La estabilización de la heterocromatina por RELOJ promueve el rejuvenecimiento de las células madre y la regeneración del cartílago

Anticuerpos

Para western blotting: anti RELOJ (#5157, 1:1000), anti-HP1a (#2616S, 1:1000) y anti-HP1y (#2619, 1:3,000) de Tecnología de Señalización Celular; anti-KAP1 (Ab22553, 1:2,000), anti-Lámina B1 (Ab16048, 1:1,000) y anti-LBR (Ab32535, 1:1,000) de Abcam; anti-β-actina (sc-69879, 1:3,000) de Santa Cruz Biotechnology.

For immunostaining: anti-Ki67 (ZM0166, 1:500) from ZSGB-BIO; anti-γH2AX (05-636, 1:400) from Millipore; anti-53BP1 (A300-273A, 1:500) from Bethyl Laboratories; anti-FOXA2 (8186S, 1:100) from Cell Signaling Technology; anti-SMA (A5228, 1:100), and anti-TuJ1 (T2200, 1:100) from Sigma-Aldrich; anti-H3K9me3 (Ab8898, 1:500) and anti-NANOG (Ab21624, 1:200) from Abcam; anti-Lamin A/C (sc-376248, 1:500), anti-OCT3/4 (sc-5279, 1:200) and anti-SOX2 (sc-17320, 1:100) from Santa Cruz Biotechnology; anti-Aggrecan (AF1220, 1:100), anti-Osteocalcin (MAB1419, 1:100), and anti-FABP4 (AF3150, 1:100) de sistemas R&D.

Para citometría de flujo: anti-CD73 (550257, 1:200), anti-CD90 (555595, 1:200), anti-CD44 (550989, 1:200), anti-HLA-ABC (560168, 1:100), anti-CD34 (555822, 1:200), anti-CD43 (560198, 1:200), anti-CD45 (555482, 1:200), anti-CD14 (555398, 1:200) y anti-CD19 (555415, 1:200) de BD Biosciences; anti-CD105 (17-1057-41, 1:200) y anti-PDPN (17-9381-42, 1:200) de eBioscience (San Diego, CA, USA); anti-CD29 (303004, 1:200), y anti-CD13 (301705, 1:200), anti-CD166 (343903, 1:200) y anti-CD164 (324805, 1:200) de Biolegend (San Diego, CA, Estados UNIDOS).

Cultivo celular

CLOCK+/+ hESCs (hESCs, línea H9, Instituto de Investigación WiCell) y CLOCK−/− hESCs se mantuvieron en capas alimentadoras que consistían en fibroblastos embrionarios de ratón inactivados con mitomicina C (MEF) en medio de cultivo de HESC. El medio de cultivo de hESC contenía DMEM / F12 (Thermo Fisher Scientific), Reemplazo Sérico por eliminación al 20% (Thermo Fisher Scientific), 0.Aminoácidos no esenciales de 1 mM (NEAAs, Thermo Fisher Scientific), GlutaMAX de 2 mM (Thermo Fisher Scientific), β-mercaptoetanol de 55 µM (Thermo Fisher Scientific), penicilina/estreptomicina al 1% (Thermo Fisher Scientific) y 10 ng/ml de bFGF (Joint Protein Central, Incheon, Corea). Alternativamente, se cultivaron hESCs en placas recubiertas de Matrigel (BD Biosciences, San José, CA, EE.UU.) en medio mTeSR (STEMCELL Technologies, Vancouver, Canadá).

Tanto las HMSC derivadas de hESC como las HMSC primarias se mantuvieron en un medio MSC que contenía MEMa (Thermo Fisher Scientific) suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS) (Cat# 10099-141, Lote# 1616964, Thermo Fisher Scientific), NEAAs de 0,1 mM (Thermo Fisher Scientific), penicilina/estreptomicina al 1% (Thermo Fisher Scientific) y 1 ng/ml de bFGF (Proteína Central de las Articulaciones, Incheon, Corea).

