 48 perfiles de conglomerados de NAD fueron positivos para la identificación de un uropatógeno, incluido G. vaginalis, lo que indica que una razón dominante para la inflamación en los respectivos pacientes fue la bacteriuria y una respuesta inmunitaria hacia los microbios invasores. La razón de las distancias entre los grupos de NAD en el árbol de enlace fue la considerable variación en el número de proteínas humanas identificadas que oscilaban entre 200 y 1.500 ID por muestra.

Análisis de agrupamiento jerárquico de perfiles proteómicos de pellets urinarios para 110 muestras. La agrupación jerárquica se realizó en conjuntos de datos cuantitativos de proteínas humanas utilizando el método TPA en el software MaxQuant. Los conjuntos de datos se sometieron al análisis de correlación de Pearson con optimización del orden de las hojas de la muestra y agrupamiento completo de enlaces utilizando la herramienta de software MeV . Eliminamos el mapa de calor de abundancia de proteínas del árbol jerárquico mostrado de las muestras UP. La parte inferior del panel en el lado izquierdo se conecta a la parte superior del panel en el lado derecho en lo que respecta a los enlaces de árboles. Los nombres de los grupos de muestra, que se muestran en el extremo derecho del gráfico con sus siglas, se discuten en detalle en el texto. Las barras de colores indican el tipo, el tamaño y la posición de cada grupo de muestras en el árbol.

Las abundancias de proteínas de neutrófilos derivadas de datos proteómicos se correlacionan bien con las actividades de LE y los recuentos de leucocitos

Una motivación clave para este estudio fue determinar cómo los datos proteómicos derivados de los sedimentos de orina se compararon con los ensayos convencionales para cuantificar los niveles de inflamación en muestras de orina. Determinamos las cantidades de 35 proteínas que se sabe que están altamente expresadas en neutrófilos activados (Archivo adicional 2: Tabla A2) en relación con la abundancia total de proteínas para cada muestra ASCENDENTE, como se muestra en los segmentos de barra azul de la gráfica que se muestra en la Figura 2. Como era de esperar, el 85% de los casos pertenecientes a los clústeres de NAD1 mencionados anteriormente se encontraban en la sección del gráfico con un contenido de proteína de neutrófilos superior al 30% (en el lado izquierdo). Las 35 proteínas incluían cinco grupos funcionales: las proteínas de la familia S100 de unión al calcio S100-A8, S100-A9 y S100-A12, que aportan entre el 40 y el 50% del contenido total de proteínas citosólicas en neutrófilos; proteínas liberadas durante la inflamación a partir de gránulos de neutrófilos, como mieloperoxidasa (MPO), catepsina G (CTSG), defensin-1 (DEFA1), elastasa (ELANE), lisosoma (LYZ), lactotransferrina (LTF) y catelicidina (CAMP) ; proteínas implicadas en la formación, el tráfico y la fusión de gránulos con fagolisosomas, como grancalcina (GCA), plastina-2 (LCP1), anexina A3 (ANXA3), y tetraspanina (antígeno CD63); proteínas que influyen en la migración de neutrófilos en el entorno de una matriz extracelular en reorganización, como integrina aM/β2, gelatinasa (MMP9) y colagenasa de neutrófilos (MMP8); y NADPH oxidasa, una enzima con múltiples subunidades que incluyen el citocromo b-245 (CYBA, Figura 3) ubicada en la membrana de los fagolisosomas de las células fagocíticas y responsable de la explosión oxidativa que mata directamente a los patógenos. Muchas de estas proteínas, especialmente la defensin-1, eran muy abundantes en muestras con evidencia deTIs (por ejemplo, SA_112 y PM_20, Figura 3). Los patógenos bacterianos en los dos casos fueron S. aureus (SA) y P. mirabilis (PM) y, no de forma inesperada, se ubicaron en el lado izquierdo de la gráfica de la Figura 2 y adyacentes entre sí en un grupo NAD1 (Figura 1). Reconocemos que estos datos reflejan cantidades aproximadas de neutrófilos teniendo en cuenta el hecho de que proteínas como la defensin-1, LTF, S100-A8 y S100-A9 también son liberadas en el tracto urinario por las células uroteliales. Sin embargo, el análisis de agrupamiento jerárquico optimizado para el orden de las hojas de proteínas (HCLPO) mostró que estas proteínas se agrupaban entre sí, apoyando la noción de un papel dominante de los neutrófilos en su producción (Archivo adicional 4: Figura A1). La peroxidasa de eosinófilos (EPX) y la proteína catiónica de eosinófilos (ECP), que también son efectores de la respuesta hacia patógenos, eran un orden de magnitud menos abundante que las proteínas derivadas de neutrófilos, por lo que no apoyan un papel importante de los eosinófilos en la respuesta inflamatoria. El factor inhibitorio de migración específico de macrófagos (MIF) estaba presente en cantidades aún más bajas, lo que sugiere la casi ausencia de macrófagos como participantes en respuestas inmunitarias agudas después de la invasión de patógenos en el tracto urinario.

