La expresión constitutiva de genes seleccionados de las vías aromáticas y de pentosa fosfato aumenta el rendimiento de ácido shikímico en cultivos de lotes con alto contenido de glucosa de una cepa de Escherichia coli que carece de PTS y pykF

plásmido diseñado para la expresión constitutiva de un operón sintético utilizado en la producción de ácido shikímico

La evidencia no publicada de nuestro laboratorio indica que la producción de compuestos aromáticos en la cepa PB12 evolucionada en laboratorio puede alcanzar niveles más altos cuando la inducción transcripcional de los genes involucrados en canalizar el flujo de carbono en la vía AAA se produce al comienzo de las fermentaciones. Teniendo en cuenta esta observación, se desarrolló una nueva estrategia para optimizar la producción de SA en PB12 portadores de genes aroK y aroL inactivos (Figura 1). Esta estrategia incluyó el diseño y construcción de un plásmido para la expresión fuerte y estable de seis genes clave dispuestos en forma de operón sintético, controlado exclusivamente por un solo promotor de Trc. Para reducir la carga metabólica, se utilizó como vector un único plásmido derivado de pBR327 que transportaba el par locus para aumentar la estabilidad del plásmido , después de incorporar un fragmento que contenía el promotor, el polilinker y los terminadores transcripcionales de pTrc99A (Figura 2).

La parte inicial del operón se construyó mediante amplificación secuencial y ligadura de las primeras 4 secuencias codificantes (aroB, tktA, aroGfbr y aroE) en el polilinker de plásmido pBRINT-Ts Cm, utilizado como andamio de clonación (ver Métodos). Más tarde, la construcción de 4 genes se transfirió al plásmido híbrido pTrc327par junto con 2 genes más (aroD y zwf), dando lugar a un operón de 8 Kb contenido en un plásmido de 12 Kb (Figura 2). El plásmido resultante, denominado pTrcAro6, se transformó en la cepa PB12 aroK-aroL desprovista del gen lacIq, permitiendo la expresión constitutiva de los genes de interés (Tabla 1). Por simplicidad, la cepa PB12 aroK-aroL-lacI generada se denominó AR2. Después de que el gen pykF fuera inactivado en AR2, la cepa resultante fue nombrada AR3. Las cepas derivadas de AR2 y AR3 portadoras de plásmido pTrcAro6 se denominaron AR26 y AR36, respectivamente (Tabla 1).

La disposición espacial de las secuencias codificantes que constituyen el operón sintético en pTrcAro6, flanqueado por el promotor de Trc y los terminadores transcripcionales, se muestra en la Figura 2. El aroB es el primer gen en el operón ya que varias evidencias indican que su baja expresión es uno de los pasos limitantes en la producción de compuestos aromáticos . El plásmido pTrcAro6 también lleva los genes tktA y aroGfbr, cuyos productos están involucrados en la síntesis de E4P y su condensación con PEP para formar DAHP, el primer compuesto aromático (Figura 1). Los genes aroD y aroE también se incluyeron para promover una conversión eficiente de DHQ a SA. Además, este plásmido lleva el gen zwf, codificando la primera enzima del PPP (Figura 1). La decisión de incluir este gen se basó en las siguientes observaciones: 1) la sobreexpresión de zwf recuperó sustancialmente la pérdida de tasa de crecimiento debido a la carga metabólica de plásmidos en la cepa JM101 que crece con glucosa como única fuente de carbono ; 2) se ha informado que la cepa PB12 muestra una partición de flujo particularmente baja en carbono en el nodo de glucosa 6-fosfato (G6P) hacia el PPP (5% de la G6P consumida en comparación con 22% en la cepa parental JM101) . Por lo tanto, una sobreexpresión de este gen debería aumentar la disponibilidad de NADPH, requerida en cantidades catalíticas por la enzima shikimato deshidrogenasa (AroE), y puede aliviar las afectaciones potenciales de crecimiento al redirigir más G6P hacia la biosíntesis de nucleótidos y aminoácidos en cepas derivadas de PB12 . Sin embargo, los experimentos presentados en este informe no tenían como objetivo diseccionar el efecto específico de ningún gen utilizado, sino caracterizar las consecuencias de expresarlos todos como un operón.

