Información mínima para Informar sobre el Ensayo de Cometas (MIRCA): recomendaciones para describir los procedimientos y resultados del ensayo de cometas

Las directrices de MIRCA han sido elaboradas por miembros de hCOMET COST Action con el objetivo de mejorar el análisis y la notificación de los resultados del ensayo de cometas (http://www.hcomet.eu/). Los autores son expertos en ensayos de cometas con un mínimo de ocho años de experiencia con estos ensayos (15 de los autores tienen >20 años de experiencia relevante). Hemos utilizado un cuestionario basado en Internet para muestrear las opiniones de los autores sobre la importancia de informar detalles (Tabla 1; Datos complementarios). Cada pieza de información fue calificada por los autores como “esencial”, “deseable” o “no importante”, y se utilizó un umbral de congruencia ≥75% para las clasificaciones. Si el número de respuestas de “información esencial” no alcanzaba el umbral del 75% de acuerdo, se combinaban las respuestas de “información esencial” y de “información deseable”, y la información se clasificaba como “información deseable” si ≥75% de los autores estaban de acuerdo en que era “esencial” o “deseable”. En el cuadro 1 se incluyen notas explicativas para cada recomendación.

Recomendaciones específicas de MIRCA para cada paso del ensayo comet

Paso 1A: Aislamiento de células y preparación de suspensiones unicelulares

Dado que el ensayo comet utiliza suspensiones de células individuales, las muestras que no se obtengan como células individuales deberán tratarse mecánica o enzimáticamente para interrumpir la unión de las células a una matriz extracelular o entre sí. La homogeneización de los tejidos por interrupción mecánica puede en sí misma causar daño al ADN, mientras que la digestión enzimática del tejido puede conducir a la eliminación de lesiones de ADN debido a la actividad de enzimas endógenas de reparación del ADN, o aumentar los niveles de daño del ADN al liberar nucleasas de las células. La composición del tampón de homogeneización es información “deseable”, especialmente en lo que respecta a los componentes necesarios para preservar la integridad del ADN (por ejemplo, ácido etilendiaminotetraacético)24,25. La descripción del procedimiento de aislamiento de las suspensiones unicelulares, incluida la homogeneización del tejido, se considera información “deseable” que debe consignarse en los artículos.

Las muestras de sangre se utilizan a menudo en estudios de biomonitoreo en humanos. Debido a que la sangre representa una población heterogénea de células, la información detallada sobre la población celular es “esencial” en las publicaciones. El texto debe describir con precisión si las muestras son de sangre completa (incluidos los glóbulos rojos), leucocitos, células sanguíneas mononucleares o un subconjunto de células (por ejemplo, linfocitos). También puede ser útil incluir información sobre el procedimiento de venopunción, el tipo de anticoagulante y el método posterior de aislamiento celular (es decir, centrifugación y pasos de lavado) para aquellos que repiten el experimento, por lo que se clasifica como información “deseable”. La información sobre las condiciones de almacenamiento de las células o tejidos, si se criopreservan, así como el método de congelación (por ejemplo, congelación rápida en hielo seco o en nitrógeno líquido, o un procedimiento de congelación lenta) y el procedimiento de descongelación, se considera información “esencial” para informar, ya que se ha demostrado que estos procesos afectan al nivel basal de migración del DNA 26.

Paso 1B: Preparación de células de sustrato para el ensayo de reparación del ADN in vitro

Cualquier tipo de célula eucariótica puede utilizarse como célula de sustrato para el ensayo de reparación del ADN in vitro, y el tipo de célula y la densidad son datos “deseables” que deben notificarse. Es “esencial” informar el método y el tipo de compuesto genotóxico utilizado para inducir lesiones de ADN en las células del sustrato y las condiciones de almacenamiento de células posteriores, mientras que el nivel total de lesiones de ADN que se pueden detectar en las células del sustrato (p. ej., el número de sitios sensibles a la DNA-glicosilasa de formamidopirimidina en células tratadas con Ro19-8022 más luz) se considera información “deseable” únicamente.