Perfiles proteicos que muestran las contribuciones cuantitativas de los neutrófilos, el sistema del complemento y los eritrocitos al proteoma total de las muestras de pellets urinarios. El gráfico muestra las abundancias de proteínas sumadas, en relación con el proteoma total, para tres categorías de proteínas biológicas. El eje x enumera los identificadores de las muestras de UP asociadas con 110 sujetos humanos. Las tres categorías representan proteínas producidas por neutrófilos activados (AZUL), proteínas altamente expresadas en eritrocitos y liberadas tras lesión vascular (VERDE), y proteínas asociadas con la actividad y coagulación del sistema del complemento (ROJO). El método utilizado para la cuantificación de todas las proteínas es el método iBAQ en la herramienta de software MaxQuant. El orden de las muestras se basa en la abundancia de proteínas de neutrófilos, disminuyendo de izquierda a derecha. Para permitir comparaciones directas para la evaluación de la inflamación, se incluyó la puntuación para el ensayo LE en el gráfico sobre cada barra que representa una muestra. Debajo del eje x, una barra adicional muestra qué muestras se asociaron con la identificación de un patógeno que causaTI (segmentos de color NARANJA), bacterias comensales (segmentos de color VERDE) o falta de identificación bacteriana (sin color).

la Abundancia de determinadas proteínas neutrófilos en las muestras. Trece proteínas listadas en la leyenda en el extremo derecho son proteínas de gránulos de neutrófilos. Otras tres proteínas son fibrinógeno-β (FGB; implicado en la coagulación), subunidad α de hemoglobina (HBA1; indicativa de lesión vascular), y uromodulina (UMOD; abundante en orina de donantes sanos). Las muestras SA_112 y PM_20 representadas las infecciones urinarias causadas por S. aureus (SA) y P. mirabilis (PM), respectivamente. El perfil de LG_23 (Lactobacillus) indicó la ausencia de inflamación y representó colonización uretral, posiblemente también contaminación vaginal menor de la muestra de orina. KP_10 (K. pneumoniae) parecía representar una infección vaginal, ya que el sangrado vaginal se diagnosticó clínicamente para la paciente. Los perfiles proteicos de EC_13 (UPEC) y KP_55 sugirieron la casi ausencia de inflamación y, por lo tanto, la más probable colonización uretral. Las proteínas se cuantificaron utilizando el método iBAQ, en cada caso dividido por los valores de iBAQ sumados para todo el proteoma ascendente.

