El tratamiento de semillas de clotianidina no tiene un impacto negativo detectable en las colonias de abejas y sus patógenos

Diseño del estudio

En 2013, un total de 16 campos (8,9 ± 5,4 ha; media ± s. d.) en el sur de Suecia, destinados a la colza oleaginosa de primavera (Brassica napus L.) se emparejaron de acuerdo con la proximidad geográfica (pero separados por >4 km) y el uso del suelo (Fig. 1, véase supra). Se inspeccionó el paisaje circundante para detectar la ausencia de cultivos con flores. Sin embargo, en 2013, dos campos permanecieron en el estudio a pesar de que otro campo de colza oleaginosa estaba cerca, a fin de retener el mayor número posible de parejas de cultivos34. En cada par de fincas, un campo se asignó al azar para ser sembrado con semillas de colza oleaginosa tratadas con clotianidina, mientras que el otro campo se sembró con semillas no tratadas con clotianidina (tratado: 8; control: 8). En 2014 se utilizaron las mismas granjas emparejadas, pero con los tratamientos invertidos, es decir, las ubicaciones con campos tratados en 2013 tuvieron campos de control en 2014 y viceversa (tratados: 6; control: 4). Debido a la rotación de cultivos, se utilizaron diferentes campos dentro de cada granja en 2013 y 2014 (Fig. 1, véase supra). Para crear la Fig. 1, descargamos un mapa de la Base de datos de Fronteras Mundiales (descargable aquí: http://thematicmapping.org/downloads/world_borders.php).

En la Tabla complementaria 7 se presenta información sobre las variables del paisaje circundante de las diferentes explotaciones en 2014. En 2014, la mitad de los campos focales tenían colza oleaginosa de primavera adicional (1-13 ha) en un radio de 2 km. Las semillas tratadas con clotianidina para los campos focales se cubrieron con Elado, una mezcla de marca registrada de dos ingredientes activos: clotianidina (400 g l−1) y β-ciflutrina (+80 g l−1), elegidas para este estudio porque era el tratamiento insecticida predominante en semillas de colza oleaginosa en Suecia y en otras partes de Europa63. La clotianidina es absorbida por la planta y distribuida sistémicamente a todas sus partes para protegerla contra los insectos64. la β-ciflutrina no se considera sistémica y no se detectaron residuos en las muestras recogidas en este estudio34. Tanto las semillas tratadas con clotianidina como las semillas de control se recubrieron con el fungicida tiram en 2013.

Los agricultores participantes recibieron instrucciones de no utilizar otros neonicotinoides en los campos durante el estudio, aunque se utilizaron otros insecticidas en aerosol foliar, principalmente Plenum (pimetrozina), Avaunt/Steward (indoxacarb) y Mavrik (tau-fluvalinato; también utilizado como varroacida en la apicultura) para el control de plagas (Cuadro complementario 8). Sin embargo, Biscaya, nombre comercial para una formulación en aerosol que contenía el neonicotinoide tiacloprid, se aplicó en un campo de control en 2013, seguido de un aerosol Mavrik 1 semana después, y en un campo tratado en 2014, en ambas ocasiones a 0,3 L ha−1. El tiacloprid tiene una toxicidad aguda considerablemente menor para las abejas que la clotianidina65 y solo se detectaron pequeñas cantidades de tiacloprid en las muestras de polen, néctar y abejas en 2013 y ninguna en 2014. Mientras que Rundlöf et al.34 no se observó ningún cambio en los resultados cuando se excluyeron de los análisis los campos en los que se aplicó vizcaya, se detectaron algunos cambios cualitativos (Tabla Complementaria 9). Estos cambios podrían deberse a los mayores residuos de tiacloprid detectados en 2014, pero es posible que no se relacionen con Biscaya, sino con la diferencia entre Biscaya/Mavrik y las combinaciones alternativas de insecticidas en aerosol utilizadas34, o bien a la reducción del poder estadístico.Colonias de abejas