Paso 1C: Controles de ensayo

En este artículo, los controles de ensayo se refieren a muestras que se incluyen en cada experimento de ensayo de cometa; a veces se denominan estándares de referencia, controles internos o controles técnicos16,27. Los controles de ensayo suelen ser alícuotas criopreservadas de un solo lote de células que han sido expuestas a un agente de ruptura de cadenas de ADN (p. ej., radiación ionizante, peróxido de hidrógeno o metanosulfonato de metilo) o un tratamiento que causa un tipo específico de lesión en el ADN (por ejemplo, el fotosensibilizador Ro19-8022 más luz, o tratamiento con bromato de potasio, para inducir la oxidación del ADN). Existen diferentes controles de ensayo para el ensayo de cometa alcalino estándar y el ensayo de cometa modificado por enzimas. El compuesto utilizado para el ensayo modificado por enzimas no debe generar roturas de cadenas de ADN, ya que disminuyen el rango dinámico de los sitios sensibles a las enzimas. En los estudios de biomonitorización, así como en los estudios transversales, intervencionistas y clínicos, las células no expuestas pueden utilizarse como controles de ensayo. Es “esencial” informar los niveles de daño en los controles de ensayo y la variación del ensayo (desviación estándar) tanto en el ensayo estándar como en el ensayo cometa modificado por enzimas.

El ensayo de reparación de ADN in vitro utiliza controles experimentales internos, que también se utilizan en el cálculo de la actividad de reparación, en lugar de controles de ensayo per se. Es información “esencial” informar el nivel de incisiones de reparación de ADN en nucleoides de i) células de sustrato no expuestas incubadas con tampón de reacción, para determinar el nivel basal de daño del ADN en el ADN del sustrato (es decir, el “control de fondo”); ii) células expuestas incubadas con tampón de reacción, para revelar el nivel de cualquier rotura de cadena de ADN no específica o sitios abásicos resultantes del tratamiento con el agente dañino (es decir, el “control de tratamiento”); iii) células de sustrato no expuestas incubadas con extracto de proteína de la muestra, para comprobar si hay actividad de incisión o escisión inespecífica (es decir, el “control de especificidad”); y iv) células de sustrato expuestas incubadas con enzimas específicas de la lesión, similares a los controles de ensayo para el ensayo cometa modificado por enzimas (es decir, el “control de reacción de incubación”).

Paso 1D: Controles negativos y positivos

En este artículo, los controles negativos y positivos se refieren a los grupos experimentales descritos en la directriz de la OCDE (TG 489) para el ensayo de cometas in vivo en tejidos de animales18. Por lo tanto, los controles negativos y positivos pertenecen a todo el experimento. Un control positivo se refiere a un compuesto genotóxico de acción directa o indirecta que produce roturas de cadenas de ADN o sitios sensibles a enzimas detectados con el ensayo cometa. Para el ensayo de cometa modificado por enzimas, no se dispone de una lista de controles positivos que corresponda a los compuestos que la OCDE incluye como controles positivos para el ensayo de cometa alcalino (para inducir roturas de cadenas de ADN) en tejidos animales específicos. Además, no existe un control positivo para los estudios de biovigilancia humana, ya que las personas sanas no pueden exponerse deliberadamente a un agente genotóxico. Los controles positivos ya se consideran obligatorios en experimentos de cultivo celular en toxicología genética y, de hecho, serán información “esencial” en artículos que utilicen el ensayo comet. En estudios con animales, sin embargo, para fines prácticos, los datos de cometas sobre controles de ensayo (p. ej., las muestras mencionadas en la sección anterior titulada “Fase 1C, Controles de ensayo”) son suficientes, mientras que los resultados de los controles positivos y negativos reales se consideran información “deseable” únicamente.

Paso 2: Incrustación de las células en agarosa

El ensayo comet se desarrolló originalmente utilizando tres capas de agarosa en portaobjetos de vidrio, con la capa intermedia que contenía las células. Sin embargo, la capa superior de agarosa no es necesaria, y ciertos procedimientos no utilizan una capa inferior (por ejemplo, ensayos de película Gelbond). Es ‘deseable’ informar el tipo de diapositivas y el tamaño (p. ej., área de superficie) de los geles, a medida que la proporción de células cerca del borde del gel aumenta a medida que el tamaño del gel disminuye y el ADN en los nucleoides en el borde del gel puede migrar de manera diferente a la de los nucleoides hacia el centro del gel22. La concentración final de agarosa (con las células incrustadas en ella) es “esencial” para informar, ya que la migración del ADN depende de la densidad del gel.

Paso 3: Lisis de las células

Hay varios procedimientos para lisar las células en el ensayo comet. La información sobre la composición de la solución de lisis es “esencial”. Puede ser necesario un paso de incubación enzimática adicional (por ejemplo, con proteinasa K) para ciertos tipos de células, y los detalles de la incubación también deben notificarse como información “esencial”. Algunos informes sugieren que la duración de la lisis puede afectar la estabilidad de ciertos tipos de lesiones de DNA 28,29,30, por lo que la duración de la lisis y la temperatura de la solución de lisis son información “deseable” para informar.