Con el fin de promover una traducción eficiente de cada gen, cada secuencia de codificación se amplificó utilizando cebadores designados que introdujeron una secuencia de consenso Shine-Dalgarno ubicada a 8 pb aguas arriba del sitio de inicio de la traducción. La secuencia de nucleótidos del operón construido se presenta en el archivo adicional 1.

Evaluación de los efectos causados por la inactivación de pykF en cepas que expresan el operón Aro6

Para evaluar los efectos causados por la inactivación de pykF en la producción de SA, se comparó el rendimiento de las cepas de producción AR26 (pykF+) y AR36 (pykF-) utilizando frascos de agitación que contenían 15 g/L de Glc y 5 g/L de YE. Como control, también se incluyeron las mismas cepas que contenían un plásmido pTrc327par vacío (sin el operón Aro6), AR2e y AR3e.

A pesar de que el SA se acumuló en todos los casos, como se esperaba para los mutantes en aroK y aroL, las cepas que contenían pTrcAro6 alcanzaron concentraciones de SA más altas que las que tenían un plásmido vacío (Figura 3b). Por otra parte, el SA título fue casi dos veces mayor en AR36 que en AR26 (6.1 g/L vs 3,3 g/L). Se observó una disminución en el consumo de Glc en la cepa AR26 después de aproximadamente 18 h de cultivo, correlacionándose con una alta concentración de acetato y una detención en la producción de SA. Por el contrario, la cepa AR36 mostró un consumo constante de Glc y se produjeron cantidades insignificantes de acetato (Figura 3c, 3d). Estos resultados demuestran que los genes presentes en el operón artificial son funcionales y promueven la producción de SA desde el inicio del cultivo. Su expresión constitutiva disminuyó la tasa de crecimiento específico (μ) en un 25% en el fondo pykF+, y la aumentó marginalmente en la variante pykF, pero no causó cambios significativos en la biomasa máxima producida (Xmax) en comparación con las cepas con un plásmido vacío (Figura 3a). Sorprendentemente, en las cepas que expresan operones bajo estas condiciones de crecimiento, la inactivación del gen pykF aumentó la producción de SA, eliminó la acumulación de acetato y permitió el consumo constante de Glc.

Comportamiento de las cepas AR26, AR36 y sus derivados plásmidos vacíos, AR2e ( pykF+) y AR3e ( pykF -), utilizando frascos de agitación que contengan 15 g/L de Glc y 5 g/L de YE (a,b,c,d), y fermentadores de 1 L que contengan 100 g/L de Glc y 15 g/L de YE (e). a) Crecimiento; b) producción de SA; c) consumo de Glc; d) producción de acetato; e) consumo de Glc y producción de SA de AR26 y AR36 en fermentadores. Las barras de error representan la desviación estándar.

Para determinar si la mayor producción de acetato y la menor producción de SA en AR26 en comparación con AR36 es una consecuencia de la disponibilidad inherentemente baja de oxígeno y la acidificación del medio en cultivos de matraz de agitación, ambas cepas se cultivaron en fermentadores de lote de 1 L bajo condiciones controladas de pH y tensión de oxígeno disuelto (DOT). Como enfoque para aumentar el título de SA, la concentración inicial de Glc en estos experimentos se elevó a 100 g/L, y la concentración de YE se aumentó concomitantemente a 15 g / L para permitir una mayor generación de biomasa.

En estas condiciones, la cepa AR36 produjo 42 g/L de SA en 60 h, consumiendo todo el Glc y acumulando 12 g / L de acetato. En cambio, después de 47 h, la cepa AR26 produjo un máximo de 13 g/L de SA, no agotó el Glc y acumuló 29 g/L de acetato (Figura 3e y Tabla 2). Independientemente de las condiciones controladas en los fermentadores, donde el pH se mantuvo en 7 y el PUNTO fue superior al 20% en todo momento, los perfiles de producción de ambas cepas se asemejaron al comportamiento observado en los frascos de agitación, con AR26 produciendo más acetato y menos SA. Incluso cuando la tasa de consumo volumétrico global de Glc (Qsglobal), μ y Xmax alcanzada por ambas cepas fue similar, la productividad, el rendimiento y el título fueron más del doble en AR36 que en AR26 (Figura 3e y Tabla 2).

