Genómica comparativa de Clostridium bolteae y Clostridium clostridioforme revela propiedades genómicas específicas de especie y numerosos determinantes supuestos de resistencia a los antibióticos

Características generales de los genomas revelan variaciones intra e interespecies

Un total de 1 a se generaron 21 contiguos a partir del ensamblaje de lecturas de Illumina (134 a 185 veces de cobertura) para las seis cepas de C. bolteae (Tabla 1). Se generaron un total de 10 a 48 contiguos (82 a 264 veces la cobertura) para las seis cepas de C. clostridioforme. El tamaño total del genoma varió entre especies y cepas. El tamaño de C. bolteae varió de 6159 kb para la cepa 90A7 a 6480 kb para la cepa 90B3 con secuencias codificantes de ADN (CDSs) 5833 y 6059, respectivamente, y cuatro genes ARNr 16S. El tamaño del genoma de C. clostridioforme fue menor, de 5467 kb para la cepa 90A3 a 5970 kb para la cepa 90A6 con 5231 a 5916 CDSs, respectivamente, y cuatro genes ARNr 16S. El árbol filogenético basado en las secuencias de ARNr 16S mostró que las C. bolteae y C. clostridioforme estudiadas estaban estrechamente relacionadas con C. hathewayi, C. aldenense, C. citroniae, C. saccharolyticum y C. symbiosum, miembros del Clostridium cluster XIVa de Firmicutes, como se informó anteriormente (datos no mostrados).

Los genomas de C. bolteae y C. clostridioforme son genomas grandes, donde prevalece la redundancia genética (no se muestran datos). Los genes redundantes estaban involucrados en una variedad de vías metabólicas, incluido el metabolismo del carbono, el transporte, el metabolismo del hierro y la biosíntesis de aminoácidos. Las diferencias en el número de CDSs entre genomas reflejaban la variación en la redundancia genética más que la ganancia o pérdida de funciones particulares. Además, los genomas integraban elementos móviles, es decir, transposones, Secuencias de Inserción, plásmidos o fagos (integrasa, proteína de la cápside,…) indicativos de transferencias laterales de genes. Algunos de ellos portaban genes de resistencia a los antimicrobianos (ver más abajo).

Para examinar el pangenoma de las dos especies, comparamos las 97.210 CDSs obtenidas de los 12 genomas recién secuenciados con los de otros cinco genomas (C. bolteae BAA613, C. bolteae WAL-14578, C. clostridioforme CM201.1, C. clostridioforme 2149FAA.1, y C. clostridioforme WAL-7855). Todos los CDSS se agruparon utilizando el algoritmo BlastClust a alta rigurosidad, por encima de un corte de identidad de secuencia del 90% y una superposición de longitud del 90%. Se encontraron un total de 10.530 racimos. Solo 2294 (21,78 %) racimos fueron compartidos por las dos especies.

Utilizando solo genomas recién secuenciados, estimamos el genoma central (de la especie) y los genes (específicos de la cepa) de las seis C. bolteae y las seis C. clostridioforme (Tabla 1). Un total de 3714 genes formaron el genoma central de C. bolteae. El número de genes específicos de la cepa en esta especie varió de 73 a 846. En C. clostridioforme, 3660 genes definieron el genoma central. Un total de 2409 grupos fueron compartidos por las dos especies; 1305 genes fueron específicos de C. bolteae y 1251 de C. clostridioforme.

C. bolteae 90A7 y 90B8 tuvieron el mayor número de genes únicos para esta especie (735 y 846, respectivamente). C. clostridioforme 90A8, con 1006 genes únicos (17%), tuvo el mayor número de genes específicos de cepa en este estudio. Estas cepas integraban un gran número de elementos móviles. Algunos CDSS únicos fueron anotados como transportadores o reguladores. Pocos de ellos estaban involucrados en mecanismos de defensa (genes de resistencia a los antimicrobianos)..) o vías metabólicas. La mayoría de ellos, a menudo rodeados de CDSs de fagos o transposones, tenían funciones desconocidas (no se muestran datos).