Puntuación de NAD

La representación de las cantidades de proteínas de neutrófilos en la gráfica de la Figura 2 se deriva de las puntuaciones de NAD (activación y degranulación de neutrófilos) también proporcionadas en (Archivo adicional 3: Tabla A3). La Figura 2 incluye puntuaciones de LE que van de negativo (N) a traza (T), 1, 2 y 3 para cada muestra. En general, se observa una fuerte correlación entre la abundancia de proteínas de neutrófilos y las puntuaciones de LE. La puntuación LE mide la actividad de la esterasa leucocitaria, que probablemente representa principalmente la elastasa (ELANO) y la mieloblastina (PRTN3), dos proteasas de neutrófilos cuantificadas para ocho muestras en la Figura 3. Todos los perfiles en el lado izquierdo del gráfico (Figura 2) y cincuenta y tres de las 60 muestras con más del 30% de contenido de proteína de neutrófilos (iBAQ) tenían puntuaciones de LE de 2 o 3. Veintinueve de las 40 muestras con un contenido de proteína de neutrófilos inferior al 23% (iBAQ) tenían puntuaciones de LE que iban de negativo a 1. En solo cuatro de los once casos en los que la puntuación de LE fue ≥ 2, pero el contenido de proteínas de neutrófilos fue relativamente bajo, el recuento de leucocitos microscópicos fue superior a 11 células por campo de alta potencia (FHP), un umbral utilizado para definir la piuria. En general, hubo un acuerdo ligeramente menor en la comparación de los recuentos de leucocitos, estableciendo el umbral en 11 células / HPF con un contenido de proteína de neutrófilos superior al 30% (iBAQ): 14 de los 60 casos tenían recuentos ≤ 10 (Archivo adicional 3: Cuadro A3). En resumen, la evaluación del contenido de neutrófilos en los sedimentos de orina a través de la proteómica parece ser al menos tan precisa como el ensayo LE para diagnosticar la inflamación en el tracto urinario. Mide la suma de abundancias de 35 proteínas enriquecidas en neutrófilos y puede ser menos susceptible a resultados falsos positivos en comparación con el ensayo LE.

La abundancia de contenido de proteína eritrocitaria sirve como indicador diagnóstico de lesión vascular

La lesión vascular en el tracto urinario, típicamente asociada con inflamación, se evalúa con pruebas de tira reactiva para hemoglobina y conteo microscópico de glóbulos rojos en análisis de orina convencionales. Teniendo en cuenta el alto enriquecimiento de proteínas distintas en los eritrocitos, pudimos desarrollar un enfoque proteómico equivalente a las pruebas convencionales para hematuria. Se determinaron las abundancias sumadas de 32 proteínas de los glóbulos rojos, incluidas las subunidades de hemoglobina, la proteína transportadora de aniones de la banda 3, la proteína de membrana integral de la banda 7 y la anhidrasa carbónica-1, en relación con el contenido total de proteínas en cada muestra UP, mostradas por los segmentos de barra verde de la gráfica mostrada en la Figura 2. Estas cantidades de proteínas se enumeran como puntuaciones ERY en (Archivo adicional 3: Tabla A3) para cada muestra. No hubo evidencia de una buena correlación de las puntuaciones de NAD o de los resultados del ensayo LE con las puntuaciones de ERY, lo que sugiere que, incluso en los casos de detección de un patógeno (demostrado por la coloración de la barra horizontal en la parte inferior de la gráfica en la Figura 2), la infiltración de neutrófilos en el tracto urinario no siempre conlleva hematuria y lesión tisular significativas. Al establecer los umbrales de hematuria en 2+ para la prueba con tira reactiva y en 4,5% para la puntuación ERY, hubo concordancia entre el 81% de todos los casos. Para los 21 casos en los que las puntuaciones no estaban de acuerdo, se evaluaron los recuentos microscópicos de glóbulos rojos. Utilizando un recuento mayor de 10 células por campo de alta potencia (FHP) como evidencia de hematuria, encontramos que en dos tercios de los casos el análisis microscópico estaba de acuerdo con los datos proteómicos. Concluimos que los puntajes proteómicos ERY proporcionan una buena estimación cuantitativa de la hematuria en orina.

Muestras de orina enriquecidas en proteínas implicadas en las actividades del complemento y la coagulación

