La isomerasa cis–trans de ácidos grasos insaturados en Pseudomonas y Vibrio: bioquímica, biología molecular y función fisiológica de un mecanismo único de adaptación al estrés

Resumen

La isomerización de ácidos grasos insaturados cis a trans es un mecanismo que permite a las bacterias gramnegativas pertenecientes a los géneros Pseudomonas y Vibrio adaptarse a varias formas de estrés ambiental. La extensión de la isomerización se correlaciona aparentemente con los efectos de fluidez causados, es decir, por un aumento de la temperatura o la acumulación de compuestos orgánicos tóxicos para la membrana. Los ácidos grasos trans se generan por isomerización directa de la configuración cis respectiva del doble enlace sin un cambio de posición. La conversión de ácidos grasos insaturados cis a trans es aparentemente instrumental en la adaptación de la fluidez de la membrana a los parámetros químicos o físicos cambiantes del entorno celular. Este mecanismo de adaptación parece ser una forma alternativa de regular la fluidez de la membrana cuando se inhibe el crecimiento, por ejemplo, por altas concentraciones de sustancias tóxicas. La actividad de la isomerasa cis-trans (Itc)está constitutivamente presente y se encuentra en el periplasma, no requiere ATP ni ningún otro cofactor como NAD(P) H o glutatión, y opera en ausencia de síntesis de novo de lípidos. Su independencia del ATP está de acuerdo con la energía libre negativa de la reacción. cti codifica un polipéptido con una secuencia de señal hidrofóbica N-terminal, que se escinde durante o poco después de que la enzima se transporta a través de la membrana citoplasmática al espacio periplasmático. Se identificó un sitio de unión heme funcional del tipo citocromo c en el polipéptido de Itc predicho y, muy recientemente, se obtuvieron pruebas directas de que la isomerización no incluye una saturación transitoria del doble enlace.

1 Introducción-historia

En todas las células vivas, el estrés debido a cambios rigurosos en el medio ambiente afecta a las membranas. Como resultado, se produce una alteración de la integridad de la membrana y, por lo tanto, la función como barrera, como matriz para enzimas y como transductor de energía se ve comprometida . Si no se toman contramedidas, puede ocurrir inhibición del crecimiento o incluso muerte celular. La principal respuesta adaptativa de las células es mantener la fluidez de sus membranas en un valor constante, independientemente de las condiciones ambientales reales. Esta estabilización de la fluidez de la membrana, conocida como “adaptación homeoviscosa”, se produce por cambios en la composición de ácidos grasos de los lípidos de la membrana, y constituye la respuesta predominante de las bacterias a las sustancias activas de la membrana o a las condiciones ambientales cambiantes . Este mecanismo fundamental fue investigado e informado en la famosa obra de Ingram a finales de los años 70 del siglo pasado . Sin embargo, hasta finales de los años 80, la configuración cis del doble enlace todavía se consideraba la única que ocurría naturalmente en los ácidos grasos bacterianos. La mejora de las técnicas analíticas de corte, especialmente mediante la introducción de columnas capilares en la cromatografía de gases, facilitó una clara diferenciación de ésteres metílicos de ácidos grasos relacionados y se encontró una nueva clase de ácidos grasos, es decir, ácidos grasos insaturados configurados trans, en algunos procariotas . Los primeros informes de isómeros trans de ácidos grasos insaturados fueron para Vibrio y Pseudomonas hace solo 10 años. Se pudo demostrar entonces que los ácidos grasos insaturados trans se sintetizaron in vivo a partir de acetato en Pseudomonas atlántica, aunque, sobre la base de las rutas biosintéticas conocidas de los ácidos grasos insaturados, no había explicación posible de cómo se podían formar tales ácidos grasos.

Poco después se demostró que la conversión de ácidos grasos insaturados cis a trans constituye un nuevo mecanismo de adaptación que permite a las bacterias cambiar la fluidez de su membrana en dos especies, i. e. en la bacteria psicrófila Vibrio sp. cepa ABE-1 en respuesta a un aumento de temperatura y en Pseudomonas putida P8 como adaptación a compuestos orgánicos tóxicos, como fenoles .

Nuestro minireview resume el conocimiento actual y el progreso en cuanto al estado del sujeto, poniendo énfasis en un mecanismo bastante eficiente y elegante que permite a las bacterias adaptarse a los cambios ambientales que afectan la fluidez de la membrana.

2 Fisiología y función de la isomerasa cis–trans (Itc) de ácidos grasos insaturados

Ambos, en Vibrio sp. cepa ABE-1 y en P. putida P8, se observa un claro aumento de la cantidad normalmente baja de ácidos grasos trans insaturados cuando las células se exponen a temperaturas elevadas o concentraciones de fenol tóxico. Las células en crecimiento de P. putida reaccionan al fenol de una manera dependiente de la concentración, es decir, el aumento de trans y la disminución simultánea de los respectivos ácidos grasos insaturados cis se correlacionan con la cantidad de fenol acumulado en la membrana . Tal conversión no depende del crecimiento, ya que también ocurre en células no en crecimiento en las que la relación entre los ácidos grasos saturados e insaturados y la cantidad total de ácidos grasos insaturados no se puede cambiar debido a la falta de biosíntesis de lípidos . Consistentemente, la reacción tiene lugar en células en las que la biosíntesis de ácidos grasos es inhibida por la cerulenina . La conversión Cis-trans tiene una cinética similar a una enzima y alcanza su relación trans a cis final 30 minutos después de la adición de los agentes tóxicos de membrana. Como la tasa de conversión no se ve afectada por el cloranfenicol, se concluyó que el sistema está constitutivamente presente y no requiere biosíntesis de proteínas de novo .