Colonias de abejas

Ciento dieciséis colonias de abejas fueron preparadas a finales de mayo de 2013 por un apicultor profesional en colmenas de Langstroth de tamaño completo que contenían dos panales con cría principalmente sellada (con abejas), dos panales llenos (con abejas), un panal vacío dibujado, cinco panales con base de cera, abejas sacudidas de dos panales y un niño de 1 año (84 colonias experimentales) o de 2 años-reina vieja (12 colonias experimentales más 20 colonias de reserva) de descendencia conocida para producir abejas relativamente pequeñas, de igual tamaño (3418 ± 123 abejas adultas; media ± s. e.m.; n = 96 colonias) colonias con mucho espacio para el crecimiento que podrían llegar a ser lo suficientemente fuertes para sobrevivir el próximo invierno, pero no superar su espacio durante el verano. Se colocaron seis colonias experimentales a lo largo del borde del campo en cada uno de los 16 campos de colza oleaginosa (96 colonias en total) entre el 14 y el 28 de junio de 2013 al inicio de la floración de la colza oleaginosa (Fig.Suplementaria. 1). El linaje y la edad de las reinas se emparejaban entre las parejas de granjas, pero las colonias se distribuían aleatoriamente. Las colonias se mantuvieron en un campo de colza de invierno de 60 hectáreas manejado orgánicamente en plena floración antes de colocarlas en los 16 campos experimentales (Fig. 1) para asegurar que el crecimiento de la colonia antes del experimento se basara tanto como fuera posible en forrajeo libre de pesticidas.

Cuando cesó la floración de colza oleaginosa en el campo experimental, las colonias se trasladaron entre el 2 y el 31 de julio (Fig. 1) a un colmenar común para pasar el invierno. El 10 de agosto, las colonias recibieron un tratamiento de vapor de ácido fórmico contra ácaros Varroa, consistente en 20 ml de ácido fórmico al 60% empapado en una esponja doméstica plana colocada debajo de la cubierta interior en la parte superior de los marcos. Se alimentó a las colonias con un total de 20 kg de azúcar por colonia en forma de solución de sacarosa al 55-60% v/v, proporcionada en una caja de alimentación en tres ocasiones durante agosto y septiembre de 2013. El 4 de diciembre se llevó a cabo un tratamiento ligero adicional con Varroa rociando 30 ml de ácido oxálico al 2,6% en sacarosa al 60% entre los marcos, directamente sobre el racimo de abejas. En la primavera de 2014, las colonias se trasladaron a un campo de colza oleaginosa administrado orgánicamente antes de colocarlas en los 10 campos de colza oleaginosa sembrados en primavera (Fig. 1). Las colonias se consideraron para su inclusión en la parte de 2014 del estudio si tenían una reina ponedora de huevos de 2 años en abril de 2014 (excluyendo las colonias que murieron, volvieron a formar reina o tuvieron reinas de 3 años en abril de 2014) y no se habían agrupado a principios de junio de 2014. Estas restricciones, además del requisito de que las colonias estuvieran expuestas/no expuestas a la clotianidina durante ambos años del experimento, significaron que en 2014 solo se podían asignar cuatro colonias a cada campo. Las colonias colocadas por campos tratados en 2013 se volvieron a colocar por campos tratados en 2014, a fin de evaluar los efectos acumulativos de la exposición a clotianidina durante varios años, pero se volvieron a aleatorizar antes de la colocación para minimizar los sesgos no deseados. Aun así, dos colonias de control de 2013 tuvieron que ser colocadas por un campo tratado con clotianidina en 2014, debido a que las colonias expuestas calificadas para los seis campos tratados con clotianidina no eran suficientes. Había suficientes colonias disponibles para los cuatro campos de control. La fuerza de las colonias se igualó como se describió para 2013, pero solo dentro de cada grupo de tratamiento. Las colonias se redujeron e igualaron por segunda vez (8 de junio de 2014), después de que algunas de ellas crecieran demasiado y trataran de enjambrarse (Fig. 1). Cada colonia reducida incluía 1 panal de miel completo (con abejas), 3 panales con cría principalmente sellada (con abejas), y la reina original de 2013 y 6 panales con base de cera. Las colonias se trasladaron a los campos de colza oleaginosa de primavera entre el 16 y el 25 de junio de 2014 y se llevaron de vuelta al sitio común de hibernación entre el 14 y el 22 de julio de 2014 (Fig. 1).