La edición de genes mediada por CRISPR / Cas9 en hESCs

La edición de genes mediada por CRISPR/Cas9 se realizó a través de métodos descritos anteriormente con algunas modificaciones.33,34,65 En resumen, se clonó un exón 5 de ARN guía de CLOCK (CLOCK-gRNA) en un vector de clonación de gRNA (#41824, Addgene) (Información suplementaria, Tabla S1). Tras el tratamiento con un inhibidor de ROCA Y-27632 (S1049, Selleck) durante 24 h, se resuspendieron hESCs (5 × 106) en 100 µL de Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific) que contenía el cóctel plásmido, que consistía en el plásmido donante que contenía los brazos de homología, CLOCK-gRNA y hCas9 (#41815, Addgene), y se electroporaron en un sistema Nucleofector 4D (Lonza). Las celdas se sembraron en celdas alimentadoras de MEF. Se añadió G418 (100 µg/mL, 11811023, Thermo Fisher Scientific) para iniciar la selección positiva 2-4 días después de la electroporación. Después de 2 semanas de selección, se recogieron clones resistentes a G418 y se transfirieron a una placa de 96 pocillos para una mayor caracterización y expansión. Se utilizó PCR genómica y western blot para la identificación de la edición genómica. Además, eliminamos el casete de resistencia a la neomicina en CLOCK−/− hESCs a través de electroporación con el vector pCAG-FLpo-2A-puro. Tres días después de la transfección, se utilizó 1 µg/ml de puromicina (Thermo Fisher Scientific) para enriquecer las células resistentes a la puromicina durante 48 h. Después de 8-12 días de selección, las colonias emergentes se seleccionaron y ampliaron para el estudio posterior.

Generación y caracterización de HMSC

Las HMSC se diferenciaron de las HESC siguiendo un protocolo publicado previamente.25,86,87 En resumen, los HESCS se disociaron en cuerpos embrionarios (EBs) y se trataron con medio de diferenciación (MEMa (Invitrogen) suplementado con FBS al 10% (Cat# 10099-141,Lote# 1616964, Thermo Fisher Scientific), 0.NEAAs de 1 mm (ThermoFisher Scientific), 10 ng/ml de bFGF, 5 ng/ml de TGFß y 1% de penicilina/estreptomicina (Gibco) en placas recubiertas con Matrigel durante 10 días hasta la confluencia del 95%. A continuación, las células confluentes similares a MSC se digirieron y se platearon en placas recubiertas de Matrigel tratadas con medio de cultivo MSC que contenía MEMa (Invitrogen) suplementado con 10% de FBS, 0,1 mM de NEAAs, 1 ng/ml de bFGF y 1% de penicilina/estreptomicina (Gibco). Luego, las células confluentes tipo MSC se pasaban a placas recubiertas de gelatina. Las HMSC se purificaron con diferentes anticuerpos correspondientes a marcadores específicos de hMSC (CD73, CD90 y CD105) por FACS. Las células triple positivas CD73, CD90 y CD105 se caracterizaron además por marcadores de antígenos de superficie, incluidos marcadores positivos, como CD44, CD166, CD29, HLA-ABC y CD13, y marcadores negativos, como CD34, CD43, CD45, CD164, CD14, CD19 y PDPN. La funcionalidad de las CMM se verificó mediante la diferenciación hacia condrocitos, adipocitos y osteoblastos. Los osteoblastos, condrocitos y adipocitos derivados de hMSCs se caracterizaron por tinción de von Kossa (GMS 80045.3, GenMed Scientific Inc., EE.UU.) y tinción de osteocalcina (que indica osteogénesis), azul de toluidina (T3260, Sigma) y tinción de agrecan (que indica condrogénesis), y tinción de Rojo aceite O (O1391, Sigma) (que indica adipogénesis) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Aislamiento y cultivo de CMM primarias

Se aislaron CMM primarias de la encía de diferentes individuos.23,33,34,65 Los tejidos separados de la encía se cortaron en trozos pequeños (1 mm2) con tijeras en TrypLE™ Express Enzyme (1 ×) más Dispase IV y se incubaron a 37 °C durante 30 min. Las suspensiones de tejido digerido fueron neutralizadas por medio de cultivo MSC y centrifugadas a 200 × g durante 5 min a temperatura ambiente. Los pellets resultantes se resuspendieron en medio de cultivo MSC que contenía MEMa (Invitrogen) suplementado con 10% de FBS (Gibco), 1 ng/ml de bFGF y 1% de penicilina/estreptomicina (Gibco) y se platearon en placas recubiertas de gelatina para el crecimiento de HMSC primarias.

Ensayo de reportero de luciferasa

El plásmido PER2-dLuc fue un regalo amable de E. E. Zhang.Se cultivaron 88 células que albergaban PER2-dLuc hasta la confluencia en placas de cultivo de 24 pocillos y se sincronizaron con forskolina de 20 µM (S2449, Selleck) durante 2 h. El medio se reemplazó con un medio de cultivo MSC que contenía luciferina de 0,25 mM (LUCK-1G, GoldBio). Las células se monitorizaron en un luminómetro LumiCycle a 37 °C durante 5-7 días; los datos generados se analizaron con el software de análisis LumiCycle (Actimetrics). Los datos del primer ciclo de 24 horas fueron excluidos de nuestro análisis estadístico.

