La Depleción de Macrófagos por Liposomas que Contienen Clodronato Reduce la Formación Neointimal Después de la Lesión con Balón en Ratas y Conejos

Las células inflamatorias desempeñan un papel importante en la reparación vascular, reclutadas inmediatamente después de la lesión.1,2 La infiltración de macrófagos en el tejido aterectomía y el estado de activación de los monocitos sanguíneos se correlacionan con un aumento de la tasa de reestenosis.3,4 Los efectos de los macrófagos en la reestenosis probablemente son causados por su capacidad para expresar numerosos factores de crecimiento, citoquinas y enzimas que contribuyen al desarrollo de la reestenosis.5 Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la inactivación sistémica de monocitos y macrófagos puede conducir a la atenuación de la formación neointimal y que los macrófagos desempeñan un papel fundamental en la patogénesis de la reestenosis.

La depleción de macrófagos se puede lograr con la inyección sistémica de liposomas que contienen clodronato.6 El clodronato pertenece a la familia de los bisfosfonatos (BPs), agentes que buscan huesos y que son potentes inhibidores de los osteoclastos. Al igual que otros BPs, el clodronato tiene poca permeabilidad a la membrana celular.7 Los liposomas son absorbidos fácilmente por las células del sistema reticuloendotelial, en particular los macrófagos. La administración de clodronato mediada por liposomas inactiva y mata a los macrófagos después de una fagocitosis eficaz8, pero no es tóxica para las células no fagocíticas.6

Métodos

Liposomas

Clodronato (Sifavitor) y rodamina RE (Lípidos polares de Avanti) se encapsularon en liposomas compuestos de 50 µmol/L de distearoil-fosfatidilglicerol (DSPG) (Avanti), 100 µmol/L de colesterol (Sigma Chemicals) y 150 µmol/L de 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC) (Avanti) por técnica de evaporación en fase inversa, como se describe en otra parte.9 El tamaño promedio de los liposomas fue de 190±18 nm, 24,5 mmol/L y 20 mmol/L, clodronato y lípidos, respectivamente.

Se determinó la validación de la actividad biológica del LC en 264 células CRUDAS similares a macrófagos. El clodronato, pero no libre, redujo significativamente el número y la proliferación de células viables de forma dosis dependiente y no afectó a la viabilidad y proliferación de las células de músculo liso (CML) o de las células endoteliales (CE) a concentraciones de hasta 500 µmol/L (datos no mostrados), de acuerdo con los datos publicados.8,10

Modelo de conejo

Conejos blancos de Nueva Zelanda (Laboratorios Harlan, Jerusalén, Israel) con un peso de 2,5 a 3.se utilizaron 5 kg de acuerdo con las directrices para el cuidado de animales de la Universidad Hebrea de Jerusalén y los Institutos Nacionales de Salud (EE.UU.). Los animales fueron alimentados con una dieta aterogénica de 2% de colesterol y 6% de aceite de cacahuete, comenzando 30 días antes de la angioplastia. Se determinó hipercolesterolemia (colesterol plasmático > 1200 mg / dL). Los animales fueron anestesiados con xilazina (7 mg/kg) y ketamina (40 mg/kg). Se administraron heparina (200 U/kg), atropina (0,05 mg) y nicotinato de norfloxacino (70 mg). La lesión con balón se realizó en la arteria carótida común izquierda con un catéter con balón de angioplastia de 3 mm (Cordis, inflado de 2×1 minuto a 8 atm). Los animales se asignaron aleatoriamente a liposomas intravenosos o clodronato libre (15 mg / kg), liposomas vacíos o tampón. Un investigador ciego al tipo de grupo experimental realizó los experimentos. Después de la eutanasia con pentotal, las arterias se fijaron por perfusión in situ con 150 mL de solución de formaldehído al 4% (pH 7.4), procesado para análisis morfométrico, y teñido con tinción de elastina Verhoeff, hematoxilina y eosina Mayer, y pentacromo Movat modificado.

Modelo de rata

Se utilizaron ratas Sabra macho (Laboratorios Harlan), con un peso de 350 a 420 g. El modelo de lesión de carótida de rata se realizó como se describió anteriormente.Se inyectó 11,12 clodronato liposomal (15 mg/kg) en los días -1 y +6. Los órganos se recolectaron el día 14 y se procesaron como se describió anteriormente.