Observamos que el análisis de HCLPO aplicado a todos los perfiles proteómicos urinarios agrupó 21 proteínas con funciones funcionales en las vías de coagulación y / o el sistema del complemento (Archivo adicional 4: Figura A1). La justificación para medir la abundancia de proteínas pertenecientes a estas vías inflamatorias conjuntamente también se basó en informes de interacciones funcionales extensas . Se identificaron 42 proteínas asociadas con las actividades del sistema del complemento y la coagulación (CAC) cuyas abundancias sumadas se incluyen como puntuación CAC para cada muestra de UP (Archivo adicional 3: Tabla A3). El sistema de complemento contribuye a la respuesta de fase aguda y a la inmunidad innata, y los componentes distintos son proinflamatorios o antiinflamatorios. Un componente central es el componente de complemento C3. C3 madura en la opsonina C3b y la anafilatoxina C3a y se secreta en el plasma sanguíneo y el tracto urinario después de la producción en células tubulares renales . La C3 desempeña un papel en la infección del tracto urinario superior y en la captación y quietud de la UPEC en las células uroepiteliales, posiblemente asociadas con el problema clínico de las infecciones urinarias recurrentes . A pesar de que las cantidades de proteínas vinculadas a las actividades complementarias y a la coagulación no eran tan altas de proteínas de neutrófilos, el análisis de HCLSO generó dos grupos de muestras, adyacentes en el árbol y con un número total de 12 muestras, caracterizadas por una abundancia relativamente alta de dichas proteínas (los grupos CAC en la Figura 1). Los racimos de CAC revelaron un bajo número de casos con identificación de un patógeno (3 de 12). Las puntuaciones CAC se graficaron en la Figura 2 representada por los segmentos de barra roja de cada muestra (columna). Las altas cantidades totales de proteínas CAC no se correlacionaron bien con las altas cantidades de proteínas de neutrófilos, lo que sugiere que las actividades inflamatorias mediadas por el sistema del complemento (por ejemplo, C3 y C4) y la coagulación (por ejemplo, fibrinógeno) pueden regularse por separado tras la invasión de patógenos u otras tensiones a las que el tracto urinario estuvo expuesto en los pacientes. Se observó con mayor frecuencia que se producían en tándem cantidades elevadas de proteína CAC y ERY. Muchas proteínas de la coagulación y del complemento son de hecho abundantes en el plasma sanguíneo. Este líquido corporal se filtra a la luz del tracto urinario tras una lesión vascular. Las pruebas de análisis de orina equivalentes a la medición de las puntuaciones CAC rara vez se utilizan en los laboratorios clínicos.

Precipitación de sales de ácido úrico y perfiles proteómicos de sedimentos de orina asociados

La inspección visual de las 12 muestras de UP en los grupos CAC reveló que nueve muestras de orina eran muy turbias y diez gránulos de orina relativamente grandes con una coloración de rosa a marrón claro. Estas características se han relacionado con altos niveles de saturación de ácido úrico y precipitación de sales de ácido úrico, especialmente a un pH inferior a 6, en la orina. La precipitación de ácido úrico puede ser un estado precursor de la formación de cálculos urinarios . Es razonable suponer que la apariencia turbia de las muestras contribuyó a identificar erróneamente los precipitados como bacterias durante la microscopía. Solo se disponía de una historia clínica en la que se informaba de la aparición de cálculos renales (GV_64). Aunque el perfil proteómico de este paciente no formaba parte del grupo CAC, las características visuales de la muestra también indicaban turbidez y un color de gránulos de orina de color rosa a marrón claro. Suponemos que las proteínas relativamente abundantes en la fracción soluble de la orina se unen a los precipitados de sal y, por lo tanto, contribuyen a distintos patrones de abundancia de proteínas en las respectivas muestras UP. De hecho, las proteínas generalmente solubles en orina y normalmente de baja abundancia en gránulos urinarios se incrementaron en abundancia en algunas muestras de racimo de CAC en relación con un control sin evidencia deTI y precipitados de sal (LG_21). Ejemplos de tales proteínas son la cadena γ de IgG, AMBP (bikunina) y la cadena γ de fibrinógeno, como se muestra en la Figura 4. Las proteínas defensin-1 y las subunidades HBA1 y HBD de la hemoglobina aumentaron más fuertemente en abundancia en comparación con los datos de LG_21. Aunque se sabe que la mayoría de las proteínas que se muestran en la Figura 4 están aumentadas en orina y plasma como consecuencia de una lesión local y contribuyen a la respuesta de fase aguda, estos datos mostraron una alta variabilidad cuantitativa. La significación patológica, específicamente la lesión en el tracto urinario, no se puede inferir de estos datos. Recientemente se reportaron perfiles proteómicos para la matriz de cálculos urinarios . Entre las proteínas más frecuentemente observadas en la matriz de cálculos se encuentran las cadenas pesadas IgG, subunidades de fibrinógeno, S100-A8, lisozima C y LTF, proteínas que también se muestran en la gráfica de la Figura 4. Se necesitan más investigaciones para evaluar el valor del análisis proteómico para identificar biomarcadores a partir de muestras de orina que contienen precipitados de sal de orina, por ejemplo, para evaluar el riesgo de formación de cálculos renales.