Análisis de residuos

Para confirmar la exposición a la clotianidina, se analizaron 24 abejas adultas por campo capturadas en la entrada de la colmena, gránulos de polen recogidos de 5 abejas que se alimentaban en los campos de colza oleaginosa y néctar extraído de los estómagos de 5 abejas que se alimentaban de néctar en los campos de colza oleaginosa de cada sitio en busca de residuos de clotianidina. El polen (> 25 ml) se recogió utilizando trampas de polen, que se instalaron durante 1 día en tres colonias por sitio y se analizaron para determinar el origen de las especies vegetales. Las muestras se manipularon y analizaron como en Rundlöf et al.34 y recogidos durante las evaluaciones de floración máxima en ambos años (Fig. 1), con las concentraciones de clotianidina y otros cuatro neonicotinoides utilizados en Suecia (Cuadro Suplementario 2) cuantificadas mediante cromatografía líquida combinada con espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) y el polen identificado como colza oleaginosa mediante microscopía de luz y una biblioteca de referencia de polen (véase el Cuadro Suplementario 2 para los límites de detección y cuantificación). Para análisis adicionales de la variación en la exposición neonicotinoide de abejas en diferentes sitios, recolectamos 12 abejas por sitio de la entrada de la colmena. Este muestreo se realizó en tres sitios tratados con clotianidina en 2013. El néctar se extrajo del estómago de miel de las abejas recolectadas. Las concentraciones de clotianidina se cuantificaron posteriormente tanto en el néctar como en el tejido de abeja para cada individuo de abeja. Más detalles sobre el tratamiento de muestras para diferentes matrices, el método LC-MS/MS y los controles de calidad se dan en Métodos complementarios.

Desarrollo de colonias, re-re-reina y producción de miel

El desarrollo de colonias de abejas fue evaluado por el mismo observador capacitado y un asistente. Se estableció la presencia de una reina ponedora, así como la presencia de celdas de reina. Si un evento de re-reina fue acompañado por una gran pérdida de abejas adultas, se consideró que había enjambrado. Si no se observaba la pérdida de abejas adultas, se consideraba que la colonia había vuelto a formar una reina por sustitución. La producción y el desarrollo de la miel de colonia se determinó pesando las colonias y evaluando la fuerza de las colonias utilizando el método de Liebefeld66, como el número total de abejas adultas y el área de cría tapada en todos los bastidores. El número de abejas adultas se estimó contando abejas a ambos lados de los 10 marcos. El número de células de cría con tapa (cantidad de cría) se determinó multiplicando la proporción de cobertura de cría cerrada por 2700, que es el número de células en un lado de los bastidores utilizados. Las colonias se pesaron durante las evaluaciones previas y posteriores a la exposición (utilizando una báscula de banco de Mettler Toledo capaz de pesar hasta 32 kg con una precisión de 1 g) para estimar la producción de miel. Los marcos llenos de miel fueron reemplazados por marcos vacíos durante la floración de la colza oleaginosa, para permitir que la colonia creciera y reducir el enjambre. Se pesaron tanto los marcos llenos como los vacíos, para su inclusión en el cálculo de la producción de miel. Durante la evaluación posterior a la exposición, se eliminaron la mayor cantidad posible de marcos de miel (máximo el 10% del área cubierta con cría cubierta) para simular la cosecha de miel de los apicultores. Las evaluaciones previas a la exposición se realizaron en el campo de colza oleaginosa cultivada en invierno con gestión ecológica del 6 al 17 de junio de 2013 y del 9 al 11 de junio de 2014, y las evaluaciones posteriores a la exposición en el apiario común invernal del 29 de julio al 9 de agosto de 2013 y del 28 al 31 de julio de 2014 (Fig.Suplementaria. 1). Además, en abril de 2014 se realizó una evaluación de la fuerza de la colonia primaveral mediante la estimación del número total de abejas adultas y el número de crías coronadas (Fig.Suplementaria. 1). El evaluador y los asistentes de la colonia fueron cegados durante la recolección de datos con respecto al régimen de tratamiento de los campos.

