Frontiers in Endocrinology

Introducción

El síndrome de ovario poliquístico (SOP), la principal causa de anovulación e infertilidad entre las mujeres en edad reproductiva, es el trastorno endocrino más común que afecta al 5-10% de las mujeres en todo el mundo (1). La lipólisis acelerada y la posterior dislipidemia en mujeres con SOP se asocian con anomalías metabólicas, como obesidad, resistencia a la insulina y diabetes tipo 2 (DM2) (2). Los cambios reflejados en el líquido folicular (FF) del folículo dominante (3, 4) pueden afectar directamente la calidad y el metabolismo de los ovocitos. La inflamación crónica de bajo grado es comúnmente culpada como un mecanismo etiopatogénico de infertilidad. Las citocinas inflamatorias son significativamente más altas entre las mujeres con infertilidad inexplicable (5). Se ha demostrado que los factores proinflamatorios están significativamente asociados con mayores tasas de fracaso de la fertilización in vitro (FIV), especialmente en la etapa de implantación, en mujeres con infertilidad inexplicable (6). Los estudios han encontrado niveles elevados de interferón gamma (IFN-γ) e interleucina-2 (IL-2) y niveles reducidos de factor de crecimiento transformador beta (TGF-β), un importante mediador antiinflamatorio endógeno (7) en el plasma de mujeres con infertilidad inexplicable en comparación con controles fértiles durante la ventana de implantación (fase lútea) (8). Además, los pacientes infértiles sin explicación han demostrado niveles elevados de IL-2, IL-4, IL-6, IL-21, factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) e IFN-γ en suero, en comparación con las mujeres fértiles (5).

Los efectos beneficiosos de los suplementos de cromo ya se han reportado en anormalidades metabólicas entre mujeres que sufren de SOP. En un metaanálisis realizado por Fazelian et al. (9), la suplementación con cromo disminuyó la insulina sérica y la testosterona libre y mejoró el peso corporal en pacientes con SOP. Ya hemos publicado las ventajas de tomar suplementos de cromo durante 8 semanas en el control glucémico, los parámetros de riesgo cardiometabólico y el estrés oxidativo en mujeres infértiles con SOP que eran candidatas a FIV (10). Además, la suplementación con cromo en ratas diabéticas mostró actividades antidiabéticas, que se pueden explicar a través del impacto del cromo en la modulación de los receptores gamma activados por el proliferador de peroxisomas (PPAR-γ), el sustrato 1 del receptor de insulina (IRS-1) y las proteínas de factor nuclear kB (NF-kB) (11). De manera similar, Wang et al. (12) encontraron que en comparación con las ratas de control obesas, las suplementadas con cromo tuvieron una mejora significativa en sus tasas de eliminación de glucosa y una elevación en la actividad de la quinasa p-IRS-1 y fosfatidilinositol-3 estimulada por insulina en los músculos esqueléticos. En otro experimento con animales, la ingestión de cromo durante 7 semanas, por ratas diabéticas, disminuyó significativamente los marcadores inflamatorios, incluidas la proteína C reactiva (PCR), el TNF-α y la IL-6 (13).

Teniendo en cuenta los efectos antidiabéticos y hipolipemiantes del cromo (11, 14), planteamos la hipótesis de que la suplementación con cromo podría ser beneficiosa en mujeres con SOP y candidatas a FIV, que sufren diferentes anomalías metabólicas. Según nuestro mejor conocimiento, no se ha publicado nada sobre los efectos de la suplementación con cromo en la expresión génica de la insulina, los lípidos y los marcadores inflamatorios en mujeres infértiles con SOP que eran candidatas para la FIV. El objetivo de este ensayo fue determinar los efectos de la suplementación con cromo en la expresión génica de la insulina, los lípidos y los marcadores inflamatorios en mujeres infértiles que sufrían de SOP y eran candidatas para la FIV.

Materiales y métodos

Diseño del ensayo y Características de los Participantes

Este ensayo aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo fue registrado por el sitio web iraní para el registro de ensayos clínicos (http://www.irct.ir:IRCT20170513033941N32). Se incluyeron cuarenta mujeres infértiles con SOP, de 18 a 40 años, que eran candidatas para FIV sin antecedentes previos de FIV. Este estudio se realizó en el Hospital Taleghani, Teherán, Irán, entre febrero y mayo de 2018. Se utilizaron los criterios de Rotterdam para confirmar el diagnóstico de SOP (15). Se excluyó del estudio a los participantes con anomalías metabólicas como disfunción tiroidea, diabetes o alteración de la tolerancia a la glucosa. Esta investigación se realizó de acuerdo con la Declaración de Helsinki y las directrices de Buenas Prácticas Clínicas, y fue aprobada por el comité de ética en investigación de la Universidad de Ciencias Médicas Shahid Beheshti (SUMS), Teherán, Irán. Todos los individuos firmaron el consentimiento informado por escrito.