Análisis morfométrico

Se analizaron de ocho a 10 secciones en cada diapositiva por medio de análisis morfométrico computarizado (Imagen de NIH) por un investigador ciego al tipo de grupo experimental. La sección con mayor estrechamiento luminal por neointima se analizó como se describió anteriormente.11 La luz residual, el área limitada por la lámina elástica interna (luz original) y el área circunscrita por la lámina elástica externa (área arterial total) se midieron directamente. El grado de engrosamiento neointimal se expresó como la relación entre el área de la neointima y la luz original (% de estenosis) y como la relación entre el área neointimal y el área de la media (N/M). El grado de remodelado, constrictivo (negativo) y expansivo (positivo), y la razón de remodelado (RR) se estimaron comparando la razón del área arterial total del segmento lesionado con balón con la de un segmento de referencia adyacente no lesionado.

Citometría de flujo

Se incubó sangre anticoagulada (200 µL) durante 30 minutos (4°C, en la oscuridad) con anti-CD14 conjugado con RPE humano de ratón (DAKO). Se añadió solución de lisado de FACS (dilución 1:20) durante 15 minutos. Las células residuales se lavaron (×1500 RPM, 5 minutos, 4°C) en medio FACS (PBS, ASC al 1%, azida de sodio al 0,02%) y se suspendieron en medio FACS de 1 mL para citometría de flujo. Los monocitos se identificaron de acuerdo con su tamaño relativo, dispersión lateral y fluorescencia.

Distribución de liposomas

Los conejos fueron inyectados con liposomas marcados con rodamina (0,4 mg/kg) y LC o tampón en el día -1 y sacrificados en los días +1 y +6. Los monocitos sanguíneos se separaron mediante gradiente Ficoll (Sigma) y centrifugación (×1500 RPM, 5 minutos). Los tejidos recolectados se enjuagaron con solución salina; las secciones se montaron en portaobjetos y se observaron mediante microscopía confocal (Zeiss LSM 410).

Inmunohistoquímica

Las muestras explantadas se extirparon después de una breve perfusión salina y se congelaron inmediatamente en un compuesto OCT para criosección (Ted Pella, Inc). Los portaobjetos se desparafinizaron, se incubaron con 1% de H2O2 en metanol (10 minutos) para bloquear la peroxidasa endógena, y luego con 10% de suero de caballo PBS durante (20 minutos). Se aplicaron anticuerpos primarios para conejo RAM-11 (DAKO) o PCNA (PC10, DAKO) durante 1 hora a 37°C. Las secciones se lavaron con PBS, seguidas de anticuerpos secundarios biotinilados (IgG anti-ratón de caballo, Laboratorio Vectorial) y un complejo avidina-biotina-peroxidasa (kit ABC Elite, Laboratorio Vectorial) durante 30 minutos cada una. El desarrollo del color se logró por exposición de 5 minutos a tetrahidrocloruro de 3,3′-diaminobencidina (sustrato de peroxidasa DAB, Sigma Chemical Co) en presencia de sustrato de peroxidasa (Sigma). Los portaobjetos fueron ligeramente teñidos con hematoxilina branquial No. 3 (Sigma). La tinción positiva se evaluó al microscopio (Olympus, BX40)a 2× / 0,25 10×/0.25 fotogramas de vídeo digitalizados y amplificados. La prevalencia de macrófagos se evaluó como el área porcentual media ocupada por células teñidas positivamente en 5 a 6 campos de alta potencia.

Producción y transcripción de IL-1β

Para estos estudios se utilizaron grupos separados de animales. Se homogeneizaron arterias e hígados en tampón de colagenasa y se midió la IL-1β extraída mediante kits ELISA comerciales (Sistemas R&D).