Paso 4A: Tratamiento enzimático de reparación en el ensayo comet modificado con enzimas

Dado que la solución de lisis puede inhibir la actividad de la enzima de reparación, es “deseable” establecer si se ha realizado una fase de lavado entre la fase de lisis y el tratamiento enzimático (es decir, composición del tampón de lavado, número de lavados y duración). Es “esencial” transmitir información sobre la fuente de las enzimas de reparación, ya que se ha demostrado que las enzimas de diferentes fabricantes difieren tanto en su actividad como en su especificidad para las lesiones de nucleobasas16. En la mayoría de los estudios comet, se realizan experimentos con curvas de titulación para identificar las condiciones óptimas para el tratamiento enzimático31; sin embargo, los resultados de las curvas de titulación enzimática rara vez se informan y se clasifican aquí como información “deseable” (en su lugar, se podría hacer referencia a un estudio anterior), aunque consideramos “esencial” informar la duración y la temperatura del tratamiento. La concentración de enzimas aplicada al gel es información “esencial”; es preferible informar la concentración en unidades enzimáticas (U/ml), aunque la concentración de proteínas (mg/ml) también es útil. El tipo de unidad de incubación (por ejemplo, incubadora, foso deslizante o sistema de 12 geles) y el modo de incubación son información “deseable” para informar. Debe indicarse si la incubación se realizó (i) en un baño de enzimas o con una gota y un cubreobjetos en el portaobjetos, (ii) en una versión estándar de 2 geles, 12 geles o un sistema de múltiples pocillos, o (iii) en una caja humidificada en una incubadora, en una placa calefactora o en un foso portaobjetos calentado.

Paso 4B: Preparación e incubación de extractos para el ensayo de reparación del ADN in vitro

Es “deseable” indicar el número de células o masa de tejido utilizados para preparar los extractos proteicos, mientras que es “esencial” indicar la concentración final de proteínas de extractos de células o tejidos que se añaden al sustrato de ADN. La composición del tampón de extracción (información “deseable”) es menos crucial que la composición del tampón de incubación (información “esencial”), porque esta última puede afectar al nivel de fondo de la migración del ADN. De acuerdo con la información para el ensayo de cometa modificado por enzimas, es “deseable” informar de los resultados de experimentos de valoración o de estudios previos de referencia del mismo laboratorio, cuando se hayan realizado. El volumen de extracto añadido a las células de sustrato incrustadas en gel es información “deseable”. Es “esencial” informar la duración y la temperatura del período de incubación, ya que afectan al número de incisiones de reparación. En cuanto al ensayo de cometa modificado por enzimas, el modo de incubación es información “deseable” para el ensayo de reparación in vitro. La información sobre la identidad de la enzima utilizada como control de la reacción de incubación (indicando la cantidad de lesiones de ADN en las células del sustrato) y la composición del tampón utilizado para el nivel de fondo de las incisiones de reparación de ADN en células de sustrato no expuestas es “esencial”, porque es clave para demostrar la fiabilidad de la actividad de la incisión de reparación de ADN.

Paso 5: Tratamiento alcalino

La solución de alto pH alcalino interrumpe el enlace de hidrógeno que mantiene unidas las hebras de ADN y también convierte ciertas lesiones de nucleobase en roturas de hebras de ADN. Por lo tanto,la duración del tratamiento alcalino puede afectar el nivel de migración del ADN en la electroforesis subsecuente32,33, 34. La información específica sobre la composición de la solución alcalina, el pH, la temperatura y la duración del tratamiento son, por tanto, información “esencial” que debe notificarse.

Paso 6: Electroforesis

Los impulsores más importantes de la migración del ADN son la duración de la electroforesis y el potencial eléctrico (caída de tensión en la plataforma del tanque de electroforesis)35. Es “esencial” que se indique la composición del tampón de electroforesis, la intensidad de la electroforesis [gradiente de tensión (V/cm) sobre la plataforma del tanque de electroforesis] y la duración de la electroforesis. La temperatura alta durante la electroforesis puede afectar la migración del DN 36; por lo tanto, la información sobre la temperatura de la solución de electroforesis es “esencial”, y esto puede ir acompañado de descripciones de los pasos tomados para mantener la temperatura constante (por ejemplo, enfriar la plataforma o hacer circular el tampón).