Diferencias funcionales entre especies en los genomas centrales

El desafío de nuestro estudio fue proporcionar información confiable a partir de genomas preliminares. Por lo tanto, centramos nuestro análisis en los genomas centrales. La clasificación de los CDSs según el sistema de Clusters of Orthologous Groups (COGs) permitió dar una visión general de las funciones mostradas por las dos especies. The core genomes of C. bolteae and C. el clostridioformo se enriqueció (más del 7% de los recuentos totales de COG) en las categorías K, E, G y R del COG en relación con la Transcripción (309 y 290 CDSs), el transporte y metabolismo de aminoácidos (335 y 276 CDSs), el transporte y metabolismo de carbohidratos (431 y 425 CDSs) y la predicción de la función general (366 y 331 CDSS) (Cuadro 2).

Mientras que C. bolteae y C. los clostridioformos están fenotípicamente relacionados, el patrón de funciones obtenido a través del cambio en la anotación de COG difería entre las dos especies (Tabla 2). 30 CDSs adicionales del transporte y metabolismo de nucleótidos (F), 97 CDSs del transporte y metabolismo de aminoácidos (E) y 79 CDSs de codificación para las categorías de mecanismos de transducción de señales (T) fueron específicos para C. bolteae. 40 CDSs que codificaban la biogénesis de la pared celular/membrana/envoltura (M), 50 CDSs para la Replicación, recombinación y reparación (L) y 18 CDSs para las categorías de transporte y metabolismo de lípidos (I) fueron específicos para C. clostridioforme. Las diferencias entre las vías metabólicas en C. clostridioforme y C. bolteae parecen ser lo suficientemente grandes como para apoyar la delimitación de la especie.

Entre las vías de carbohidratos, C. bolteae y C. clostridioforme albergaron diferentes sistemas para la asimilación de lactosa, que difieren en sus estados de fosforilación, metabolitos intermedios y bioenergéticos (Archivo adicional 1: Tabla S1). Los genes que codifican para una β-galactosidasa, que hidroliza la lactosa produciendo glucosa y galactosa, se encontraron en ambas especies. Una vía catabólica alternativa de la lactosa, el sistema fosfotransferasa dependiente de lactosa/celobiosa (lac/cell-PTS) se encontró en casi todos los genomas de C. bolteae. El operón lac / célula-PTS, descrito previamente en C. acetobutylicum, consiste en genes para el antiterminador transcripcional del operón 6-fosfo-β-galactosidasa, fosfoglicerato mutasa y liquen y de dos copias de genes para los componentes de la familia de lactosa/celobiosa IIC, IIB y IIA. Mediante este sistema, la lactosa se fosforila en el carbono C-6 y la lactosa-fosfato internalizada se degrada en galactosa-fosfato 6 y glucosa por la 6-fosfo-β-galactosidasa. Además, el gen de la 6-fosfo-β-galactosidasa y los genes de los componentes de la familia de la lactosa/celobiosa carecían en C. bolteae 90A7. Es probable que este sistema, inducible por celobiosa o lactosa y regulado por varios represores (descritos en otras bacterias Gram positivas) explique el fenotipo lactosa negativo en C. bolteae . Mediante el uso de nuestro sistema de anotación, detectamos un represor operónico de galactosa (GalR) entre los reguladores de la familia lacI, en C. clostridioforme (todos, excepto 90A8), pero no en C. bolteae. Se necesitan experimentos de laboratorio para determinar cómo los factores de transcripción de las dos especies median las preferencias en la utilización de ciertos carbohidratos sobre otros.

Otras características distintivas entre las dos especies fueron los CDSs que codifican la biosíntesis y el transporte y catabolismo de metabolitos secundarios, que solo se encontraron en C. bolteae (Tabla 2).