Es notable que tan grandes diferencias en la producción de acetato y SA se observaron al interrumpir solo un gen, lo que demuestra las ventajas de la inactivación combinada de PTS y pykF cuando se usa un sistema de expresión constitutiva en una cepa de E. coli evolucionada. Para tener en cuenta las mejoras observadas en la producción de SA, sugerimos que la expresión temprana y constante de enzimas codificadas en el operón podría mantener un consumo constante de intermedios glicolíticos en todos los cultivos, evitando altas fluctuaciones en sus concentraciones intracelulares. Planteamos la hipótesis de que la combinación de este estado metabólico estable con un flujo reducido de PEP a piruvato causado por la inactivación del gen pykF puede aumentar la disponibilidad de PEP y otros precursores glucolíticos para la producción de SA sin disminuir la tasa de consumo de Glc. Sin embargo, reconocemos que en ausencia de concentraciones medidas de metabolitos intracelulares, estas observaciones son especulativas.

Perfiles de fermentación de AR36 en cultivos por lotes

Teniendo en cuenta los resultados anteriores, se seleccionó AR36 para una mayor caracterización de su rendimiento cinético y estequiométrico en fermentadores de 1 L. Para lograr este propósito, se probó la producción de SA con tres condiciones de cultivo de alto sustrato diferentes. Se midieron el crecimiento, el Glc y los subproductos para cada caso, lo que a su vez permitió comparar las productividades y los rendimientos.

En primer lugar, se utilizaron 50 g/L de Glc y 15 g/L de YE (Figura 4a). El crecimiento se produjo durante las primeras 10 h, generando 6,3 g / L de peso celular seco con un μ de 0,53 h-1. Bajo esta condición, se produjeron 24 g/L de SA en 32 h. El consumo de Glc y la producción de SA ocurrieron desde el inicio de la fermentación y duraron hasta el agotamiento de Glc, aunque la tasa de consumo de Glc específica (qs) y la productividad de SA específica (qp) fueron mayores en fase exponencial (Tabla 3). El rendimiento resultante de SA en Glc (YSA/Glc) fue de 0,47 mol/mol y la productividad volumétrica global de SA (Qpglobal) fue de 0.74 aSG / L * h (Cuadro 3). Con respecto a la acumulación de subproductos en la vía SA, concentraciones de 2,4 g/L de DAHP, 2,1 g/L de DHS, 1,4 g/L de QA, 0,4 g/L de GA y 0,3 g/L de DHQ estaban presentes en el sobrenadante al final de la fermentación (Figura 5a). En estas condiciones, prácticamente no se produjo acetato durante el curso de la fermentación, alcanzando una concentración máxima de 1,5 g/L después de 32 h (Figura 4a).

Perfil de fermentación de la cepa AR36 cultivada en biorreactores de 1 L con tres concentraciones de sustrato diferentes. a) 50 g/L de Glc y 15 g/L de VOSOTROS; b) 100 g/L de Glc y 15 g/L de VOSOTROS; c) 100 g/L de Glc y 30 g/L de VOSOTROS. Glc: círculos; SA: cuadrados; acetato: triángulos abiertos; concentración de biomasa: triángulos invertidos. Las barras de error representan la desviación estándar.

Subproductos aromáticos de la vía SA detectados en cultivos fermentadores de 1 L de la cepa AR36 utilizando tres concentraciones de sustrato diferentes. a) 50 g/L de Glc y 15 g/L de VOSOTROS; b) 100 g/L de Glc y 15 g/L de VOSOTROS; c) 100 g/L de Glc y 30 g/L de VOSOTROS. Diamante: DAHP (3-desoxi-D-arabinoheptulosonato 7-fosfato); cuadrados: DHQ (ácido 3-deshidroquínico); círculos: DHS (ácido 3-deshidroshikímico); triángulos: QA (ácido quínico); triángulos invertidos: GA (ácido gálico). Las barras de error representan la desviación estándar.