Abundancia de proteínas seleccionadas en muestras con evidencia de precipitación de sal en orina. Las muestras UP que comenzaron con nm_ (sin microbios) no mostraron evidencia de colonización bacteriana, pero los sedimentos de orina tenían una apariencia visual que sugería precipitados de sal de ácido úrico y estaban presentes en dos grupos CAC. LG_21 (Lactobacillus) representaba la ausencia de inflamación. El paciente asociado a la muestra GV_64 (G. vaginalis) fue diagnosticado con cálculos renales. Además de las proteínas descritas en la leyenda de la Figura 3, otras son el componente del complemento C3 (C3), ceruloplasmina (CP), inhibidor activador del plasminógeno-3 (PAI-3), AMBP (bikunina), subunidad de hemoglobina δ (HBD) y cadena γ de inmunoglobulina (Ig gamma). Todas estas proteínas están implicadas en la respuesta de fase aguda, que generalmente se inicia por lesión tisular e invasión de patógenos. Los perfiles de muestra muestran una alta variabilidad de las cantidades de proteínas, aunque en algunas de las muestras se incrementaron proteínas de fase aguda distintas en comparación con el control LG_21.

Colonización uretral por bacterias comensales que no provocan respuestas inmunitarias del huésped

Las tecnologías de secuenciación de ADN altamente paralelas han revelado que la orina no es completamente estéril, y la noción de un microbioma urinario ha evolucionado como un tema de investigación interesante . Es probable que las partes externas de la uretra, especialmente en las mujeres, estén colonizadas con bacterias de origen perineal y vaginal. También es evidente que la recolección subóptima de orina limpia de las pacientes femeninas puede resultar en la contaminación de la orina con proteínas y bacterias comensales de la cavidad vaginal. Los datos presentados aquí pueden explicarse por los dos escenarios mencionados, pero no los distinguen. Aproximadamente el 25% de los perfiles de proteomas urinarios obtenidos en este estudio se enriquecieron con proteínas secretadas en la orina en un entorno fisiológicamente normal (por ejemplo, uromodulina y citoqueratinas) o producidas en abundancia por células epiteliales desprendidas por las superficies mucosas que recubren los tractos urinario y vaginal. El análisis de HCLSO identificó cuatro grupos (Figura 1), un grupo grande con 15 muestras UP, derivado de pacientes femeninas con solo dos excepciones. Los perfiles revelaron una gran abundancia de proteínas citoesqueléticas (por ejemplo, α-actinas y anexinas), proteínas desmosómicas (por ejemplo, desmoplaquina y periplaquina) y proteínas de envoltura celular cornificada (por ejemplo, citoqueratinas, cornulina y proteína pequeña rica en prolina 3). Las proteínas pertenecientes a las dos primeras categorías están presentes en la mayoría de los tipos de células , incluidas las células uroteliales, mientras que el epitelio escamoso estratificado ubicado en el meato uretral y el tracto vaginal produce proteínas de todas estas categorías en abundancia . El examen microscópico de los sedimentos de orina confirmó el aumento del contenido de células epiteliales escamosas con puntuaciones ≥ 2+ para la mayoría de las muestras presentes en los cuatro grupos (archivo adicional 3: Tabla A3), denominados uromodulina y grupos de células epiteliales escamosas con bacterias vaginales (USEV) a partir de ahora. La uromodulina, una proteína que contribuye al equilibrio agua / electrolitos en el tracto urinario , también fue abundante en las muestras del clúster de VEV US. Se identificaron bacterias vaginales (Lactobacillus y G. vaginalis) a partir de 22 de 30 muestras, y las bacterias estaban ausentes en 5 de estas muestras. Los datos proteómicos confirmaron un nivel de inflamación muy bajo para los clústeres de VEV US en el 74% de los casos de acuerdo con las puntuaciones NAD, como se evidencia en las posiciones de las muestras en el gráfico de la Figura 2. Un perfil representativo del cluster USEV es LG-23, con una puntuación NAD del 20% y bajas abundancias de proteínas asociadas a la inflamación, excepto para la defensin-1 y S100A8 (Figura 3). En comparación con los perfiles de SA_112 y PM_20, todas las proteínas que contribuyen a la inflamación fueron menos abundantes en LG_23. G. vaginalis puede ser un patógeno oportunista en el tracto urinario y vaginal. El agrupamiento de los perfiles de proteínas del huésped en los grupos de VEV, seleccionados para los ID de Lactobacillus, G. vaginalis o ambas especies, indicó la falta de una respuesta inmune fuerte hacia estas especies bacterianas. Concluimos que el análisis proteómico tiene valor diagnóstico al proporcionar evidencia de la ausencia de infección en el tracto urogenital de las mujeres.