Recogida y procesamiento de muestras de patógenos y parásitos

Se tomaron muestras de alrededor de 100 abejas adultas de cada colonia durante las evaluaciones previas y posteriores a la exposición en los campos experimentales de colza oleaginosa tratados con clotianidina y de control en 2013 y 2014 (Fig.Suplementaria. 1). Las abejas se sacaban del panal exterior de cada colonia y, por lo tanto, consistían en una mezcla de abejas domésticas y abejas forrajeras67. Todas las muestras de abejas se almacenaron a -20 °C hasta que se realizó el trabajo de laboratorio. La V. las tasas de infestación por destructores para cada colonia se determinaron lavando las muestras de abejas adultas con agua jabonosa para desalojar y contar las mitas68. Se retiraron los abdómenes de 60 abejas adultas por colonia (para análisis de colonias individuales) o por colmenar (para el análisis de colonias agrupadas de 2013, 10 abejas por colonia) y se colocaron en una bolsa de polietileno con una malla interna (BioReba). Los abdómenes se molieron en la bolsa con un mortero y se mezclaron a fondo 30 ml de agua sin nucleasas (Mili-Q) (0,5 ml por abeja) con la muestra para crear una suspensión homogénea. Se retiraron varias alícuotas de 1 ml de esta suspensión y se congelaron inmediatamente a -80 ° C para la extracción de ADN y ARN y como material de referencia futuro.

Parásitos, patógenos, microbios simbióticos y genes inmunes

Las muestras de abejas recogidas se evaluaron en busca de una variedad de parásitos y microbios patógenos y no patógenos con el fin de estudiar el impacto de la colocación de colonias en campos tratados con clotianidina en su prevalencia y abundancia. Los organismos incluían el omnipresente ectoparásito Varroa destructor, 13 virus: virus de parálisis aguda de abejas (ABPV), virus de parálisis letal de áfidos (ALPV), virus del río Sioux (BSRV), virus de células de reina negra (BQCV), virus de parálisis crónica de abejas (CBPV), virus de alas deformadas tipo A (DWV-A), virus de alas deformadas tipo B (DWV-B), virus de parálisis aguda israelí (IAPV), virus de abeja de Cachemira (KBV), cepa 1 del virus del Lago Sinaí (LSV-1) y cepa 2 (LSV-2), virus (SBV), virus de parálisis lenta de las abejas (SBPV); dos parásitos intestinales microsporidianos comunes de las abejas melíferas (Nosema apis y Nosema ceranae) y dos bacterias intestinales simbióticas (Gammaproteobacterium: Gilliamella apicola y Betaproteobacterium: Snodgrassella alvi). Para las muestras de 2013, también analizamos a nivel de colmenar los niveles de ARNm de ocho genes de abejas (Amel/LRR, Apidecina, cSP33, Dorsal-1A, similar a un comensal, NimC2, PGRP-S2 y SPH51) cuya expresión se había relacionado previamente con la exposición a pesticidas,patógenos y/o parasitos19, 44 e inmunidad (social) en abejas meliáticas45.