Teniendo en cuenta que 50 g/L de Glc se consumieron completamente, se inició un segundo experimento por lotes con 100 g/L de Glc y 15 g/L de YE. Como se indicó en la comparación con el AR26 en la sección anterior, el AR36 cultivado en estas condiciones produjo aproximadamente 42 g / L de SA en 60 h (Figura 4b). En este caso, después de consumir aproximadamente 100 g/L de glucosa y alcanzar la concentración máxima de SA, la cepa produjo 12 g / L de acetato. Los valores obtenidos para YSA/Glc, Qpglobal, Qsglobal, Xmax y μ, fueron similares a los obtenidos con 50 g/L de Glc y 15 g/L de YE (Tabla 3). Estos experimentos muestran que cuando se usa la misma concentración de YE, el doble de la cantidad de Glc se consume en casi el doble del tiempo, lo que indica que la tasa promedio de consumo de glucosa se mantiene entre ambas condiciones de cultivo. Concentraciones de 4,8 g/L de DAHP, 2,8 g/L de DHS, 3,4 g/L de QA, 0.7 g/L de GA y 0,9 g / L de DHQ estaban presentes en el sobrenadante después de 60 h (Figura 5b). Curiosamente, al duplicar la concentración de Glc, los productos intermedios de la vía AAA aumentaron de manera bastante proporcional con el SA, lo que indica que el consumo de 100 g/L de Glc aparentemente no generó nuevos cuellos de botella de flujo de carbono. Como resultado, la cantidad de SA formada con respecto al total de compuestos aromáticos producidos fue cercana al 80% en ambos experimentos (Figura 6).

Porcentaje molar de cada compuesto aromático producido en la cepa AR36 con respecto al total en cultivos por lotes a partir de: a) 50 g/L de Glc y 15 g/L de YE; b) 100 g/L de Glc y 15 g/L de YE; c) 100 g/L de Glc y 30 g/L de YE. Los rendimientos calculados y las relaciones molares de los compuestos aromáticos producidos se muestran debajo de cada barra. Las comparaciones se hicieron con las concentraciones medidas en el sobrenadante al final de las fermentaciones. YSA / Glc = rendimiento de SA a partir de Glc; YTAC / Glc = rendimiento de compuestos aromáticos totales a partir de Glc; Ymax = rendimiento teórico máximo de compuestos aromáticos.

El efecto del aumento de la YE en la productividad de la SA se investigó con un tercer grupo de experimentos, utilizando 100 g/L de Glc y 30 g/L de YE. Aunque la biomasa se duplicó al utilizar el doble de la concentración de YE, el título SA, μ e YSA / Glc fueron muy similares a los obtenidos en el cultivo con 100 g/L de Glc y 15 g/L de YE (Figura 4b y Figura 4c). En conjunción con los datos obtenidos de las otras dos condiciones, estos hallazgos sugieren que la cantidad de EE determina principalmente la biomasa máxima que se puede lograr. Además, un incremento en la concentración inicial de YE no alteró el título de SA, y apoya la observación de que la SA se produce principalmente a partir de glucosa. La relación directa entre la concentración inicial de EE y la biomasa máxima generada, independientemente de la concentración inicial de Glc probada en estas condiciones de crecimiento, sugiere que uno o más nutrientes limitantes están siendo suministrados por el EE.UU. También parecería que tales nutrientes no se pueden sintetizar a partir de Glc, por lo tanto, su agotamiento del YE limita el crecimiento mucho antes de que se agote el Glc. Se espera que los aminoácidos aromáticos y las vitaminas presentes en el EE que se necesitan para contrarrestar la auxotrofia de AR36 se vuelvan limitantes; sin embargo, otros compuestos en este medio complejo también pueden desempeñar un papel en la limitación del crecimiento con el tiempo.