Paso 7: Neutralización

Este paso consiste en eliminar el exceso de solución alcalina de los portaobjetos para garantizar una tinción eficiente. Es’ deseable ‘ describir la composición de la solución de neutralización.

Paso 8: Tinción y visualización

Los tintes de unión al ADN tienen afinidades de unión diferentes al ADN y,por lo tanto,pueden afectar de manera diferente al cálculo de los descriptores primarios de ensayo de cometas en el software de análisis de imágenes 36, 37, 38. El tipo de tinte es información “esencial”, mientras que la concentración es información “deseable”, al igual que el tiempo entre la tinción y la visualización. La intensidad de la luz de los diferentes tipos de lámparas de microscopio difiere. Además, varía debido a la edad de la lámpara y el tiempo que se ha encendido durante la puntuación de cometas. Sin embargo, no existe un procedimiento estándar para medir la intensidad de la luz y corregir el nivel de migración del ADN en consecuencia. Además, el mismo cometa puede parecer tener diferentes niveles de migración de ADN a diferentes aumentos del microscopio. Por lo tanto, es ‘deseable’ informar el aumento del microscopio utilizado para la puntuación. Es ‘deseable’ mostrar imágenes representativas de cometas (p. ej., control con poca o ninguna migración, moderada y extensa migración de ADN) junto con los niveles reportados de migración de ADN.

Paso 9A: Puntuación y análisis de datos

Este paso requiere la presentación de información “esencial” para el descriptor de ensayo de cometa primario (p. ej.. % de ADN en cola, longitud de cola, momento de cola o puntuación visual), el número de cometas que se analizan por muestra y cómo se expresa el nivel general de migración de ADN (por ejemplo, mediana o media de las puntuaciones de cometas). “No es importante” informar el resultado individual de cada cometa en cada gel; se combinan para calcular el nivel de daño total. Como no se puede descartar que diferentes paquetes de software de análisis de imágenes puedan tener diferentes formas de calcular el predictor de ensayo de cometa primario, es “esencial” informar el software utilizado (nombre del software, fabricante, versión). Todos los descriptores primarios comparten la limitación de que es necesario tener experiencia en el ensayo de cometas para comprender lo que significan, mientras que si se crea una curva de calibración (utilizando radiación ionizante, que induce roturas a una frecuencia conocida), los resultados se pueden convertir en una frecuencia relativa de lesión en comparación con los nucleótidos o pares de nucleobasas inalterados; estos datos son inequívocos y transmiten información que todos los investigadores39 pueden comprender. El procedimiento para obtener una curva de calibración, utilizando radiación ionizante, y convertir los niveles de migración del ADN a la frecuencia de la lesión en relación con los nucleótidos o pares de nucleobasas inalterados se ha descrito previamente40. Por lo tanto, comunicar los resultados como niveles de lesiones por 109 nucleótidos inalterados o 106 pares de nucleobasas es “deseable”.

Paso 9B: Cálculo de sitios sensibles a las enzimas o número neto de incisiones en el ADN del sustrato para el ensayo de reparación de ADN in vitro

La incubación con enzimas de reparación de ADN aumenta el nivel de migración de ADN, ya que tanto el nivel basal de roturas de hebras de ADN como las lesiones específicas de enzimas contribuyen al número total de roturas de hebras de ADN. Dado que la migración del ADN que se atribuye al nivel basal de daño en el ADN y a lesiones específicas de enzimas puede provenir de diferentes mecanismos de genotoxicidad, no es suficiente informar únicamente del nivel total de daño en el ADN después del tratamiento enzimático. En cambio, es “esencial” informar de la genotoxicidad como sitios sensibles a las enzimas, donde el nivel basal de migración del ADN se ha restado de la migración del ADN en los portaobjetos tratados con enzimas.

Dado que el ensayo de reparación de ADN in vitro utiliza las mismas células de sustrato con todas las muestras de extracto de células o tejidos, no es necesario tener controles de fondo y tratamiento simultáneos para cada muestra en el mismo experimento (es decir, un ensayo). Puede haber más de un sustrato (p. ej., al analizar la actividad de reparación de escisión de bases y nucleótidos), y por lo tanto se necesitan controles separados para cada tipo de ensayo de reparación de ADN. Es’ esencial ‘ reportar las incisiones de la red por el extracto de reparación en el ADN del sustrato.

Paso 9C: Análisis estadístico de los resultados

Los análisis estadísticos son “esenciales”. El tipo de análisis estadístico depende del diseño del estudio y sigue los supuestos generales de las pruebas estadísticas en toxicología genética y biomonitoring41,42.