Para el análisis de reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR), se extrajo ARN de las arterias carótidas con el uso de un kit de aislamiento de ARN (Life Technologies). Se examinaron la calidad, el tamaño y la cantidad de ARN, y los valores de las bandas se normalizaron a la expresión de ARNm de β-actina.13

Actividad de la metaloproteinasa-2 de la matriz

Se analizó el sobrenadante de las arterias homogeneizadas en el tampón de colagenasa para determinar la actividad de la colagenasa. Las muestras se separaron en gelatina impregnada (1 mg / ml: Difco) Geles de poliacrilamida SPS al 8% en condiciones de no reducción, agitados 30 minutos en Tritón X-100 al 2,5% (BDH), incubados en tampón de colagenasa (16 horas, 37°C) y teñidos con Coomassie G 250 al 0,5% (BioRad) en metanol/ácido acético/H2O (30:10:60). La intensidad de la banda se determinó mediante densitometría computarizada (Dinámica Molecular tipo 300A).

Estadísticas

Los datos se expresan como media±DE. Las comparaciones de los hallazgos histológicos entre el grupo de control y el grupo de tratamiento se realizaron mediante la prueba t de Student no emparejada. Se realizaron comparaciones de monocitos sanguíneos y citocinas a lo largo del tiempo con análisis de ANOVA de 2 vías. Las diferencias fueron calificadas como estadísticamente significativas en P< 0,05.

Resultados

Prevención de Hiperplasia Postangioplastia

Se observó proliferación masiva de CME y formación de matriz extracelular en animales control tras lesión con balón (Figura 1, a y b). No se encontraron diferencias significativas entre el tratamiento con liposomas vacíos, solución salina o clodronato libre en solución (resultados agrupados como controles). La relación N / M fue de 1,4±0,44 (Figura 1e) y la estenosis luminal fue de 75±8%. El LC (15 mg/kg, días -1 y +6) redujo la relación N/M a 0,66±0,2 (Figura 1,c, d y e) y la estenosis luminal a 41±8%. Se produjo una remodelación expansiva leve en ambos controles (RR=1. 22±0,24) y animales tratados con CL(RR = 1,29±0,25). El área medial, la morfología ósea y la composición mineral no se vieron afectadas por el tratamiento con CP (datos no mostrados). No se observó infección manifiesta ni efectos secundarios sistémicos detectables.

Para determinar el efecto de la depleción de macrófagos en un modelo animal no hipercolesterolémico (sin células de espuma) se utilizó el modelo de lesión de carótida de rata.11 La neoíntima marcada fue suprimida por el tratamiento con CP, sin cambios significativos en el área medial y arterial total (Tabla).

Mecanismo de acción

Reducción de Monocitos Sanguíneos y Macrófagos Tisulares

El nivel basal de monocitos fue de 2,8±0,5% de glóbulos blancos (GB). Antes de la cirugía, 24 horas después de la inyección del CP, los monocitos se redujeron drásticamente a <0,2% del total de leucocitos (Figura 2,a y b), mientras que el recuento de leucocitos se mantuvo sin cambios. Tres días después de la cirugía, los monocitos sanguíneos se incrementaron ligeramente hasta el 3,5±0,4% en los animales de control y el 0,7±0,7% en los animales tratados con CP, volviendo a los niveles basales después de 6 días (Figura 2c).

Los macrófagos de hígado y bazo se redujeron mediante la tinción de LC (RAM 11) 6 días después de la lesión (Figura 3). El área teñida positivamente en el hígado se redujo significativamente de 21,5±4% a 14,7±2,9% y en el bazo de 33,3±1,5% a 11,4±3% en conejos control y tratados con CL, respectivamente. De manera similar, se observó una disminución de la tinción arterial RAM-11 para macrófagos en conejos tratados con CP 3 y 6 días después de la lesión (Figura 4).

También se detectó reducción de monocitos y macrófagos mediante inyección de liposomas fluorescentes (FL). Se observó una marcada reducción de la señal fluorescente en los monocitos sanguíneos (así como en el número reducido) y en el hígado y el bazo de los animales tratados con CL (Figura 5). Se detectaron LF en arterias lesionadas pero no en arterias intactas. El FL coadministrado con CP redujo significativamente la señal fluorescente en la pared arterial lesionada (Figura 5).

PCNA, IL-1β y Metaloproteinasa-2 de matriz

El área teñida positivamente para PCNA a los 6 días después de la lesión se redujo significativamente de 5,6±2,6% en animales control a 1,7±1,3% en conejos tratados con CP (Figura 6, a y b). Neointima apenas se observó en este punto de tiempo temprano en el que la proliferación de SMC es máxima.