Para una concentración inicial de 30 g/L, se consumieron y produjeron un total de 106 g/L de Glc y 43 g/L de SA, respectivamente, en aproximadamente la mitad del tiempo que la fermentación con 15 g/L de YE. Con 30 g/L de YE, el Qsglobal y el Qpglobal aumentaron dos veces, en comparación con las fermentaciones con 15 g / L de YE, a pesar de que el título de SA permaneció sin cambios (Tabla 3). Dado que la biomasa también se duplicó, el qp y el qs calculados fueron similares entre los tres experimentos, tanto en fases exponenciales como estacionarias, exhibiendo la robustez metabólica de la cepa diseñada en las condiciones probadas.

Además, los resultados mostraron que un aumento de la concentración de YE no aumentaba considerablemente la concentración de intermedios de la vía SA (Figura 5c). A este respecto, se ha reconocido que la presencia de grandes cantidades de productos intermedios de la vía puede afectar negativamente a la recuperación de SA del caldo de fermentación . Esta preocupación ha dirigido algunos esfuerzos en el tema, lo que lleva a la prueba de las condiciones de cultivo, los antecedentes genéticos y el uso de análogos de glucosa no metabolizables, como intentos de minimizar la generación de subproductos .

En estos experimentos, se detectó una alta proporción de SA en relación con los subproductos sin aplicar ninguna modificación adicional a la cepa o proceso. La concentración de cada intermedio de la vía se comparó con la suma de todos los intermedios aromáticos, y sus porcentajes se utilizaron para calcular la relación molar de SA a cada subproducto al final de las fermentaciones (Figura 6). La proporción de SA resultó ser superior a 10 para DHS, QA o DAHP, y superior a 40 para GA o DHQ para todas las concentraciones de sustrato probadas. Sorprendentemente, en todas las condiciones los rendimientos de SA obtenidos fueron cercanos al 50% del máximo teórico y los rendimientos de los compuestos aromáticos totales (TAC) fueron superiores al 60% del máximo teórico, estimado en 0.86 molTAC/molGlc (ver Métodos y Figura 6). Esto refleja la redirección eficiente de la glucosa hacia la vía AAA en la cepa AR36, incluso cuando se utilizan cultivos de lotes con alto contenido de glucosa. La relación de SA a subproductos, así como los rendimientos de SA y TAC obtenidos son bastante constantes para todas las condiciones evaluadas, y representan, según nuestro conocimiento, los valores más altos reportados para un proceso de fermentación de producción de SA. Estas mejoras pueden justificarse teniendo en cuenta que la plataforma presente en la cepa de ingeniería permite una expresión más homogénea de las enzimas necesarias sobre un fondo genético eficiente. Esto, en contraste con otros sistemas de expresión donde los genes requeridos se expresan a partir de plásmidos separados, bajo diferentes promotores o en cepas no optimizadas para el uso eficiente de altos niveles de Glc. Además de las ventajas relativas a la dinámica de la expresión génica, el hecho de que el IPTG no sea necesario para inducir el operón Aro6 representa un importante beneficio económico para el proceso de producción, ya que el alto precio del IPTG restringe su uso en fermentaciones a gran escala.

Conocimiento de los metabolismos glucolíticos y de acetato de la cepa AR36 por RT-qPCR

Para obtener una comprensión más profunda de los cambios metabólicos inducidos por la expresión constitutiva del operón sintético Aro6 en la cepa AR36, se midieron los niveles de transcripción de varios genes en tres etapas de crecimiento diferentes en cultivos con 50 g/L de Glc y 15 g/L de YE. Como se detalla en los Métodos, los datos obtenidos de la fase exponencial temprana (EE), la fase exponencial tardía (LE) y la fase estacionaria (ST) se normalizaron contra los valores medidos de la cepa AR3e en EE, cultivada en las mismas condiciones de cultivo.

Los resultados indican que la presencia y expresión del operón en la cepa AR36 aumenta los niveles transcripcionales de varios genes que codifican enzimas glicolíticas durante las fases EE y LE (Figura 1 y Figura 7a). El aumento en la expresión de los genes galP y glk es particularmente interesante porque se ha reportado que sus productos controlan la importación y fosforilación de glucosa en PB12, la cepa parental de AR36 . Además, hay un aumento significativo en los niveles transcripcionales de igp y eno, pero no de pykA. Estos cambios pueden traducirse en una mayor disponibilidad de PEP y fructosa 6-P (que se puede convertir directamente en E4P mediante transcetolasa codificada en plásmidos), aumentando el rendimiento de compuestos aromáticos. Teorizamos que la regulación ascendente observada de los genes glucolíticos en la cepa AR36 podría ser una de las consecuencias para los bajos niveles de algunos intermedios glucolíticos (glucosa 6-fosfato, fructosa 6-fosfato y PEP), causados por la expresión fuerte y constitutiva de las enzimas codificadas en operones que consumen estos metabolitos.