Sincronización de HMSC in vitro y análisis circadiano

Las HMSC se platearon en placas recubiertas de gelatina con medio MSC hasta la confluencia del 95%. Para la sincronización, las células se trataron con forskolina de 20 µM durante 2 h y se volvieron a almacenar en medio MSC después de lavarse dos veces con PBS. Las células se recolectaron a partir de las 24 horas posteriores a la sincronización a intervalos de 3 horas durante 9 puntos de tiempo, seguido de extracción de ARN y detección de RT-qPCR. Se utilizó la prueba no paramétrica JTK_CYCLE para verificar las oscilaciones circadianas descritas anteriormente.Se consideraron rítmicos 89 hilos de curso temporal de HMSC con valores de p y q < 0,05.

Western blotting

Se lisaron células en un tampón SDS que contenía 4% SDS y 100 mm Tris-HCl. La concentración de proteínas se cuantificó utilizando un kit de cuantificación de BCA (Thermo Fisher Scientific), y ~20 µg de proteína por muestra se sometió a SDS-PAGE y se electrotransferió a membranas de PVDF (Milipora). Luego, las membranas se bloquearon con leche al 5%, se incubaron con anticuerpos primarios y luego con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP). Se visualizaron bandas inmunorreactivas en un sistema ChemiDoc XRS +(Bio-Rad). Los análisis estadísticos se cuantificaron mediante el software Image J (NIH). Cada grupo tuvo tres experimentos independientes. Los significados estadísticos se evaluaron mediante una prueba t de Student sin pareja de dos colas.

Microscopía electrónica de transmisión

El RELOJ de paso tardío (P9)+/+ y el RELOJ-/− HMSC se recolectaron enzimáticamente con TripLO (Thermo Fisher Scientific) y se centrifugaron a 500 × g durante 5 min a temperatura ambiente. Los pellets resultantes se fijaron con 4% de paraformaldehído (PFA) en PBS (pH 7,4) en hielo durante la noche. Posteriormente, las células se deshidrataron en una serie graduada de etanoles, se permeabilizaron y se incrustaron en resina HM20 de bajo contenido de tricrilo. Se obtuvieron secciones (200 nm) y se tomaron imágenes con un microscopio electrónico de transmisión de alcohol (Compañía FEI) operando a 100 kV.

Tinción de inmunofluorescencia

Las células sembradas en cubreobjetos (Thermo Fisher Scientific) se lavaron dos veces con PBS. Luego, las células se fijaron con 4% de PFA durante 30 min, se permeabilizaron con 0,4% de Tritón X-100 en PBS durante 30 min y se bloquearon con 10% de suero de burro en PBS (Jackson Immuno Research) durante 1 h a temperatura ambiente. Después del bloqueo, las células se incubaron con anticuerpos primarios a 4 °C durante la noche. Posteriormente, las células se lavaron tres veces con PBS, se incubaron con anticuerpos secundarios a temperatura ambiente durante 1 h y se lavaron tres veces con PBS. Los núcleos fueron teñidos con Hoechst 33342 (H3570, Thermo Fisher Scientific). La obtención de imágenes se realizó con un sistema confocal Leica SP5. El análisis estadístico del número, la intensidad y el área de las señales de fluorescencia se cuantificó mediante el software Image J (NIH). Se recolectaron células de tres réplicas biológicas. Los significados estadísticos se evaluaron mediante una prueba t de Student sin pareja de dos colas. La reconstrucción 3D de la tinción H3K9me3 como se muestra en la Fig. el 2f se realizó mediante seccionamiento de pila z en serie a intervalos de 50 nm en un modo convencional para hasta 50 imágenes con un sistema confocal Leica SP5 y se procesó posteriormente para la reconstrucción 3D con el software Imaris (versión 7.4.2) como se describió anteriormente.90

Ensayo de tinción de SA-β-gal

La tinción de SA-β-gal se realizó como se describió en estudios anteriores.33,34 En resumen, las células se fijaron con tampón de fijación (2% de formaldehído y 0.2% de glutaraldehído) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Luego, las células fijas se teñieron con solución de tinción fresca a 37 °C durante la noche. Los campos de visión se seleccionaron aleatoriamente en cada pozo, y el porcentaje de células SA-β-gal positivas se determinó utilizando el software ImageJ. Cada grupo tenía tres réplicas biológicas. Los significados estadísticos se evaluaron mediante una prueba t de Student sin pareja de dos colas.