Intervención

Los participantes se asignaron aleatoriamente en grupos de intervención para tomar 200 µg/día de picolinato de cromo (Nature Made, California, EE.UU.) (n = 20) o placebo (Barij Essence, Kashan, Irán) (n = 20) durante 8 semanas. Los suplementos de cromo y los placebos se combinaron en términos de forma, apariencia, olor y embalaje. La aleatorización se realizó utilizando números aleatorios generados por computadora. El proceso de aleatorización y asignación se ocultó tanto a los investigadores como a los participantes hasta la finalización de los análisis finales. Otra persona, que no participó en el ensayo e ignorante de las secuencias aleatorias, asignó a los sujetos a los frascos numerados de tabletas. Se monitorizó la adherencia a los suplementos y placebos, a lo largo del ensayo, pidiendo a los individuos que trajeran los envases de los medicamentos de vuelta. Para aumentar la tasa de cumplimiento, todos los participantes recibieron breves mensajes de recordatorio diarios en sus teléfonos celulares para tomar los suplementos. Los participantes del estudio completaron los registros dietéticos en las semanas 0, 4 y 8 de la intervención.

Evaluación de los resultados

Los niveles séricos de proteína C reactiva de alta sensibilidad (PCR-as) se consideraron como el resultado primario y los perfiles metabólicos se midieron como los resultados secundarios. Se recogieron muestras de sangre en ayunas (15 ml) al principio y al final de la intervención de 8 semanas en el Hospital Taleghani (Teherán, Irán). Los niveles de PCR-HS se midieron utilizando un kit ELISA comercial (LDN, Nordhorn, Alemania) con varianzas de coeficiente de ensayo inter e intra (CVs) inferiores al 7%. Los niveles plasmáticos de óxido nítrico (NO) se midieron utilizando el método de Griess (16) con CV intra-ensayo < 5%.

Aislamiento de Células Linfocitarias

Se utilizaron muestras de sangre para extraer células linfocitarias, utilizando percoll al 50% (Sigma-Aldrich, Dorset, Reino Unido). El recuento celular y la prueba de viabilidad se realizaron utilizando azul tripano, ARN y extracción de ADN (17).

Extracción de ARN y PCR en tiempo Real (RT-PCR)

El ARN se extrajo de muestras de sangre utilizando el kit RNX-plus (Cinnacolon, Teherán, Irán). La suspensión de ARN se congeló a -20 ° C hasta que se derivó el ADNc. Tras la extracción de ARN totales de cada muestra, el ARN se cuantificó mediante espectrofotómetro UV. La proporción de DO 260/280 de cada muestra de 1,7 a 2,1 no representaba contaminación con proteínas ni ADN (17). Utilizando la transcriptasa inversa (RT) del virus de la leucemia murina moloney, el ARN aislado se transcribió de forma inversa a la biblioteca de ADNc. Se realizaron expresiones génicas de PPAR-γ, transportador de glucosa 1 (GLUT-1), receptor de lipoproteínas de baja densidad (LDLR), IL-1, IL-8, TNF-α, TGF-β y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) en células mononucleares (PBMC) de sangre periférica, utilizando el Kit de detección y Amplicón verde SYBR y aplicando tecnología cuantitativa de RT-PCR y Ciclociclador ligero (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Suiza) (Tabla 1). Se utilizaron cebadores de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) como gen de limpieza. Los cebadores se diseñaron utilizando el software Primer Express (Applied Biosystems, Foster City, EE.UU.) y el software Beacon designer (Takaposizt, Teherán, Irán). Los niveles relativos de transcripción se calcularon utilizando los métodos Pffafi o 2−ΔΔCT.

El tamaño de la muestra y los Métodos Estadísticos

El tamaño de la muestra se calculó utilizando la fórmula establecida para los ECA, considerándose errores de tipo uno (α) y tipo dos (β) como 0,05 y 0.20 para proporcionar la potencia del 80%. En base a un estudio publicado previamente (18), se utilizó una diferencia media (d) de 1500,0 ng/ml y una desviación estándar (DE) de 1496,1 ng/ml para PCR-as para calcular el tamaño de la muestra. Teniendo en cuenta una probable deserción de 4 sujetos en cada grupo de intervención, se determinó que el tamaño de la muestra final era de 20 (16 + 4) sujetos por grupo.