Colonización uretral por patógenos oportunistas

Los grupos de VEV US incluyeron tres casos en los que se identificaron patógenos comunes del tracto urinario, UPEC y K. pneumoniae. Los dos casos (EC_13 y KP_55) mostraron puntuaciones bajas de NAD y ERY, lo que estuvo de acuerdo con la ausencia de inflamación provocada por neutrófilos y lesión vascular. Las abundancias relativas de las proteínas mostradas en la Figura 3 para estos dos casos y su similitud con el patrón observado para LG_23 respaldaron la noción de que las respuestas inmunitarias características para las infecciones urinarias no fueron provocadas por la colonización por la bacteria. No se puede evaluar si los casos representan bacteriuria asintomática (ASB) debido a la escasez de conocimientos sobre las respuestas inmunitarias a nivel molecular para ASB. En resumen, estos datos apoyan la noción de que los perfiles proteómicos pueden identificar casos de colonización uretral por uropatógenos sin activación del sistema inmunitario innato.

Contaminación vaginal con evidencia de infecciones urogenitales

El análisis HCLSO generó un grupo de muestras UP que llamamos el grupo de contaminación vaginal (VCO), que se muestra en la Figura 1. Los perfiles de conglomerados de VCO presentaron una gran abundancia de proteínas de envoltura celular citoesquelética, desmosómica y cornificada, pero cantidades bajas o moderadas de uromodulina, lo que sugiere que el contenido de proteína vaginal aumentó en estas muestras. Se calculó la puntuación VCO, una relación cuantitativa de cinco proteínas expresadas en tejido epitelial cervicovaginal con especificidad relativamente alta de acuerdo con la base de datos TiGER en comparación con la uromodulina. Estas proteínas eran cornifelina, cornulina, serpina B3, galectina-7 y mucina-5B de proteoglicano. Las moléculas proinflamatorias específicas de neutrófilos, como la proteína S100-A12 y la lisozima (LYZ), y las proteínas indicativas o que responden a la lesión vascular (HBA1 y fibrinógeno-β, respectivamente), fueron más abundantes en el cúmulo VCO en comparación con el cúmulo USEv, como se muestra para KP_10 en comparación con LG_23 en la Figura 3. El grupo de VCO contenía 14 muestras, todas excepto una derivada de pacientes femeninas, la mitad de las cuales se relacionaron con una identificación de un uropatógeno. En cinco muestras se identificó G. vaginalis o Lactobacillus. La evidencia clínica sugirió sangrado vaginal para la paciente perteneciente a la muestra KP_10, lo que respalda el diagnóstico de una infección urogenital o vaginal con K. pneumoniae. Las puntuaciones de VCO se incluyen en el archivo adicional 3: Tabla A3. Una prueba de suma de rangos de Wilcoxon que comparó los puntajes de VCO de los grupos de VCO y USEV arrojó un valor de p de 0,017, lo que sugiere que el puntaje es útil para discernir la contaminación vaginal nula o menor de la mayor en muestras de orina. No se pueden hacer evaluaciones claras con respecto a la utilidad de la puntuación VCO para distinguir una infección urinaria de una infección vaginal.