Ensayo de expansión clonal

Se realizó un ensayo de expansión clonal como se informó anteriormente.34,65 En resumen, se sembraron 6000 células por pozo en placas de 6 pozos y se cultivaron durante 9-12 días. Las células se lavaron dos veces con PBS, se fijaron con 4% de PFA y se teñieron con 0,2% de violeta cristalino durante 1 h a temperatura ambiente. Los campos de visión se escanearon con un escáner y se midieron con el software ImageJ (NIH). Cada grupo tenía tres réplicas biológicas. Los significados estadísticos se evaluaron mediante una prueba t de Student sin pareja de dos colas.

Co-IP

Las células HEK293T transfectadas con plásmidos que expresaban Flag-Luc o Flag-CLOCK y hMSCs se lisaron en tampón de lisis CHAPS (NaCl de 120 mm, 0.3% CHAPS, EDTA de 1 mM, HEPES de 40 mM (pH 7,5) y cóctel completo de inhibidores de proteasa (Roche) a 4 °C durante 4 h y luego se centrifugaron a 14.500 × g a 4 °C durante 40 min. Para Co-IP con proteínas exógenas, los sobrenadantes se mezclaron con perlas acopladas a anticuerpos anti-Flag (A2220, Sigma) y se rotaron durante la noche a 4 °C. Para Co-IP con proteínas endógenas, los sobrenadantes se mezclaron con los anticuerpos indicados durante la noche a 4 °C con rotación y luego se incubaron con perlas de agarosa de Proteína A/G-PLUS (sc-2003, Santa Cruz) durante otras 4 h a 4 °C con rotación. Las perlas se lavaron seis veces con tampón CHAPS y luego se elutaron con péptidos Flag o hirviendo en tampón de carga 1× SDS durante 10 minutos para el western blot.

Análisis LC-MS/MS e identificación de proteínas

Las proteínas eluidas obtenidas por inmunoprecipitación se sometieron a SDS-PAGE al 10% y se teñieron con azul brillante de Coomassie (WB-0101, Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co. Ltd). Las bandas de gel que contenían las muestras de proteínas se extirparon, se cortaron en pequeños tapones, se deshidrataron (100% acetonitrilo), se redujeron (TDT de 10 mM en 25 mM NH4HCO3 durante 45 min a 56 °C) y se alquilaron (yodoacetamida de 40 mM en 25 mM NH4HCO3 durante 45 min a temperatura ambiente en la oscuridad). A continuación, los tapones de gel se secaron y digerieron con tripsina modificada de grado secuencial (40 ng por banda) en 25 mM NH4HCO3 durante la noche a 37 °C. Finalmente, se utilizó ácido fórmico a una concentración final del 1% para terminar la reacción enzimática. La solución resultante se transfirió a un vial de muestra para el análisis de LC-MS/MS.

Los experimentos nanoLC-MS/MS se realizaron en un espectrómetro de masas Q Exactive (Thermo Scientific) en modo dependiente de datos, lo que permitió la adquisición de datos MS a una alta resolución de 70.000 (m/z 200) en un rango de m/z de 300 a 1.600. Los datos brutos de Q Exactive analysis se analizaron con Proteome Discovery (versión 1.4) utilizando el motor de búsqueda Sequest HT para identificación de proteínas y el Percolador para análisis de tasa de descubrimiento falso (FDR). Los datos se compararon con la base de datos de proteínas humanas de UniProt (actualizada el 06-2013). El análisis de FDR se realizó con Percolador, y se estableció FDR < 1% como umbral para la identificación de proteínas. La confianza del péptido se estableció en alta para el filtrado de péptidos.

RT-qPCR y ARN-Seq

El ARN total se extrajo de células humanas cultivadas o articulaciones de ratón utilizando TRIzol (Thermo Fisher Scientific), y el ADN genómico se extrajo utilizando un kit libre de ADN (Thermo Fisher Scientific). El cDNA se generó con el Sistema de Transcripción Inversa de Script Go (Promega). La RT-qPCR se realizó utilizando qPCR Mix (Toyobo) en un sistema en Tiempo Real CFX384 (Bio-Rad). Cada grupo tenía cuatro réplicas de pozos. Los significados estadísticos se evaluaron mediante una prueba t de Student sin pareja de dos colas. Todos los experimentos de RT-qPCR se realizaron con al menos tres réplicas experimentales y se repitieron de forma independiente durante al menos dos veces. Para el ARN-seq de articulación de ratón, se mezclaron muestras de ARN de articulación de rodilla del mismo grupo de tratamiento de ratones ancianos inyectados con lentivirus que expresaban Luc (n = 12 ratones) o CLOCK (n = 12 ratones) por igual en masa, y el ARN-seq se realizó con dos réplicas técnicas. Para el ARN-seq de hMSC, se examinaron dos réplicas biológicas. Se construyó una biblioteca de secuenciación utilizando un kit de Preparación de la Biblioteca de Ultra ARN de NEBNext para Illumina siguiendo el protocolo del fabricante. Las bibliotecas generadas se secuenciaron en plataformas Illumina HiSeq X-Ten con secuenciación de extremos emparejados con longitudes de lectura de 150 bp. El control de calidad y la secuenciación se realizaron mediante Tecnología Bioinformática de genes NoVo. Los cebadores utilizados para qPCR se mostraron en la información complementaria, Tabla S2.