El análisis de los niveles de IL-1β en el tejido arterial después de la lesión reveló un patrón en forma de campana que alcanzó su máximo a los 6 días después de la lesión y volvió a los niveles basales después de 30 días (Figura 7a), y se observó una disminución significativa de los niveles de IL-1β después de 3 y 6 días en animales tratados con CP. En los animales de control, la transcripción de ARNm de IL-1β fue más fuerte el día 3 que la expresión más débil 1 día después de la lesión, pero ambos se redujeron significativamente con el tratamiento de CP (Figura 7b). Los niveles de IL-1β en el hígado también se redujeron después de una inyección única de CP el día -1, inclinándose a los niveles basales a los 30 días (datos no mostrados).

La actividad de la metaloproteinasa de matriz arterial (MMP-2) aumentó después de la lesión, exhibiendo un patrón en forma de campana que alcanzó su punto máximo a los 6 días (292±46) y volvió a los niveles basales a los 14 días (Figura 7c). El CP alivió significativamente la actividad de MMP-2, y en el día 6 fue de solo 52±17.

Discusión

Este estudio muestra por primera vez que la inactivación de macrófagos por administración sistémica de clodronato encapsulado en liposomas inhibe la pérdida luminal tras lesión con balón en ratas y conejos hipercolesterolémicos. Estos resultados validan nuestra hipótesis de que los macrófagos desempeñan un papel fundamental en la patogénesis de arteriopatías aceleradas. El aumento observado en el área luminal se logró principalmente a través de la reducción de la hiperplasia neointimal. También se demostró un leve aumento en la remodelación expansiva, pero su contribución a la diferencia en el área luminal fue mínima.

El clodronato pertenece a la familia de los BPs, medicamentos utilizados clínicamente en trastornos relacionados con los huesos, incluida la osteoporosis. Al ser altamente hidrófilos y con carga negativa, los BPS libres son casi incapaces de cruzar las membranas celulares.La captación de 7 PB por los osteoclastos reabsorbentes óseos (que se originan como macrófagos a partir de monocitos sanguíneos) ocurre cuando las células absorben hueso recubierto de fármaco.7 Ni el clodronato libre ni el LC inhibieron la proliferación de CME o CE o la formación neointimal. La endocitosis eficaz y selectiva de clodronato en macrófagos se consigue encapsulando clodronato en liposomas.9,10,14 Después de la fagocitosis, la acción lisosómica altera las bicapas grasas del liposoma y se libera clodronato libre en la célula, causando daño funcional irreversible y apoptosis.8,15

La administración de CP probablemente abortó la respuesta de fase temprana a la lesión, que está mediada por la migración de macrófagos en respuesta a la expresión de MCP-1.16 Inyección de CP antes de la lesión monocitos sanguíneos muy agotados (Figura 2) y número y actividad de macrófagos en el hígado, el bazo y la pared arterial lesionada (Figuras 3, 4 y 5). La reducción de monocitos disponible en el momento de la lesión redujo la hiperplasia íntima, tal vez similar a los efectos observados con la desactivación de monocitos sanguíneos por la IL-10.17, bloqueando la migración de monocitos/macrófagos al vaso lesionado desde el lumen y/o adventicia (Figura 5), previno los efectos de estas células en la migración y proliferación de las CME.

Los niveles de IL-1β y MMP-2 se redujeron en segmentos arteriales lesionados después del tratamiento con CP. Estos productos principales de macrófagos activados, secretados después de una lesión arterial, contribuyen al proceso de proliferación neointimal.18-20 La reducción de la proliferación de CME también puede contribuir a la reducción de IL-1β y MMP-2.21 Sin embargo, dado que el CP no afecta a los CME y los CE y no tiene efecto sobre los fibroblastos9,el macrófago probablemente es el objetivo principal del CP. La inhibición de la hiperplasia intimal en el modelo de rata, sin células de espuma en la arteria, apoya aún más el agotamiento sistémico de los macrófagos como mecanismo que conduce a la reducción de la proliferación de la CMM y la formación neointimal. En conjunto, este efecto inmunomodulador y antiinflamatorio sistémico transitorio redujo la migración y proliferación de CME y la reestenosis arterial.

