El colágeno tipo III es crucial para la fibrilogénesis del colágeno I y para el desarrollo cardiovascular normal

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Las células ES (J-1) (22) se transfectaron con un vector objetivo que contenía un fragmento de ADN genómico del gen Col3a1 en el que se eliminó la región promotora del gen y el primer exón que codifica el péptido señal (Fig. 1A). Los clones de células madre embrionarias objetivo se identificaron mediante el análisis Southern blot y se utilizaron para la inyección de blastocitos (Fig. 1B Superior). Los ratones mutantes se derivaron de dos clones de células ES dirigidos de forma independiente e identificados mediante análisis de frotis sureño (Fig. 1B Inferior). El análisis de proteínas del colágeno de cola y piel mostró que los ratones mutantes heterocigotos tienen una reducción de aproximadamente el 50% en el colágeno tipo III, mientras que no se detectó colágeno tipo III en animales mutantes homocigotos (Fig. 1C).

Los animales mutantes eran fértiles, pero solo los ratones heterocigotos eran fenotípicamente normales. Los ratones mutantes homocigotos mostraron una tasa de supervivencia media del 5% a la edad de destete, con la mayoría de las muertes ocurridas dentro de las primeras 48 horas después del nacimiento (Tabla 1). La causa precisa de la letalidad neonatal no está clara porque las crías muertas fueron canibalizadas antes de que pudieran ser examinadas, y el análisis histológico microscópico ligero de mutantes homocigotos recién nacidos vivos no detectó ninguna anomalía grave. Los ratones mutantes homocigotos adultos parecían normales, excepto que eran aproximadamente un 15% más pequeños que sus compañeros de camada silvestres del mismo sexo (datos no mostrados). El promedio de vida de los ratones mutantes homocigotos fue, sin embargo, de unos 6 meses o una quinta parte de la vida normal. La autopsia mostró que la ruptura de vasos sanguíneos fue la causa principal de la vida más corta de estos ratones (Tabla 2). Los sitios de ruptura fueron esporádicos y en su mayoría se asociaron con vasos sanguíneos grandes. Se realizó un análisis histoquímico para encontrar el defecto que causó la fragilidad de la pared del vaso sanguíneo. Higo. 2 A y B muestran una sección transversal de la aorta abdominal normal. La pared de la aorta se compone de íntima y media (Fig. 2A, flecha) y adventicia (Fig. 2 A y B, puntas de flecha). El medio consiste en fibras elásticas (Fig. 2B, flechas grandes) y células musculares lisas (Fig. 2B, flechas pequeñas) y proporciona la elasticidad de la aorta, mientras que la adventicia comprende principalmente fibrillas de colágeno tipo I y limita la dilatación de la aorta. Higo. 2C muestra una sección transversal de un aneurisma de disección de la aorta abdominal de un ratón mutante homocigoto. La ruptura atravesó el medio (flecha), lo que llevó a un canal lleno de sangre (estrella) entre el medio y la adventicia (puntas de flecha) y colapsó parcialmente el lumen de la aorta. La adventicia finalmente se rompió en otra parte, y la sangre se filtró a la cavidad peritoneal, como es el caso en humanos con aneurisma aórtico letal (20). La disposición general de las fibras elásticas y las células musculares lisas (Fig. 2D) fue similar a la de los controles (Fig. 2B). La intensidad y distribución del material de matriz extracelular y la tinción más oscura en la adventicia y entre las fibras elásticas y las células musculares lisas en la íntima de ratones mutantes (Fig. 2D) fueron comparables a los controles de tipo salvaje (Fig. 2B). No se observaron defectos evidentes del corazón y de las arterias medianas y pequeñas en animales mutantes bajo el microscopio de luz (no se muestran los datos).