La normalidad de los datos se evaluó mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov. Los análisis se realizaron utilizando el enfoque por intención de tratar (ITT). Se aplicó la prueba t de muestras independientes para determinar las diferencias en las medidas antropométricas y la expresión génica de insulina, lípidos e inflamación entre los grupos de intervención. Los efectos de la suplementación con cromo sobre los marcadores inflamatorios se evaluaron mediante la prueba ANOVA de medidas repetidas. Las diferencias en las proporciones se evaluaron mediante la prueba exacta de Fisher. Los valores de P < 0,05 fueron considerados estadísticamente significativos. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el Paquete Estadístico para Ciencias Sociales versión 18 (SPSS Inc., Chicago, Illinois, EE.UU.).

Resultados

Se reportaron tres abandonos en cada grupo de intervención, por motivos personales. Así, en total, 34 participantes completaron el estudio (Figura 1). Utilizando el enfoque ITT, los 40 participantes (20 en cada grupo) se incluyeron en el análisis final de los datos. La tasa de cumplimiento en este estudio fue alta, con más del 90% de los comprimidos consumidos durante la intervención en ambos grupos. En este estudio, no se notificaron efectos secundarios tras el consumo de cromo en mujeres con SOP.

Las medidas antropométricas no fueron estadísticamente diferentes entre los grupos de intervención (Tabla 2). Además, después de la suplementación con cromo, los resultados de FIV, incluido el grosor endometrial, el número de ovocitos recuperados, el número de ovocitos fertilizados, la tasa de fertilización, la tasa de embarazo y el número de embriones, no fueron significativamente diferentes entre los grupos suplementados y los de placebo.

El promedio de ingestas de macro y micronutrientes tampoco fue significativamente diferente entre los dos grupos de intervención a lo largo del tratamiento (no se muestran los datos).

La suplementación con cromo también redujo la expresión génica de IL-1 (P = 0,004) en PBMCS en comparación con el placebo (Figura 3). No hubo un efecto significativo de la suplementación con cromo en la expresión génica de IL-8, TNF-α, TGF-β y VEGF en PBMC de pacientes con SOP.

Discusión

Se encontraron efectos beneficiosos de la administración de cromo durante 8 semanas en mujeres infértiles con SOP que eran candidatas para FIV. La suplementación con cromo redujo la inflamación y mejoró la expresión génica de PPAR-γ, GLUT-1, LDLR e IL-1, aunque no afectó la expresión génica de IL-8, TNF-α, TGF-β y VEGF. Hasta donde sabemos, este es el primer ensayo que reporta los efectos de la suplementación con cromo en la expresión génica relacionada con la insulina, los lípidos y los marcadores inflamatorios en mujeres infértiles diagnosticadas con SOP y candidatas a FIV.

Efectos del cromo en la Expresión Génica de la Insulina y el Metabolismo Lipídico

Los pacientes con SOP son vulnerables a diferentes anomalías metabólicas, como aumento de la resistencia a la insulina, dislipidemia e inflamación crónica (19, 20). El estudio actual reveló que la suplementación con cromo durante 8 semanas a mujeres infértiles con SOP que eran candidatas para FIV aumentó significativamente la expresión génica de PPAR-γ, GLUT-1 y LDLR. De acuerdo con nuestros hallazgos, la administración de cromo a ratas diabéticas mostró actividades antidiabéticas, probablemente relacionadas con el impacto del cromo en la modulación de las proteínas PPAR-γ e IRS-1 (11). Wang et al. (12) también encontraron que las ratas obesas suplementadas con cromo aumentaron significativamente sus tasas de eliminación de glucosa. Además, en comparación con los controles obesos, estas ratas mostraron una elevación de la actividad de la quinasa p-IRS-1 estimulada por insulina y fosfatidilinositol-3 en los músculos esqueléticos. En otro estudio, el cromo, la biotina o su combinación regularon significativamente la expresión de PPAR-γ en el tejido adiposo, lo que podría tener un impacto eficaz de sensibilización a la insulina y reducir la resistencia a la insulina en un modelo de rata diabética (11). El cromo también puede promover el tráfico de GLUT-4 y el transporte de glucosa estimulado por la insulina (21). Del mismo modo, las ratas con retinopatía diabética que fueron suplementadas con cromo durante 12 semanas mostraron una mejora en la expresión génica de GLUT-1, GLUT-3 e insulina (22). PPAR-γ es el regulador central del metabolismo de la insulina, la glucosa y los lípidos que se expresa ampliamente en el tejido adiposo. El PPAR-γ podría mejorar la sensibilidad a la insulina y los perfiles lipídicos en pacientes con diabetes tipo 2, así como en modelos de roedores diabéticos (23). La evidencia actual sugiere que los agonistas PPAR-γ pueden ser beneficiosos para disminuir los lípidos corticales renales y la proteinuria a través de un mecanismo independiente de su impacto hipoglucémico (24, 25).