Procesamiento de datos RNA-seq

La tubería de procesamiento de datos RNA-seq se ha informado previamente.Se recortaron 34 lecturas de extremos emparejados sin procesar en el software Trim Galore (versión 0.4.5) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Las lecturas limpias se asignaron al genoma humano hg19 de la UCSC o al genoma mm10 de ratón mediante hisat2 (versión 2.0.4).91 Los archivos sam fueron convertidos a archivos bam por SAMtools con el parámetro “- S-b-q 10”.92 Luego, los recuentos de lectura fueron calculados por HTSeq (versión 0.11.0), y solo se conservaron lecturas mapeadas de alta calidad (calidad de mapeo > 20).93 El valor de Fragmentos por Kilobase por Millón (FPKM) para cada gen se calculó utilizando StringTie (versión 1.2.3).Se calcularon 94 genes expresados diferencialmente (DEG) utilizando el paquete DESeq2 (versión 1.22.2) con el punto de corte “valor q (valor p ajustado, padj) < 0,05 y |log2 (cambio de plegado)| > 1 para hMSCs o |log2 (cambio de plegado)| > 0,5 para articulaciones de ratón”. El análisis de enriquecimiento por ontología génica (GO) se realizó con ToppGeno.95 El análisis de enriquecimiento de conjuntos genéticos fue realizado por GSEA (versión 2.2.4). El conjunto de genes SASP se obtuvo de un estudio previo.42

DamID-seq

pLgw V5-EcoDam y pLgw EcoDam-V5-EMD fueron regalos del Prof. Bas van Steensel (Instituto del Cáncer de los Países Bajos (NKI)). El DamID-seq se realizó como se describe,58 con modificaciones. En resumen, los lentivirus Dam y Dam-EMD generados a partir de células HEK293T se concentraron por ultracentrifugación a 19.400× g durante 2,5 h. Los gránulos de virus se resuspendieron en PBS. CLOCK + / + y CLOCK−/− HMSC se sembraron en platos de seis pocillos a 2 × 105 celdas por pocillo. Cada grupo tenía tres réplicas biológicas. Al día siguiente, el medio de cultivo fue reemplazado por 2 ml de medio de cultivo fresco que contenía lentivirus Dam o Dam-EMD. A las 72 h después de la transducción, se recolectaron células y se aisló ADN genómico utilizando un kit de tejidos de sangre DNeasy & (69504, Qiagen). La digestión DpnI (R0176S, New England Biolabs), la ligadura de adaptadores, la digestión DpnII (R0543S, New England Biolabs), la amplificación de PCR y la purificación se realizaron como se describió anteriormente.58 Para el recorte del adaptador, el ADN amplificado fue sonicado y digerido con AlwI (R0513S, New England Biolabs). La biblioteca de ADN se construyó utilizando un kit de preparación de la Biblioteca de ADN Ultra de NEBNext para Illumina (E7370S, New England Biolabs). Las bibliotecas se agruparon y se sometieron a secuenciación de extremos emparejados con longitudes de lectura de 150 bp en secuenciadores Illumina NovaSeq.

Procesamiento de datos DamID-seq

Las lecturas sin procesar de datos Dam y Dam-EMD para CLOCK + / + y CLOCK – / – HMSC se recortaron en el software Trim Galore (versión 0.4.5) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Las lecturas recortadas se asignaron al genoma humano hg19 de la UCSC utilizando Bowtie 2 (versión 2.2.9).Se eliminaron 96 duplicados de PCR con los duplicados de marca.programa jar en herramientas Picard. Luego, las lecturas se ordenaron con SAMtools (versión 1.6). Para minimizar el efecto del sesgo y la profundidad de secuenciación, se fusionaron lecturas procesadas de tres réplicas para cada muestra. Luego, se seleccionó al azar el mismo número (110 millones) de lecturas de alta calidad para cada tipo de celda para el análisis posterior. Para visualizar las señales DamID, calculamos la relación log2 de las Lecturas Por Kilobase por Millón de lecturas mapeadas (RPKM) de las señales Dam-EMD y Dam (log2 (Dam− EMD/Dam)) en CLOCK+/+ y CLOCK−/-hMSCs para cada bin de 10 bp utilizando el programa bamCompare en el software deepTools (versión 2.5.4-2-5ee467f).