Además del aneurisma, los ratones mutantes mostraron un agrandamiento intestinal frecuente y una ruptura intestinal ocasional que resultó en la muerte (Tabla 2). Alrededor del 60% de los ratones mutantes homocigotos presentaron lesiones cutáneas, la más grave de las cuales se presentó como una herida abierta de ≈1 cm de longitud en el área del hombro, que penetró completamente en la piel y expuso el tejido subdérmico (Fig. 3). Las heridas no se debieron a peleas entre animales, ya que se observaron en animales enjaulados por separado. El análisis microscópico ligero de la piel, el intestino y otros órganos internos, incluidos el hígado y los pulmones, no detectó ninguna anomalía manifiesta en animales mutantes (datos no mostrados).

Para definir los defectos estructurales en animales mutantes, se realizaron análisis microscópicos electrónicos de aorta y corazón. Higo. 4 muestra que las fibrillas de colágeno ubicadas entre las células musculares lisas o entre las células musculares lisas y las fibras elásticas (Fig. 4A, flechas) estaban ausentes o severamente reducidos en el medio de la aorta mutante (Fig. 4B, flechas). Lo más sorprendente es que en la adventicia, donde la mayoría del colágeno es de tipo I, el diámetro de las fibrillas de colágeno de la aorta mutante fue muy variable (comparar Fig. 4 D a C). Cuando se contaron las fibrillas y se midió el diámetro de estas fibrillas en un área dada de la adventicia, encontramos que el número de fibrillas en mutantes se redujo a aproximadamente un tercio del de tipo salvaje, mientras que el diámetro medio de las fibrillas en mutantes fue aproximadamente el doble del de los ratones de tipo salvaje (Fig. 5). Similar a la aorta, las fibrillas de colágeno entre el epicardio y el miocardio se redujeron o faltaron y las microvellosidades del epicardio estaban subdesarrolladas en el corazón de los ratones mutantes (datos no mostrados).

Además del sistema cardiovascular, se examinó la piel, el intestino, el hígado y el pulmón de ratones mutantes mediante microscopía electrónica. Al igual que con la adventicia de la aorta, el colágeno I fibrila en la piel mutante (Fig. 4F, flechas y puntas de flecha) estaban desorganizados y tenían un diámetro muy variable en comparación con los ratones de tipo salvaje (Fig. 4E, flechas). Esta alteración también se observó en el hígado y los pulmones de ratones mutantes (datos no mostrados). Además, las fibrillas de colágeno faltaban o estaban muy reducidas en la submucosa y la serosa de los intestinos mutantes (datos no mostrados), lo que sugiere que las fibrillas de colágeno en estas áreas son en su mayoría fibrillas de colágeno de tipo III.

Estudios previos que introdujeron mutaciones dirigidas en los genes Col1a1, Col2a1, Col5a2 y Col9a1 han aportado información importante sobre la función de estos colágenos (24-27). Aquí mostramos que el colágeno tipo III tiene un papel crítico en la fibrilogénesis, que es una parte importante del desarrollo de órganos como el sistema cardiovascular, el intestino y la piel. La falta de colágeno tipo III perturbó la fibrilogénesis y resultó en un desarrollo defectuoso y un fallo funcional de estos órganos. En condiciones fisiológicas, el colágeno tipo III no es solo un componente esencial de las fibrillas en tejidos como los medios de la aorta, sino también un elemento regulador importante en la fibrilogénesis del colágeno tipo I. Nuestros resultados sugieren que el colágeno tipo III regula el diámetro de las fibrillas de colágeno tipo I, que sirve como mecanismo para satisfacer los requisitos fisiológicos de diferentes tejidos o de un tejido en diferentes etapas de desarrollo. El fenotipo de ratones con deficiencia de colágeno tipo III se asemeja mucho a las manifestaciones clínicas de los pacientes con síndrome de Ehlers–Danlos tipo IV en los que la muerte es consecuencia de una ruptura de vasos sanguíneos o intestinales (20). Por lo tanto, estos ratones mutantes deben demostrar ser buenos modelos animales para comprender esta enfermedad y, posiblemente, probar enfoques terapéuticos.