Extracción de ácido nucleico

El ADN se extrajo de los homogeneizados de abejas utilizando el protocolo para extraer el ADN de los esporas de nosema69, que es lo suficientemente robusto para extraer también el ADN de bacterias y otros microorganismos. Se centrifugó un total de 500 µl de homogeneizado primario de abejas durante 5 min en un microfugio a 13.000 rpm. El pellet se congeló repetidamente, se descongeló con nitrógeno líquido y se molió con un micropueste de teflón estéril hasta que se pulverizó. El pellet pulverizado se resuspendió en 400 µl de tampón de lisis DNeasy AP1 de tejidos vegetales Qiagen que contenía 4 µl de RNasa-A (10 mg ml-1) y se incubó y agitó durante 10 min a 65 oC, después de lo cual 130 µl de tampón de neutralización P3 (3,0 M de acetato de potasio pH 5.5), seguido de 5 minutos de incubación en hielo y centrifugación durante 5 minutos a 14.000 rpm para eliminar los residuos de lisis. El ADN se purificó a partir de 500 µl del sobrenadante mediante el robot de extracción automatizado Qiacube de Qiagen, siguiendo el protocolo DNeasy de la planta y elutando el ADN en agua libre de nucleasas de 100 µl. El ARN fue extraído por el robot Qiacube directamente del homogeneizado primario de abejas de 100 µl utilizando el protocolo RNeasy de la planta de Qiagen (incluido el triturador Qia para homogeneización adicional70) y el ARN se elutó en agua libre de nucleasas de 50 µl. La concentración aproximada de ácido nucleico se determinó mediante NanoDrop, después de lo cual las muestras se diluyeron con agua libre de nucleasas hasta obtener una concentración uniforme de 10 ng µl-1 (ADN y LSV−1(ARN)) o 20 ng µl-1 (para todas las demás muestras de ARN) y se almacenaron a -80 °C.

RT−qPCR y qPCR

Los diversos microorganismos y los objetivos de ARNm del huésped se detectaron y cuantificaron mediante transcripción inversa en un paso-cuantitativa PCR (RT-qPCR) para patógenos con un genoma de ARN y los objetivos de ARNm del gen de referencia inmune e interno, o por PCR cuantitativa (qPCR) para organismos con un genoma de ADN. Los detalles de los ensayos se muestran en la Tabla Suplementaria 10, la Tabla Suplementaria 11 y la Tabla Suplementaria 12. La imprimación inversa para Amel/LRR fue ligeramente rediseñada por Di Prisco et al.19 porque la complementariedad extremadamente alta entre los cebadores de avance y retroceso originales resultó en altos niveles de artefactos de PCR que dominaron la señal cuantitativa. Las reacciones se realizaron por duplicado, en volúmenes de reacción de 20 µl (ADN) o 10 µl (ARN) que contenían una plantilla de 2 µl (ADN) o 1,5 µl (ARN), 0,4 µM (ADN) o 0.2 µM (ARN) de imprimación hacia adelante y hacia atrás y la mezcla qPCR verde Bio-Rad Eva (ADN) o la mezcla RT-qPCR iTaq de un solo paso Bio-Rad con química de detección verde SYBR (ARN). Las reacciones se incubaron en placas qPCR ópticas de 96 pocillos en el termociclador Bio-Rad CFX connect, utilizando los siguientes perfiles de ciclo de amplificación: 10 min a 50 °C para síntesis de ADN complementario (ADNc) (solo RT-qPCR): 5 min a 95 ° C (para inactivar la transcriptasa inversa y activar la polimerasa Taq) seguido de 40 ciclos de 10 s a 95 °C para la desnaturalización y de 30 s a 58 °C para el recocido de imprimación, la extensión y la recopilación de datos. Para los ensayos de ADN se utilizaron los siguientes perfiles de ciclo de amplificación: 2 min a 98 °C para la desnaturalización inicial, seguido de 40 ciclos de 5 s a 98 °C para la desnaturalización y 10 s a 60 °C para el recocido de imprimación, la extensión y la recolección de datos. Los ciclos de amplificación fueron seguidos por un análisis de curva de fusión para determinar la especificidad de la amplificación mediante la lectura de la fluorescencia a incrementos de 0,5 °C de 65 °C a 95 °C. En cada placa de reacción se incluyeron controles de ensayo positivos y negativos (sin plantilla). Para cada tipo de ensayo (Tabla Suplementaria 10, Tabla Suplementaria 11 y Tabla Suplementaria 12) se preparó una curva de calibración mediante una serie de dilución de 10 veces de un control positivo de la concentración conocida que cubría 6 órdenes de magnitud, para la conversión de datos cuantitativos, estableciendo el perfil de referencia de la curva de fusión del amplicón y estimando las estadísticas de rendimiento de la reacción.