Curiosamente, el número de genes de la categoría de motilidad y secreción celular (N) (34 y 18 CDSs) fue diferente entre las dos especies. Entre ellos, encontramos CDSs que codifican la motilidad de los flagelos reconocidos como factores de virulencia esenciales para la mayoría de los patógenos móviles. En total, veinticuatro genes (46 grupos + 3 huérfanos) representaban el operón flagelar en los genomas de C. bolteae. Entre ellos, los genes para flagelina (fliC) y la tapa flagelar (fliD), una de las adhesinas múltiples de la superficie celular de la bacteria, revelaron especificidad de racimo y microevolución. Los genes que codificaban para fliD estaban representados por un grupo y dos genes adicionales en C. bolteae 90A7 y 90B8. Las secuencias flicas de C. bolteae 90A9, 90B3 y 90B8 formaron un grupo, las de 90A5 y 90B7 se agruparon en otro grupo, y las secuencias de C. bolteae 90A7 permanecieron huérfanas (genes únicos) después de la agrupación (Fig. 1). Estaban estrechamente relacionados con secuencias de flagelinas de C. citroniae y C. hathewayi, otras especies de Clostridium spp. del grupo XIVa, aislado ocasionalmente de infecciones humanas. Además, C. bolteae 90A9 y 90B3 compartieron un segundo operón de solo 19 genes en la síntesis, incluyendo un gen de flagelina (flaA) estrechamente relacionado con los de C. clostridioforme (63% de identidad). Sobre la base de los residuos conservados L87, Q88, R89 y Q96 críticos para la señalización de TLR5 y la polimerización de flagelinas, se predijo que estas proteínas tenían propiedades proinflamatorias . En C. clostridioforme, veinte genes (otros 57 grupos) organizados en un solo operón codificaban el aparato flagelar. Secuencias de FlaA de C. clostridioforme pertenecía a un grupo filogenético estrechamente relacionado con secuencias de flagelinas de Eubacterium cellulosovens aislados del rumen. En general, los genes de las flagelinas y la organización de los loci relacionados con los flagelos fueron diferentes entre las especies (archivo adicional 2: Tabla S2 y archivo adicional 3: Tabla S3), lo que sugiere que la motilidad, la quimiotaxis y la aparición de interacciones potenciales con la mucosa del colon son específicas de cada especie .

Árbol filogenético de genes flagelinos basado en la distancia. Los valores en los nodos correspondieron a porcentajes de arranque obtenidos de árboles filogenéticos basados en alineaciones de secuencias múltiples por ClustalW, Tcoffee o Promals, respectivamente. Se indicaron nombres de genes y números huérfanos o de conglomerados

Diferencias de especie en las vías de síntesis de butirato

La comparación de secuencias de genoma completo reveló que las vías de síntesis de butirato, que desempeñan un papel clave en la salud del colon en los seres humanos, estaban presentes en C. bolteae y C. clostridioforme.

Las dos especies fueron productoras de butirato de formas diferentes y complementarias (Fig. 2, Archivo adicional 4: Cuadro S4). Todos los C. clostridioforme, excepto el 90A8, portaban un locus que codificaba la vía Acetil-CoA (de Acetil-CoA a butiril-CoA), incluidos los genes de la beta-hidroxilbutirildeshidrogenasa (hbd), tiolasa (thl), crotonasa (cro), butiril-coa deshidrogenasa (bcd) y dos proteínas de transferencia de electrones (ETF alfa, ETF beta) (Archivo adicional 4: Tabla S4). Únicamente, C. bolteae 90A8 y C. clostridioforme 2149FAA.1 contenía otro dcb putativo (74.9% de identidad) en sus genomas (datos no mostrados). La composición y disposición del locus fueron similares a la de Faecalibacterium prausnitzii, un importante productor de butirato del intestino grueso humano . La vía Acetil-CoA no se encontró en C. bolteae. Ambas especies compartieron genes para la hidroxi-glutaril-coa deshidrogenasa (HgCoAd) y la glutaconil-coa descarboxilasa (Gcd) de la vía del Glutarato que puede conducir a crotonil CoA y a butiril-CoA a través de genes bcd .

Diferentes vías de síntesis de butirato potencialmente presentes en los genomas de C. clostridioforme y C. bolteae. En líneas sólidas: se encuentra en C. bolteae y C. clostridioforme ; En líneas punteadas en negrita : solo se encuentra en C. clostridioforme; En líneas punteadas finas : solo se encuentra en C. bolteae 90A5 y 90B7 (para más detalles, ver el archivo adicional 4: Tabla S4). Se muestran genes (nombres de proteínas). Ato, Acetil-COA acetiltransferasa ; Bcd, butiril – coa deshidrogenasa; Buk, butirato quinasa; But, Butirato-acetoacetato COA transferasa; Cro, crotonasa ; Etf, proteína de transferencia de electrones; Gcd, glutaconil-coa descarboxilasa; Hbd, Acetoacetil-COA reductasa; 4Hbt, 4-hidroxibutirato de COA transferasa ; HgCoAd, 3-hidroxibutiril-coa deshidrogenasa ; Ptb, fosfato butiriltranferasa; Thl, tiolasa