El análisis proteómico de sedimentos de orina identifica microbios con niveles de sensibilidad y especificidad comparables a los del cultivo de orina

Identificamos bacterias de 76 muestras y Candida albicans de una muestra (63% de todos los casos analizados). Se realizaron cultivos de orina en solo 55 casos, de los cuales el 44% identificó al menos un patógeno, el 24% organismos comensales y el 17% no mostró crecimiento microbiano (Archivo adicional 3: Tabla A3). En el contexto de la identificación de patógenos, los datos proteómicos y los resultados de CU no siempre estuvieron de acuerdo (Tabla 1). Varias razones parecen contribuir a los desacuerdos. A continuación se presentan los desafíos de interpretar los datos metaproteómicos basados en las proteínas microbianas identificadas. En primer lugar, las identificaciones de proteínas de uropatógenos menos comunes pueden perderse debido a la ausencia de sus secuencias de proteínas en la base de datos buscada. Las especies bacterianas representadas en la base de datos se identificaron mediante análisis proteómico (K. pneumoniae y E. faecalis) en dos casos, pero los datos de CU sugirieron la presencia de las especies filogenéticamente cercanas Enterobacter aerogenes y E. faecium, respectivamente. En segundo lugar, los organismos microbianos presentes en baja abundancia en la orina son más difíciles de identificar en presencia de microbios muy abundantes, especialmente si las especies microbianas comparten una identidad de secuencia extensa entre proteínas ortólogas. Los perfiles EC_85 y KP_11 en (Archivo adicional 5: Conjunto de datos A1) ilustran este problema, y en particular se refiere a la familia Enterobacteriaceae que causa la mayoría de todas lasTIs. Anotaciones genómicas inexactas, p. ej. los genes faltantes de una especie (presentes en la muestra UP) dan como resultado la identificación de proteínas ortólogas anotadas correctamente en el genoma de una especie relacionada (pero ausentes en la muestra UP). Los péptidos tripticos pequeños se identifican en un análisis proteómico de escopeta, lo que hace que las asignaciones de proteínas incorrectas por el algoritmo de búsqueda sean más probables en casos de identidad de secuencia elevada. En tercer lugar, la identificación de bacterias presentes en recuentos bajos en orina, menos de ~ 10,000 células/ml, combinada con un fondo proteómico alto del huésped, puede perderse porque las proteínas del huésped y microbianas no se encuestan por separado por LC-MS/MS.Los recuentos bajos de UFC para organismos bacterianos de acuerdo con los datos de la UC mostraron una tasa de coincidencia menor con identificaciones proteómicas que los recuentos altos de UFC (archivo adicional 3: Tabla A3). Por el contrario, las identificaciones proteómicas de microbios tienen la ventaja de que son independientes de los cultivos y proporcionan información sobre la virulencia, la resistencia a los antibióticos, el estrés encontrado y el estado de crecimiento de los patógenos identificados. En el archivo adicional 5: Conjunto de datos A1 se proporcionan dos ejemplos que revelan estos datos exhaustivos. En un conjunto de datos (EC_85), se perfilaron proteínas de UPEC, G. vaginalis y Lactobacillus. En el otro conjunto de datos (KP_11), la causa de laTI fue K. pneumoniae. La Tabla 1 proporciona una visión general de la comparación de la prueba de nitritos, identificando Enterobacteriáceas en orina en función de su capacidad para reducir los nitratos, y los resultados de CU con los datos proteómicos. el 90% de las pruebas de nitrito positivas correspondieron a casos de bacteriuria con UPEC o K. pneumoniae como agente causal, y se identificaron invariablemente con los métodos proteómicos y de CU también. A diferencia del análisis proteómico, las pruebas de nitritos parecían no ser lo suficientemente sensibles para identificar enterobacteriáceas en diez casos. Las pruebas de nitritos no dieron positivo en 21 casos en los que el DH de los análisis proteómicos fue G. vaginalis. En cuanto a las diferencias en los ID de patógenos a través de métodos proteómicos versus CU, se identificaron estreptococos β-hemolíticos mediante experimentos CU en tres casos, mientras que los datos proteómicos sugirieron la presencia de G. vaginalis. Como se muestra en la Tabla 1, el número de ID coincidentes para UPEC y, en menor medida, para K. pneumoniae, fue elevado. En resumen, el método proteómico demostró una sensibilidad más alta que la prueba de nitritos y niveles de sensibilidad y especificidad comparables a la CUCI. El alto fondo proteómico del huésped en una muestra de orina disminuye la sensibilidad para la identificación microbiana.