Para la identificación de regiones LAD en CLOCK+/+ y CLOCK−/− HMSC, primero calculamos las señales DamID (relación log2 del RPKM de las señales Dam-EMD y Dam (log2 (Dam-EMD/Dam)) en CLOCK+/+ y CLOCK−/− hMSC para cada contenedor de 2 kb utilizando el programa bamCompare en deepTools (versión 2.5.4-2-5ee467f). Luego, implementamos el paquete R para los modelos ocultos de Markov con emisiones t (HMMt) (versión 0.1), para identificar a los muchachos (https://github.com/dinovski/asDamID/blob/master/scripts/hmmt_functions.R).

Para comparar las señales DamID en regiones LAD entre CLOCK+/+ y CLOCK−/− hMSCs, fusionamos las regiones LAD identificadas en CLOCK + / + y CLOCK−/− hMSCs en unidades de unión y calculamos la señal DamID relativa (señal DamID en CLOCK−/− hMSCs menos señal DamID en CLOCK+/+ hMSCs) para cada región LAD de unión. Luego, se trazaron las señales DamID relativas para las regiones LAD utilizando el rideograma del paquete R (versión 0.2.2), como se muestra en la información complementaria, Fig. S4d.97

ChIP-qPCR y ChIP-seq

En resumen, 1 × 106 CLOCK+/+ y CLOCK−/− HMSC se reticularon en formaldehído al 1% (vol / vol) en PBS durante 8 min a temperatura ambiente, y la reacción terminó con incubación con glicina de 125 mM durante 5 min a temperatura ambiente. Luego, las muestras se lisaron en hielo durante otros 10 minutos. Después de la sonicación en el ultrasonicador focalizado Covaris S220 (Covaris) y la centrifugación durante 10 minutos a 12.000 × g a 4 °C, los sobrenadantes se incubaron durante la noche a 4 °C con Dynabeads de proteína A (Thermo Fisher Scientific, 10004D) conjugados con un anticuerpo anti RELOJ, un anticuerpo anti-H3K9me3 o IgG de conejo. Posteriormente, elución y reticulación inversa se realizaron a 68 °C durante 2 h en un termomezclador. Luego, el ADN se aisló a través de la extracción de alcohol fenol-cloroformo-isoamílico y la precipitación de etanol. El ADN purificado se sometió a qPCR para la evaluación de la ocupación de RELOJ o H3K9me3 en secuencias repetitivas. Los fragmentos enriquecidos se construyeron en bibliotecas sin la incorporación de controles de punta a través de kits de preparación Hyper de KAPA con Amplificación de Biblioteca de PCR/Serie Illumina (KK8504, Biolabs de Nueva Inglaterra) siguiendo las instrucciones del fabricante. Todos los experimentos se realizaron al menos dos veces con resultados similares. Los significados estadísticos se evaluaron mediante una prueba t de Student sin pareja de dos colas.

Procesamiento de datos ChIP-seq

Para el procesamiento de datos ChIP-seq H3K9me3, las lecturas en bruto se recortaron con el software Trim Galore (versión 0.4.5) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Las lecturas recortadas se asignaron al genoma humano hg19 de la UCSC utilizando Bowtie 2 (versión 2.2.9).Se eliminaron 96 lecturas duplicadas con los duplicados de marcas.programa jar en herramientas Picard. Luego, las lecturas se ordenaron con SAMtools (versión 1.6). Para minimizar el efecto del sesgo y la profundidad de secuenciación, se fusionaron lecturas procesadas de tres réplicas para cada muestra. Luego, el mismo número (130 millones) de lecturas de alta calidad para cada tipo de célula se seleccionaron aleatoriamente para el análisis posterior. Para visualizar las señales de CHIP-seq, calculamos los recuentos de lectura normalizados determinando los valores de RPKM para cada contenedor de 10 bp. Para la llamada a picos H3K9me3, se utilizó SICER (versión V1.1) con el parámetro “-w 200-g 3”.98 Solo se mantuvieron los picos llamados H3K9me3 con un límite FDR del 1% o superior.