La conversión final de butiril-CoA a butirato puede ser realizada por la butirato quinasa (buk) y la fosfotransbutirilasa (ptb) presentes en ambas especies (Archivo adicional 4: Tabla S4). El grupo de secuencias buk de C. clostridioforme se ramificó en las proximidades de la secuencia buk de C. citroniae en el árbol filogenético (Archivo adicional 5: Figura S1). Las secuencias de Buk de C. bolteae formaron distintos grupos monofiléticos y secuencias distribuidas entre los árboles filogenéticos, lo que sugiere polimorfismo y/o variaciones funcionales de la enzima en esta especie. Otros genes para transferasas de la vía lisina (subunidad ato—alfa y beta ; but—acetato COA transferasa), detectados cerca del locus de butirato en seis genomas de C. clostridioforme, pueden estar involucrados como enzimas finales. Los genes de la vía 4-aminobutirato (4hbt) pueden ser otra alternativa para el paso terminal en C. bolteae 90A5, 90B7, WAL14578 y BAA613 .

La butiril-CoA:acetato COA-transferasa (but) de la vía acetil-CoA, el paso final en la producción de butirato predominante en Clostridium XIVa, no se encontró en los genomas centrales comunes ni en los genomas de la C. bolteae estudiada . En el intestino humano, estudios previos sobre aislados de colon de individuos sanos han ilustrado que, pero la vía predomina . Se necesitan más estudios para evaluar el impacto de la producción de butirato a través de la vía del glutarato en la salud de las células del colon, en particular en el autismo, donde C. bolteae es sobreabundante .

Identificación de los determinantes de la resistencia a los antibióticos

Los genes de resistencia a los medicamentos que no habían sido reconocidos por anotación automatizada fueron identificados por la investigación de secuencias de homología en ARDB. Los genes de resistencia se predijeron en un valor de identidad de hasta el 40% (50% de sustituciones positivas) en un 70% de longitud por encima del valor de corte recomendado habitualmente (ver lista en la Tabla 3). A continuación, se comparó el contenido genético y la organización genética de los loci de resistencia microbiana de las seis C. bolteae y las seis C. clostridioforme con datos anteriores obtenidos de C. clostridioforme CM201.1 en nuestro laboratorio.

Debido a que las predicciones basadas en secuencias podrían identificar determinantes que no conducen a la resistencia a los antimicrobianos, se realizaron pruebas de susceptibilidad para obtener información sobre la respuesta prevista de las bacterias a los antibióticos. Las cepas incluidas en este estudio mostraron patrones de resistencia, incluyendo ampicilina, macrólidos, lincomicina y quinolonas, ahora comunes en anaerobios (Tabla 4). Se consideraron tanto los datos genómicos (CDSs y anotaciones) como las pruebas de susceptibilidad fenotípica para identificar los determinantes de la resistencia a los antibióticos (Tablas 3 y 4). También se realizaron ensayos preliminares para la clonación de ciertos genes con el fin de comprobar su capacidad para conferir resistencia a los antibióticos (véase más adelante).

Genes de resistencia a los antibióticos utilizados para el tratamiento de infecciones anaeróbicas

Se identificaron un total de 76 grupos y 21 genes específicos de una cepa potencialmente implicados en la resistencia a los antimicrobianos (Tabla 3). Se incluye de 42 a 50 CDSs en C. bolteae y de 48 a 58 CDSs en C. clostridioforme. De 27 a 42 CDSs por genoma se relacionaron con mecanismos de resistencia a fármacos a betalactámicos, glicopéptidos, macrólidos, lincosamidas y metronidazol.