Conversión y normalización de datos

Las curvas de fusión de las reacciones individuales se evaluaron visualmente para separar amplificaciones inespecíficas, que difieren en los perfiles de temperatura de fusión de los amplicones de ADN/ADNc verdaderos objetivo. Las amplificaciones inespecíficas se eliminaron del conjunto de datos. Todos los ensayos se realizaron por duplicado, y el valor medio de estos dos duplicados se utilizó en cálculos posteriores. Ambos duplicados tenían que producir un valor cuantitativo positivo y pasar el análisis de la curva de fusión para que los datos se incluyeran en el conjunto de datos. Los datos crudos de RT-qPCR de todas las amplificaciones confirmadas se convirtieron posteriormente en números de copia estimados de cada ARN objetivo, utilizando la curva de calibración correspondiente para el ensayo. Estos datos se multiplicaron por los diversos factores de dilución a lo largo del procedimiento para calcular las copias estimadas de cada objetivo por bee69. Dado que el ARN se degrada fácilmente, existe el riesgo de que las diferencias entre muestras individuales en la calidad del ARN (es decir, la degradación) puedan afectar a los resultados70. Para corregir esto, se realizaron ensayos RT-qPCR para el ARNm de un gen de referencia interno común de abeja (RP49) en todas las muestras. Los datos para los objetivos de ARN de interés se normalizaron al valor promedio para el ARNm RP49, corrigiendo así los datos para las diferencias específicas de la muestra en la calidad del ARN con respecto al rendimiento de RT-QPCR70.

Análisis estadísticos

Se compararon las proporciones de polen colectado por abejas procedentes de plantas de colza oleaginosa entre tratamientos (tratamiento de semillas de clotianidina/sin tratar) utilizando un modelo lineal generalizado asumiendo la distribución binominal y corrigiendo la sobredispersión. Las concentraciones de clotianidina en néctar y polen recolectados por abejas y en tejido de abejas se compararon entre tratamientos utilizando pruebas de Wilcoxon–Mann–Whitney. Para comparar las concentraciones de clotianidina en el tejido de la abeja y néctar en abejas individuales entre campos, utilizamos análisis de varianza (ANOVA), con la identidad del campo como predictor. Además, las concentraciones de clotianidina en el tejido y el contenido estomacal de néctar de abejas individuales se relacionaron mediante una regresión lineal múltiple con la identidad de campo y la concentración de clotianidina en el néctar como variables explicativas y la concentración de clotianidina en el tejido de abeja como variable de respuesta.