Para la identificación de “montañas H3K9me3”, se calculó la señal H3K9me3 en recuentos por millón (CPM) en cada pico H3K9me3. A continuación, clasificamos los picos H3K9me3 en el orden de aumento de la señal H3K9me3 y trazamos la ocupación del chip seq H3K9me3 en CLOCK+/+ y CLOCK-/− HMSC, como se muestra en la información complementaria, Fig. S4f. Estas parcelas mostraron un punto claro donde la señal de ocupación H3K9me3 comenzó a aumentar rápidamente. A continuación, se determinaron los puntos de inflexión de estas curvas. Definimos además los picos H3K9me3 por encima de los puntos de inflexión como “montañas H3K9me3” y los picos H3K9me3 por debajo de esos puntos como picos típicos de H3K9me3.

ATAC-seq

ATAC-seq se realizó como se describió anteriormente.99 En resumen, un total de 50.000 células se lavaron dos veces con PBS y se resuspendieron en 50 µL de tampón de lisis (10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,1% (v/v) Sustituto de P40 no dietético). La suspensión de núcleos se centrifugó a 500 × g durante 10 minutos a 4 °C, seguido de la adición de 50 µL de mezcla de reacción de transposición (10 µL de tampón de 5 × TTBL, 4 µL de mezcla de TTE y 36 µL de H2O libre de nucleasas) de un kit de Preparación de biblioteca de ADN Truep V2 para Illumina (Vazyme Biotech). Las muestras se incubaron a 37 ° C durante 30 min. Las bibliotecas se amplificaron y purificaron utilizando el Kit de Preparación de Bibliotecas de ADN TruePrep V2 para Illumina (Vazyme Biotech). La calidad de la biblioteca se evaluó mediante un analizador de fragmentos. Finalmente, las bibliotecas se secuenciaron en plataformas Illumina HiSeq X-Ten con secuenciación de extremos emparejados con longitudes de lectura de 150 bp.

Procesamiento de datos ATAC-seq

Para el procesamiento de datos ATAC-seq, las lecturas en bruto se recortaron con el software Trim Galore (versión 0.4.5) (https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore). Las lecturas recortadas se asignaron al genoma humano hg19 de la UCSC utilizando Bowtie 2 (versión 2.2.9) con el parámetro “- X 2000-N 1-L 25-no-mixed-no-discordant-t”.Se eliminaron 96 lecturas duplicadas con los duplicados de marca.programa jar en herramientas Picard. Luego, las lecturas se ordenaron con el software SAMtools (versión 1.6). A continuación, se fusionaron las lecturas procesadas de tres réplicas para cada muestra. Para visualizar las señales ATAC, ampliamos cada lectura en 250 pb y normalizamos los recuentos de lectura por el valor de RPKM para cada bandeja de 10 pb. Para llamadas de picos ATAC, se utilizó MACS2 (versión 2.1.1.20160309) con el parámetro “–nomodel –shift 0 –extsize 250 –call-summits”.Se conservaron 100 picos de ATAC llamados únicamente con valores q < 0,01. Los picos ATAC identificados en RELOJ + / + pero no en RELOJ – / – hMSCs se definieron como picos ATAC “Cerrados”; los picos ATAC identificados en RELOJ−/− pero no en RELOJ+/+ hMSCs se definieron como picos ATAC” Abiertos”. Estimación de la distribución genómica de los picos ATAC utilizados annotatePeaks.pl programa en homer software.101

Evaluación de la reproducibilidad de los datos de secuenciación

Para evaluar la reproducibilidad de los datos H3K9me3 ChIP-seq y ATAC-seq, se calculó la distancia euclidiana entre réplicas de la siguiente manera: las lecturas fueron contadas y normalizadas por el RPKM en un tamaño de contenedor de 2 kb. Luego, se calculó la distancia euclidiana en R (versión 3.5.1) para evaluar la reproducibilidad. Distancias euclidianas más bajas significan correlaciones más altas. Para evaluar la reproducibilidad de los datos de DamID-seq, se realizó el análisis de componentes principales (PCA) en R (versión 3.5.1). Para evaluar la reproducibilidad de los datos de ARN-seq, se trazaron gráficos de dispersión basados en el recuento de lecturas normalizado de logaritmos regularizados (rlog) con DESeq2 y se calculó el coeficiente de correlación de Pearson entre réplicas.

Experimentos con animales

Para el análisis de formación de teratomas, ratones con NOD/SCID (6-8 semanas de edad, comprados a Beijing Vital River Laboratory Animal Technologies Co. Ltd) se inyectaron con 3 × 106 CLOCK+/+ o CLOCK−/− hESCs en una solución Matrigel: mTeSR (1:4). Los teratomas se recolectaron 8-12 semanas después de la inyección para un análisis posterior.