Efectos del cromo en la Expresión Génica de Marcadores Inflamatorios

Nuestro estudio confirmó que la administración de cromo durante 8 semanas disminuyó significativamente la expresión génica de IL-1 y los niveles séricos de PCR-as en mujeres infértiles con SOP que eran candidatas para FIV, aunque no afectó la expresión génica de IL-8, TNF-α, TGF-β y VEGF. La evidencia actual que demuestra los efectos de la suplementación con cromo en la expresión génica de marcadores inflamatorios y sus niveles circulantes es escasa y se limita principalmente a estudios en animales. La suplementación con cromo durante 8 semanas a ratas con grasa diabética Zucker (ZDF) disminuyó significativamente sus niveles séricos de PCR (26). En otro estudio, la ingestión de niacinato de cromo durante 7 semanas redujo los niveles de citocinas proinflamatorias (TNF-α, IL-6 y PCR), el estrés oxidativo y las concentraciones de lípidos en ratas diabéticas (13). Además, la administración de un suplemento nutricional que contenía picolinato de cromo, fosfatidilserina, ácido docosahexaenoico y boro durante 12 semanas disminuyó significativamente las concentraciones de PCR y TNF-α en ratas alimentadas con dieta alta en grasas (27). No encontramos ningún efecto significativo de la suplementación con cromo en IL-8, TNF-α, TGF-β y VEGF, lo que podría explicarse mediante la aplicación de diferentes diseños de estudio, el tipo y las dosis de cromo utilizadas, la duración de la intervención y las características de los participantes. Las dosis más altas de cromo pueden mejorar significativamente los perfiles metabólicos, incluidos IL-8, TNF-α, TGF-β y VEGF. Los marcadores de inflamación y estrés oxidativo están elevados en muchos pacientes diabéticos, lo que representa positivamente la inflamación vascular (28). La resistencia a la insulina y la posterior inflamación vascular son los principales factores de riesgo para desarrollar ECV (29). El efecto supresor del cromo sobre los marcadores proinflamatorios puede facilitarse mediante la inactivación de las vías de estrés oxidativo y la reducción de la fosforilación de Akt asociada con la cascada de resistencia a la insulina en el hígado (30). La evidencia actual ha demostrado que el aumento de citocinas inflamatorias está involucrado en los resultados de la FIV. En un estudio realizado por Haimovici et al. (31), las mujeres que dieron a luz a su feto tenían niveles más bajos de IL-6. La inhibición de las células lúteas que producen progesterona en presencia de IL-1β puede ser uno de los factores que conducen al fracaso de la implantación (32). El aumento del TNF-α e IL-6 folicular podría deteriorar el microambiente en el folículo, afectando negativamente la calidad de los ovocitos y embriones (33). En otro estudio realizado por Levin et al. (34), los niveles más altos de PCR, durante la estimulación de FIV, se asociaron significativamente con el fracaso de la concepción. De acuerdo con la evidencia publicada mencionada anteriormente, asumimos que los resultados de la FIV pueden verse influenciados por la reducción de la inflamación. Un estudio reciente mostró que el uso de inhibidores de TNF-α e inmunoglobulina intravenosa mejoró significativamente los resultados de la FIV, incluyendo; tasas de implantación, embarazo clínico y nacidos vivos en mujeres jóvenes infértiles que tenían niveles altos de citocinas T helper 1/T helper 2 (35).

Hubo algunas limitaciones en este estudio. Debido a la financiación inadecuada, no pudimos medir los niveles de cromo y no pudimos evaluar los efectos del cromo en la expresión génica del estrés oxidativo.

En general, nuestro estudio sugiere las ventajas de la suplementación con cromo en la reducción de los marcadores inflamatorios a través de la mejora de la expresión génica de PPAR-γ, GLUT-1, LDLR e IL-1in en mujeres infértiles con SOP que eran candidatas para FIV.

Las contribuciones de los autores

Z ayudaron en la concepción, diseño y análisis estadístico del manuscrito. MA, SZ, NM, EA y SS contribuyeron en la recolección de datos y la redacción de manuscritos. ZA supervisó el estudio.

Financiación

Este estudio fue apoyado por una subvención del Vicerrector de Investigación de la Universidad de Ciencias Médicas Shahid Beheshti y Teherán, Irán.

Declaración de Conflicto de Intereses

Los autores declaran que la investigación se realizó en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un conflicto de intereses potencial.