Nuestros hallazgos son concurrentes con los efectos beneficiosos observados después de la modulación de la función de los macrófagos por diversas modalidades. Se logró una reducción de la formación de neoíntima después de la lesión en conejos mediante el bloqueo de Mac-122 y en ratones con deficiencia de Mac-1.23 Por lo tanto, de acuerdo con informes recientes9, 17, 22, 23, el proceso inflamatorio juega un papel fundamental en la cascada de formación de neointima. La depleción de macrófagos también reduce la hiperplasia de los injertos de venas.24 A pesar de la diferente patología en términos de desencadenante, vaso afectado, placa subyacente en la arteria angioplastiada, composición del tejido estenótico y duración del proceso, el efecto positivo en el modelo de injerto venoso sugiere un papel común de los macrófagos en la estimulación de la hiperplasia íntima vascular.

Implicaciones y limitaciones

El clodronato libre no penetra en las células y tiene una vida media corta en la circulación sistémica.6 El clodronato que se escapa de los macrófagos y liposomas muertos no se acumula en gran medida en tejidos distintos de los huesos. No se observó ningún efecto sobre el crecimiento somático ni sobre el contenido de minerales séricos después del tratamiento con CP, ya que el resultado de la formulación liposomal, al igual que con la mayoría de los demás liposomas y sistemas de administración de fármacos en partículas, se produjo en el sistema reticuloendotelial. Además, dos inyecciones de clodronato libre de 15 mg/kg no deberían tener efecto sobre el hueso normal.25

La inactivación de macrófagos conlleva el peligro de inmunosupresión e infección. Sin embargo,al igual que en los estudios con mice26 deficiente en Mac-1 y en ratas24, en nuestro estudio no se observó infección manifiesta con depleción transitoria de macrófagos. Los monocitos sanguíneos se recuperaron completamente en este estudio 6 días después de la inyección y las concentraciones de IL-1β volvieron a los niveles basales. Otros han demostrado que la recuperación de la función de los macrófagos 4 a 6 días después de la depleción inducida por CL no induce efectos tóxicos a largo plazo.Las implicaciones clínicas de la depleción transitoria y parcial de los macrófagos hepáticos y esplénicos con CP sistémico deben examinarse más a fondo en ensayos con seres humanos.

Un gran número de informes de intentos farmacológicos de inhibir la hiperplasia íntima en animales no se tradujeron en una inhibición posterior de la reestenosis en humanos. El presente estudio utiliza el CP como una herramienta de investigación para dilucidar el papel de la inflamación en la reparación vascular y el posible valor de la modulación de la inmunidad innata en la reducción de la hiperplasia íntima post-lesión. Que el beneficio se observó en dos modelos animales, la rata y el conejo hipercolesterolémico, con lesiones dispares y diferentes grados de inflamación, apoya el papel principal de los monocitos y macrófagos en la reparación vascular y aumenta el valor predictivo para la inhibición de la reestenosis en humanos.

Las áreas ricas en macrófagos son prevalentes en las lesiones ateroscleróticas de pacientes con angina inestable e infarto agudo de miocardio3,y los macrófagos probablemente median la ruptura de la placa aterosclerótica y la aparición repentina de síndromes coronarios agudos.27 Estudios adicionales están justificados para examinar si la depleción de macrófagos por bifosfonatos liposomales puede conferir una estrategia para estabilizar otras vasculopatías y cardiomiopatías mediadas por inflamación, incluidos los síndromes coronarios agudos.

En conclusión, la administración de CP inhibió la proliferación neointimal después de la lesión con balón en la rata y en los modelos de conejos hipercolesterolémicos. El mecanismo sugerido es la modulación sistémica selectiva y transitoria de la actividad monocitaria/macrófaga. Los macrófagos, aunque relativamente escasos en el tejido neointimal, juegan un papel importante en el proceso de proliferación neointimal. Por lo tanto, la modulación temprana y la inactivación de los macrófagos durante 1 semana después de la lesión disminuyen significativamente el estrechamiento arterial de la postangioplastia en un momento posterior.

Notas a pie de página