El estudio siguió en general un diseño Antes-Después-De-Control-Impacto (BACI), con una estructura de campo pareada, repetida durante dos años consecutivos a nivel de colonia para obtener datos sobre el desarrollo de colonias, así como la prevalencia y abundancia de parásitos, patógenos y bacterias intestinales. Los años, 2013 y 2014, se analizaron juntos en un modelo completo, con el tratamiento de semillas, la floración, el año y sus interacciones como factores fijos. El efecto del tratamiento con clotianidina se evaluó por la interacción entre la floración y el tratamiento de semillas, ya que este término refleja la diferencia en el cambio entre los tratamientos sobre la(s) floración (es) de colza oleaginosa. Si la interacción de tres vías (floración × tratamiento de semillas × año) era significativa (es decir, si la variable respondía de manera diferente al tratamiento con clotianidina de un año a otro), el conjunto de datos se dividía por año y el año se eliminaba como factor fijo. Además, el conjunto de datos se analizó durante solo 1 año si los datos consistían en un tamaño de muestra ≤10 en un año, tanto para la prevalencia como para la abundancia de microbiota (Tabla Suplementaria 1). Las colonias que pulularon (8 en campos de control y 10 en campos tratados con clotianidina en 2013; una en un campo de control y dos en campos tratados con clotianidina en 2014) se excluyeron del análisis, ya que el enjambre tiene un gran efecto en el desarrollo de la colonia. También se excluye la colonia única que perdió a su reina durante el transporte antes de la colocación en el campo en 2013 (campo tratado). La exclusión de colonias que pulularon del análisis alteró cualitativamente algunos resultados (ver Tabla Suplementaria 13). Los cambios en el nivel de significación pueden deberse a la reducción de la potencia estadística, la probabilidad aleatoria o los efectos biológicos.Se utilizaron modelos lineales de efectos mixtos (LMM)

para probar el efecto del tratamiento con clotianidina en el desarrollo de colonias, medido como el número de células de cría con tapa (cantidad de cría) y el número de abejas adultas. El tratamiento de semillas (clotianidina o control), la floración (antes o después de la floración de la colza oleaginosa), el año (2013 o 2014) y sus interacciones fueron factores fijos. La identidad de pareja de granja, la identidad de granja y la identidad de colonia se incluyeron como factores aleatorios. La producción de miel se comparó entre tratamientos utilizando un LMM con identidad de pareja de granja y la identidad de granja como factores aleatorios. Se utilizaron modelos mixtos lineales generalizados (GLMM) para probar la influencia del tratamiento con clotianidina en el re-reingreso y la mortalidad de las colonias con identidad de granja como factor aleatorio.

La influencia del tratamiento con clotianidina en el desarrollo de colonias primaverales, medida como el número de abejas adultas y la cantidad de cría, se probó utilizando un LMM y un GLMM, respectivamente, con el tratamiento de semillas como factor fijo y la identidad de pareja de granja y la identidad de granja como factores aleatorios. Para el número de celdas de cría tapadas se utilizó una distribución de error binomial negativo y una función de enlace logarítmico.

Los datos del microbioma y del ácaro Varroa se analizaron tanto en su carácter binomial (presencia/ausencia) como cuantitativo (abundancia), utilizando GLMMs (con distribuciones de error binomial y función logit link) y LMM (con distribuciones de error normal), respectivamente, con tratamiento de semillas, floración, año y sus interacciones como factores fijos. El GLMMS en la prevalencia de microorganismos o ácaros Varroa incluyó solo la identidad de la colonia como factor aleatorio, ya que el tamaño efectivo de la muestra (es decir, el resultado menos frecuente de los datos de presencia/ausencia) no permitió la inclusión de más factores aleatorios. Solo se analizaron organismos y años con un tamaño de muestra (efectivo) >10 para los datos de prevalencia y abundancia. Además, se excluyeron del análisis de abundancia las colonias que al menos una vez no dieron positivo para un microorganismo en particular. La abundancia de patógenos de abejas y bacterias se transformaron logarítmicamente (log10), ya que generalmente se distribuyen exponencialmente. Los LMM en abundancia de organismos objetivo contenían identidad de pareja de granjas, identidad de granjas e identidad de colonias como factores aleatorios. El número de ácaros varroa por cada 100 abejas y el peso de la colonia se transformaron de raíz cuadrada para evitar residuos no distribuidos normalmente. Los intervalos de confianza se calcularon en función de la probabilidad del perfil. Para los datos transformados de raíz cuadrada, las estimaciones se volvieron a transformar a la escala original para las ilustraciones gráficas.

Las transcripciones de genes inmunes solo estaban disponibles para 2013 y a nivel de colmenar, pero también siguieron el diseño BACI. Los LMM en la expresión génica contenían el tratamiento de semillas y la floración como factores fijos y la identidad de la granja como factores aleatorios.