Siete grupos involucrados en la resistencia a los betalactámicos son compartidos o parte del genoma central de las dos especies (Fig. 3). Se reconocieron tres tipos de beta-lactamasas, incluyendo la beta-lactamasa de clase A, la beta-lactamasa de clase C, la beta-lactamasa de clase D y varias metaloenzimas en los doce genomas. Todas las cepas estudiadas, seleccionadas por su resistencia a la ampicilina, compartían el gen blaCLO1, encontrado previamente en C. clostridioforme CM201.1 (inédito), pero la estructura del elemento conjugativo integrativo (ICE) observada en CM201.1 no se encontró en los nuevos genomas secuenciados. El gen blaCLO1 confiere resistencia a las aminopenicilinas y carboxipenicilinas en E. coli, y su actividad es inhibida por el clavulanato y el sulbactam. Se observaron nueve cambios de aminoácidos en beta-lactamasas de C. bolteae 90A9, 90B3 y 90A8. Esta beta-lactamasa estrechamente relacionada estaba flanqueada por secuencias de inserción (IS66) y un supuesto gen para la beta-lactamasa de clase D (COG 2602) también descrito en Clostridium sp M62/1 del proyecto de microflora intestinal humana (HMP). Los genes de beta-lactamasas de clase C, encontrados previamente en los cromosomas de bacterias entéricas (COG2680), también estaban presentes en C. bolteae and C. clostridioforme.

Distribution of antibiotic resistance genes shared between and within the core of C. bolteae and C. clostridioforme. Los genes que se superponen al menos en un 90% de longitud y un 90% de similitud se consideraron homólogos. Los genes de resistencia se predijeron en un valor de identidad de hasta el 40% (50% de sustituciones positivas) en un 70% de longitud por investigación de secuencia de homología en ARDB. Para todos los C. clostridioforme y algunos C. bolteae 23S rRNA metiltransferasa similar a Cfr

Un alto número de genes predichos (32 CDSs) estuvieron involucrados en la resistencia a los glicopéptidos (archivo adicional 6: Figura S2). C. clostridioforme 90A8 fue la cepa única con todos los genes necesarios para la resistencia a los glicopéptidos de acuerdo con el fenotipo (CMI > 256 mg/l). La resistencia a vancomicina en esta cepa se atribuyó a un operón de tipo VanB soportado por un elemento similar a Tn1549. Desafortunadamente, una deleción de diez nucleótidos dentro del gen de la relaxasa de Tn1549 conduce a la incapacidad de 90A8 para transferir resistencia a vancomicina in vitro . Los otros genomas de C. clostridioforme incluían parte del operón de resistencia a vancomicina tipo VanD, pero el gen de ligasa vanD D-Ala-Lac se interrumpió por un codón de parada que condujo a una proteína truncada (archivo adicional 6: Figura S2). Además, faltaban vanH y vanY, que codificaban una D-lactato deshidrogenasa y una DD carboxipeptidasa, respectivamente. Del mismo modo, los genomas de C. bolteae albergaba cuatro CDSs, homólogo de vanRG vanUG vanG vanYG, que formaban un operón incompleto e no funcional debido a la falta de un gen de serina racemasa. El alto número de CDSs que codifican la resistencia a los glicopéptidos (incluyendo vanD o vanG conocidos por ser cromosómicos e intransferibles) encontrados en los genomas de C. bolteae y C. clostridioforme, sugiere que son parte de operones enteros ancestrales, que han evolucionado en ausencia de presión selectiva de antibióticos . La presencia de van operon incompleto es intrigante, pero observaciones similares en otros anaerobios que viven en microbiomas como Clostridium difficile 630 o Ruminococcus spp., han sido reportados .