Para los ensayos de trasplante hMSC, se inyectaron 1 × 106 RELOJ+/+ o RELOJ−/− HMSC transducidas con lentivirus que expresaban Luc en el músculo TA de ratones desnudos (de 6 a 8 semanas de edad). Los ratones fueron tratados con D-luciferina (LUCK-1G, GoldBio) y se obtuvieron imágenes con un sistema de imágenes de espectro IVIS (Xenogen, Caliper, Waltham, MA, EE.UU.). Las imágenes de bioluminiscencia se adquirieron en modo “automático”. Cada grupo tenía seis réplicas biológicas. Los significados estadísticos se evaluaron mediante una prueba t de Student sin pareja de dos colas.

Para la detección del nivel de Reloj asociado al envejecimiento, se practicó la eutanasia a ratones de diferentes edades (jóvenes, 1 mes, n = 5 ratones; ancianos, 15 meses, n = 10 ratones) y se recolectaron las articulaciones para el análisis RT-qPCR. Los significados estadísticos se evaluaron mediante una prueba t de Student sin pareja de dos colas.

Para evaluar si la administración lentiviral de CLOCK podría aliviar los síndromes relacionados con el envejecimiento, se inyectaron lentivirus que expresaban Luc (n = 14 ratones) o CLOCK (n = 13 ratones) en las cavidades articulares de ratones de 18 meses de edad (comprados en SPF (Beijing) Biotechnology) y se repusieron después de 8 semanas de inyección. El experimento en cinta de correr se llevó a cabo a las 15 semanas después de la primera inyección de lentivirus que expresaban Luc o CLOCK. En detalle, los ratones fueron entrenados en una cinta de correr (SA101, SANS) a una inclinación de 5° durante 3 días durante 20 minutos cada día, con la velocidad acelerada de 0 a 20 m/min. El día de la prueba, los ratones corrieron en la cinta de correr con una velocidad inicial de 0 m / min, y luego la velocidad se incrementó en 2 m/min a 20 m / min. Todo el tiempo de funcionamiento se fijó en 20 minutos. Se registró y analizó la frecuencia de estímulo de descarga eléctrica leve (Luc, n = 14 ratones; RELOJ, n = 13 ratones). Se realizó una micro-tomografía computarizada a las 16 semanas de la primera inyección (Luc, n = 14 ratones; RELOJ, n = 13 ratones). A continuación, se practicó la eutanasia a los ratones y se recogieron las articulaciones para su evaluación histológica (Luc, n = 14 ratones; RELOJ, n = 13 ratones) y cuantificación del ARNm (Luc, n = 12 ratones; RELOJ, n = 12 ratones). Los significados estadísticos se evaluaron mediante una prueba t de Student sin pareja de dos colas.

Histología e inmunohistoquímica

Para el análisis histológico, las articulaciones de ratón recolectadas se fijaron con AFP al 4% durante 2 días y se incrustaron en parafina después de la descalcificación durante 14-21 días. Las secciones (5 µm) se teñieron con FCF verde rápido (0,02%) y safranina O (0.1%) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La tinción inmunohistoquímica se realizó utilizando el método de tinción DAB descrito anteriormente, con algunas modificaciones.33,34,102 En primer lugar, los portaobjetos se desparafinizaron y rehidrataron utilizando xileno y diferentes concentraciones de alcohol. La recuperación de antígenos se realizó mediante digestión de tripsina (ZLI-9010, ZSGB-BIO) durante 20 min a temperatura ambiente. Se utilizó peróxido de hidrógeno (3%) para bloquear la actividad de la peroxidasa endógena incubando durante 10 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos se bloquearon con suero de burro al 10% durante 1 hora a temperatura ambiente y se incubaron con un anticuerpo anti-P16 (Ab54210, Abcam, 1:200) a 4 °C durante la noche y con un anticuerpo secundario (PV-6002, ZSGB-BIO) durante 1 hora a temperatura ambiente antes de la tinción (ZLI-9017, ZSGB-BIO).

Declaraciones éticas

Los experimentos involucrados en este estudio siguieron los Principios para el Formato de Solicitud de Aprobación Ética para Investigaciones con Animales y fueron aprobados previamente por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Instituto de Zoología (Academia China de Ciencias). La anestesia de ratones se realizó con isoflurano y la eutanasia con CO2 seguida de dislocación cervical.

Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software Graph-Pad Prism. Los datos se presentan como medias ± SEM o DE. Las comparaciones se realizaron con la prueba t de Student sin aparear de dos colas. El valor de P (p) < 0,05 se definió como estadísticamente significativo.