Los análisis de datos estadísticos se realizaron utilizando R, excepto para los análisis relacionados con la verificación de la exposición a la clotianidina y el uso de la tierra, para los cuales SAS 9.4 para Windows (SAS Institute Inc.) fue utilizado. Los LMM se ajustaron utilizando la función lmer del paquete lme4 y los GLMM se ajustaron utilizando la función glmmTMB del paquete glmmTMB en los valores de P de los GLMM se calcularon mediante pruebas de razón de verosimilitud. Los valores de P de LMMs se calcularon utilizando la función Anova del paquete car, por lo que se utilizaron pruebas F de tipo III para modelos que contenían interacciones y pruebas F de tipo II para modelos sin interacciones (es decir, evaluación de primavera y producción de miel). Los efectos de los factores fijos se estimaron utilizando contrastes de suma a cero en todos los modelos, excepto en los de residuos neonicotinoides. Los contrastes de suma a cero permiten la determinación de los principales efectos/interacciones (es decir, la estimación independientemente de otras variables independientes) y muestran los efectos de los factores como desviaciones de la gran media (intersección). Para los factores con dos niveles, la magnitud de la desviación de cada nivel de la gran media es la misma, pero la dirección difiere. Representamos los efectos de los factores (tratamiento de semillas, floración, año), como la desviación del segundo nivel (clotianidina, después de 2014) de la gran media. Este fue también el caso de las interacciones, de modo que, por ejemplo, la interacción entre el tratamiento de semillas y la floración indica en qué medida las colonias expuestas a clotianidina diferían en el cambio en la floración de la colza oleaginosa del cambio medio de ambos tratamientos.

Análisis de potencia

Realizamos análisis de potencia para el número de abejas adultas y el número de células de cría con tapa y producción de miel para investigar el tamaño del efecto que podríamos detectar potencialmente dado nuestro diseño, replicación y elección de modelo. La potencia se determinó para un rango de tamaños de efectos a un nivel de confianza nominal de α = 0,05 mediante 1000 simulaciones de Monte Carlo por tamaño de efecto utilizando la función powerSim del paquete simr. La potencia se calculó para un rango de tamaños de efecto, expresado como el cambio en el número de abejas adultas, el número de células de cría con tapa o la producción de miel. Dividiendo el tamaño del efecto con el número medio de abejas, el número medio de células de cría o la producción de miel de todas las colonias de control, se obtuvo el tamaño del efecto expresado como el cambio porcentual de esas matrices (Fig.Suplementaria. 3). Este análisis de potencia permitió comparar nuestro tamaño de efecto con el tamaño de efecto presentado por Rundlöf et al.34. Utilizando el modelo completo, pudimos detectar un tamaño de efecto para el número de abejas adultas inferior al 5% con una potencia del 80% en comparación con el tamaño de efecto inferior al 20% presentado por Rundlöf et al.34. Esto es incluso inferior a los requisitos de un tamaño de efecto <7% establecido por EFSA32. Como resultado de una interacción significativa entre el tratamiento de las semillas, la floración y el año, el conjunto de datos para el número de células de cría con tapa se analizó por separado para cada año. Por lo tanto, presentamos aquí el análisis de potencia para cada año. El tamaño del efecto al que se alcanzó el 80% aumentó de menos del 10% en 2013 a ligeramente por debajo del 11% en 2014 (Fig.suplementaria. 3), probablemente debido a la reducción de la replicación en 2014. También se realizó un análisis de potencia de producción de miel (cantidad de miel por colonia en kg) utilizando el conjunto de datos de ambos años, mostrando que se podía detectar un tamaño de efecto inferior al 20% con una potencia del 80% (Fig.Suplementaria. 3).

Resumen de informes

Más información sobre el diseño experimental está disponible en el Resumen de informes de Nature Research vinculado a este artículo.