Homólogos al gen de la adenililtransferasa que confiere resistencia a las lincosamidas, estaban presentes en el genoma central de ambas especies (Fig. 3). Los genes LnuA de C. clostridioforme y C. bolteae tenían identidad de 70 a 72% con ortólogos encontrados en C. hathewayi y C. citroniae, respectivamente. C. clostridioforme 90B1 y 90A6 albergaban un gen lnu adicional (68% de identidad con LnuA90A5), sin rastros de elementos móviles. La resistencia a la lincomicina es común en C. bolteae y C. clostridioforme, a menudo asociada con resistencia a la clindamicina. Las proteínas LnuA de las dos especies mostraron un 51 a 54% de identidad con LnuA de Staphylococcus, lo que sugiere una funcionalidad común, pero el papel de los genes lnu es difícil de establecer debido a la presencia de otros mecanismos putativos . De manera similar, todas las cepas eran resistentes a la eritromicina, mientras que dos genes homólogas al gen de la eritromicina ribosoma metilasa, ermB, solo se predijeron en los genomas de C. clostridioforme 90A4 y 90A8. La sobreexpresión de bombas de flujo de múltiples fármacos y sistemas de flujo de Macrólido y varios Macrólido-Lincosamida-estreptogramina B específicos, como MACb, MefA, VgaA, MsrA/MsrB y CcmA (Tabla 3, archivo adicional 7: Figura S3), encontrados en los genomas estudiados, puede conducir a resistencia a macrólido y lincosamida . Además, se encontraron dos grupos de CDSs que codificaban acetiltransferasas xenobióticas relacionadas con VatB (identidad del 48%) en los genomas centrales de cada una de las especies (Fig. 3). El VatB inactiva la virginiamicina, pero en este caso la resistencia no se detectó mediante pruebas de sensibilidad antimicrobiana (Tabla 4).

En los genomas centrales de ambas especies se detectó un grupo de homólogos CDSs a los genes de resistencia al metronidazol (nim), y el metronidazol fue muy activo en las especies estudiadas . En Bacteroides fragilis se ha demostrado que el aumento de la expresión de los genes nim cuando se encuentran aguas abajo de elementos IS conduce a la resistencia al metronidazol . En la falta de IS directamente aguas arriba de los genes nim, el mecanismo para conferir resistencia al metronidazol a C. bolteae y C. clostridioforme aún no se ha establecido.

Observación inesperada de nuevos genes de resistencia

Con respecto a otras resistencias a medicamentos, los datos del genoma revelaron genes relacionados con los mecanismos de resistencia al cloranfenicol y a la rifampicina (Tabla 3). En la mayoría de los genomas de cada especie, encontramos CDSs que codifican una cloranfenicol acetiltransferasa del grupo A que puede inactivar el cloranfenicol. Sin embargo, solo C. bolteae 90B3 y 90B8 fueron resistentes al cloranfenicol. El genoma de la cepa 90B8 contenía una segunda copia del gen cat transmitido por un transposón similar a Tn4451 (96 y 90% de identidad con Tn4451 y Tn4453, respectivamente). El genoma 90B3 contenía un homólogo CDS al gen cfr que codifica una metiltransferasa 23S rRNA ampliamente diseminada en bacterias grampositivas. Como era de esperar, la cepa 90B3 también fue resistente al florfenicol, tiamulina y linezolid ( CIM = 16 mg / l). Otros 23S ARNr metiltransferasa (tipo Cfr) CDSs se detectaron en un ambiente rico en elementos transponibles (Tn 6103-6110-CTn4 ) en los genomas de C. clostridioforme y C. bolteae 90A5 y 90B7, pero la metilación del ARNr no pareció afectar la susceptibilidad al cloranfenicol (Fig. 3).

El análisis de los datos genómicos permitió reconocer los homólogos de CDSs a los genes rifampicina-ADP-ribosiltransferasa (arr) en C. bolteae pero no en C. clostridioforme. No se encontraron elementos móviles o rastros de elementos móviles alrededor de los genes arr, lo que sugiere que eran indígenas de esta especie. Esta nueva secuencia de Arr se ramificó en la vecindad de proteínas Arr de C. saccharoperbutylacetonicum y algunas cianobacterias en el árbol filogenético (Archivo adicional 8: Figura S4). Eran distintas de las proteínas Arr-2 de Enterobacteriaceae y de las proteínas Arr de Mycobacterium y Streptomyces spp.. Todas las cepas, excepto la 90A7, fueron susceptibles a la rifampicina. En ausencia de mutaciones en rpoB (conocida por ser la responsable de la resistencia a la rifampicina), resistencia a C. bolteae 90A7 (CMI: 32 mg/l) se debió probablemente a una selección positiva de mutaciones en aar Cbol90A7. La susceptibilidad a la rifampicina de otras C. bolteae se debió probablemente a la falta de promotores aguas arriba de arr (como se predijo en el análisis in silico) o a sustituciones de nucleótidos dentro de arr que llevaron a la sustitución de aminoácidos e inactivación funcional (datos no mostrados).