Cambios transcripcionales resultantes de la expresión del operón sintético Aro6 en la cepa AR36. Para la comparación, el nivel de transcripción de cada gen se determinó en tres puntos diferentes de la curva de crecimiento de la cepa AR36, cultivada con 50 g/L de Glc y 15 g/L de YE (ver Figura 4a). Todos los datos se normalizaron contra los valores obtenidos de la cepa AR3e en la fase inicial de crecimiento exponencial. a) Genes que codifican enzimas glicolíticas; b) genes implicados en la asimilación de acetato y la biosíntesis; c) genes incluidos en el operón sintético Aro6 (ver Figura 1 y Figura 2). Barras negras: fase exponencial temprana; barras grises: fase exponencial tardía; barras blancas: fase estacionaria. Las barras de error representan la desviación estándar.

Por otro lado, los niveles transcripcionales de genes que codifican enzimas involucradas en la biosíntesis de acetato (poxB, ackA y pta) no se modificaron por la presencia del operón sintético, mientras que actP y acs, que codifican enzimas involucradas en la asimilación de acetato, se regularon fuertemente en las fases EE y LE (Figura 7b). La regulación ascendente de los genes actP y acs también se ha detectado en la fase de crecimiento exponencial en la cepa parental PB12 que es capaz de co-utilizar Glc y acetato en un medio mínimo . Estos hallazgos se correlacionan con los bajos niveles de acetato en la condición de crecimiento analizada (Figura 4a). Es importante destacar que los valores transcripcionales de estos genes implicados en la asimilación de acetato fueron bajos en la fase ST (Figura 7b). Si esta respuesta es representativa de las otras condiciones de crecimiento utilizadas, podría explicar parcialmente la acumulación de acetato observada en fermentaciones con 100 g/L de Glc, que consumen mayores cantidades de Glc durante la fase estacionaria (Figura 4b y Figura 4c). Estos resultados destacan actP y acs como potenciales blancos genéticos para aumentar artificialmente su expresión en etapas de cultivo tardías, aprovechando las capacidades esperadas de la cepa AR36 para utilizar simultáneamente Glc y acetato, presentes en su cepa parental PB12 .

Los genes presentes en el operón sintético mostraron niveles de expresión muy fuertes (incluso en fase estacionaria), reflejando la naturaleza constitutiva del promotor y el alto número de copias del plásmido (Figura 7c). Estos resultados se correlacionan con el consumo ininterrumpido de Glc y la producción de SA observados durante toda la fermentación (Figura 4a), lo que sugiere que las enzimas codificadas por los genes en el operón están presentes durante todo el tiempo de cultivo. Se puede ver en la Figura 7c que los niveles de transcripción de aroD y zwf son comparativamente más altos y más bajos, respectivamente, que los otros cuatro genes en el operón. Esta observación debe tomarse con precaución porque los seis genes en el operón se están comparando con los presentes en el cromosoma de la cepa de referencia AR3e. Dado que los valores obtenidos para los seis genes no están normalizados entre ellos, las variaciones entre su expresión cromosómica en la cepa AR3e pueden alterar las comparaciones relativas con la cepa AR36. Sin embargo, los datos transcriptómicos son consistentes con la alta relación de SA a intermedios aromáticos obtenida en las condiciones probadas, que es de esperar si todos los genes en el operón se expresaran adecuadamente. Junto con los datos cinéticos y estequiométricos, estos resultados destacan los beneficios de emplear un operón sintético expresado constitutivamente como una estrategia alternativa para aumentar el rendimiento de SA de Glc en una cepa evolucionada que carece de PTS y pykF.