Con respecto a la resistencia de todas las cepas al moxifloxacino y al ciprofloxacino, todas las cepas de C. bolteae mostraron varias sustituciones en la “región determinante de la resistencia a las quinolonas” (QRDR) de gyrB. No encontramos sustituciones en esta región para gyrA, ni se describe en la proteína de la cepa epidémica resistente a quinolonas, C. difficile 027 . Por lo tanto, gyrB fue probablemente el objetivo preferido en la adquisición de resistencia a quinolonas en estas dos especies. Además, en todas las cepas había varios CDSs que codificaban el transportador de membrana interna AcrB. Estos transportadores son parte de una bomba de flujo de múltiples fármacos de división de nodulación de resistencia, conocida por aumentar el flujo de quinolonas en algunas bacterias gramnegativas . Se necesitan más estudios para determinar su influencia en la pérdida de susceptibilidad de Clostridium spp. a las fluoroquinolonas.

En general, los perfiles de resistencia similares a los antibióticos en C. bolteae y C. clostridioforme pueden resultar de varios mecanismos.

Genes de resistencia a antibióticos menos activos o inactivos frente a Clostridium spp

Los genomas de C. bolteae y C.el clostridioformo llevaba una o dos copias del gen baca de la pirofosfato fosfatasa undecaprenil, y de 2 a 5 copias de los genes de la bomba de eflujo, bcrA, implicados en la resistencia a la bacitracina, de acuerdo con su baja susceptibilidad . También encontramos un grupo de CDSs homólogo al gen dihidrofolato reductasa, dfrA20 (41% de identidad / 97% de longitud) de Pasteurella multocida en el genoma central de ambas especies que podría explicar la pobre actividad de trimetoprim en nuestro Clostridium spp. . Además, C. clostridioforme 90A6 albergaba un CD idéntico al dfrA de Enterococcus faecium. Este gen detectado en un ambiente rico en elementos móviles es consistente con un nuevo ejemplo de transferencia horizontal entre Enterococcus spp. y Clostridiales.

Curiosamente, los genomas de C. bolteae o C. clostridioforme contenían varios genes de resistencia a los antibióticos naturalmente inactivos en estas especies. Cinco CDSs fueron homólogos de genes que fosforilan, acetilan o adenililan aminoglucósidos. Cuatro de estos genes de resistencia putativa se detectaron en un entorno de elementos móviles. Tres genes, aadE, sat4 y aph(3′)-III, que confieren resistencia a la estreptotricina, estreptomicina y kanamicina, respectivamente, se encontraron parte de un transposón delineado por dos copias IS1182 en C. clostridioforme 90A3 (dos copias), 90A6 y 90B1. El aph(3′)-III detectado fue idéntico al aph (3′)-III, parte del plásmido multirresistente PF856 de E. faecium , también relacionado con un dominio interno (99% de identidad) de un elemento SSCmec de Staphylococcus aureus HT20040085. De manera similar, el gen aminoglucósido 6-adenililtransferasa ant(6′)-Ia, que confiere resistencia a la estreptomicina, fue compartido por C. clostridioforme 90A1, 90A3 (2 copias), 90A4, 90A6 (2 copias) y C. bolteae 90A7. El gen de la adenililtransferasa aad(9′)-b, que media la resistencia a la estreptomicina/espectinomicina, se encontró en C. bolteae 90B3. Dos copias de la acetil transferasa aac (6′)-Im también estaban presentes en el genoma de C. clostridioforme 90B1. Los homólogos de AAC (6′)-Im que confiere resistencia a la tobramicina y la resistencia a la amikacina también se encontraron en E. coli (96% de identidad), Coprococcus sp, C. difficile y Enterococcus faecium (datos no mostrados). Además, se observaron tres CDSs que codificaban una aminoglucósido quinasa (APH), ampliamente distribuida en bacterias grampositivas, entre todas las cepas .

También se detectaron numerosos genes de resistencia a tetraciclinas en C. bolteae y C. clostridioforme. Incluyen genes de eflujo, como tet40, y determinantes de protección de ribosomas, como tetO, tetW y tet32, que anteriormente circulaban en la microflora intestinal entre bacterias relacionadas a distancia .