El ácido oleico (C18:1Δ9cis), que normalmente no es sintetizado por P. putida P8, sin embargo, se incorpora a los lípidos de membrana en cultivos suplementados. Después de la adición de una concentración tóxica de 4-clorofenol, el ácido oleico se convirtió en su isómero trans, es decir, ácido elaídico (C18:1Δ9trans). Tal hallazgo evidenció que los ácidos grasos trans se sintetizan por isomerización directa de cis a ácidos grasos insaturados trans sin cambiar la posición del doble enlace . El aumento de los ácidos grasos insaturados trans fue acompañado por la disminución de los respectivos ácidos grasos insaturados cis, mientras que la cantidad total de ambos se mantuvo constante a cualquier concentración de toxinas añadidas . El sistema no requiere ATP ni ningún otro cofactor como NAD(P)H o glutatión. Su independencia de la energía que proporciona ATP está de acuerdo con la energía libre negativa de la reacción cis a trans .

Todos estos datos llevaron a la proposición de que la isomerización cis–trans es una nueva respuesta adaptativa en bacterias que les permite lidiar con aumentos de temperatura o concentraciones tóxicas de compuestos perturbadores de membrana, condiciones que de otra manera influirían en su fluidez de membrana .

El beneficio de la conversión se origina en las diferencias estéricas mostradas por los ácidos grasos insaturados cis y trans. Un alto contenido de ácidos grasos saturados en las membranas permite que las cadenas acil de ácidos grasos formen una interacción hidrofóbica óptima entre sí, lo que finalmente conduce a una membrana rígida y apretada. En general, los ácidos grasos saturados tienen una temperatura de transición o un punto de fusión mucho más altos en comparación con los ácidos grasos insaturados cis. Los fosfolípidos que contienen ácidos grasos saturados 16:0 tienen una temperatura de transición que es aproximadamente 63°C más alta que los que contienen ácidos grasos insaturados cis 16:1 . La temperatura de transición de fase de las membranas aumenta al aumentar la proporción de ácidos grasos saturados a insaturados. El doble enlace de un ácido graso insaturado cis provoca una curva inamovible con un ángulo de 30° en la cadena acilo. En consecuencia, el paquete altamente ordenado de cadenas de acilo en las membranas se altera, lo que a su vez resulta en temperaturas de transición de fase más bajas de dichas membranas . Por lo tanto, los ácidos grasos insaturados en la configuración cis con estructuras estéricas dobladas (es decir, una torcedura en la cadena acilo) dan como resultado una membrana con una fluidez relativamente alta. En marcado contraste, la estructura estérica larga y extendida de la configuración trans carece de la torcedura y es capaz de insertarse en la membrana de manera similar a los ácidos grasos saturados .

Las bacterias se adaptan a un aumento de la fluidez de su membrana aumentando el grado de saturación de sus ácidos grasos fosfolípidos y, en algunos casos, cambiando de cis a trans la configuración de sus ácidos grasos insaturados. . Una desventaja importante de los cambios en el grado de saturación como respuesta al estrés se origina en su estricta dependencia del crecimiento celular y la biosíntesis de ácidos grasos. En consecuencia, las bacterias que utilizan este mecanismo no son capaces de realizar modificaciones post-biosintéticas de su fluidez de membrana. De hecho, se ha observado que los disolventes causan un cambio en la proporción de ácidos grasos saturados a insaturados solo hasta concentraciones que inhiben completamente el crecimiento. En presencia de concentraciones más altas, es decir, tóxicas, las células no pueden reaccionar y, por lo tanto, no son capaces de adaptarse a tales condiciones o incluso mueren . La isomerización de ácidos grasos insaturados cis a trans se encuentra hasta ahora solo en cepas de los géneros Pseudomonas, incluidos los principales representantes P. putida y P. aeruginosa, y Vibrio representan una solución al problema de la dependencia del crecimiento, ya que también funciona en células no en crecimiento. Aunque el cambio del doble enlace insaturado cis al trans no tiene el mismo efecto decreciente en la fluidez de la membrana que una conversión a ácidos grasos saturados, todavía causa un efecto sustancial en la rigidez de la membrana .

Después de las primeras observaciones basadas principalmente en compuestos fenólicos, se probó una serie de disolventes orgánicos para determinar su capacidad de activar la Itc, cualitativa y cuantitativamente. En consecuencia, el grado de isomerización aparentemente se correlaciona con la toxicidad y la concentración de compuestos orgánicos en la membrana . La acción antimicrobiana de un disolvente se correlaciona con su hidrofobicidad de una manera expresada por el logaritmo del coeficiente de reparto del compuesto en una mezcla de n-octanol y agua (logPow) . Los disolventes orgánicos con un logPow entre 1 y 5 son altamente tóxicos para los microorganismos porque se dividen preferentemente en membranas, donde causan un aumento en la fluidez de la membrana, lo que finalmente conduce a la permeabilización inespecífica . La relación entre el valor LogP de un compuesto y su toxicidad se muestra en la Tabla 1, en la que se enumeran 11 compuestos investigados de acuerdo con sus valores de LogP crecientes. En la Fig. 1 los valores de LogP se representan en comparación con las concentraciones estimadas medidas que causan una inhibición del crecimiento del 50% (EC 50) y, simultáneamente, las concentraciones de los compuestos que causan un aumento medio máximo en la proporción trans/cis (TC 50) de bacterias. Por lo tanto, existe una relación directa entre la toxicidad de los disolventes orgánicos y sus efectos de activación sobre la Itc, sin embargo, esto es completamente independiente de las estructuras químicas de los compuestos.

Desde 1989, cuando se descubrió una cepa de P. putida que creció en un medio que contenía una segunda fase del generalmente altamente tóxico tolueno, estireno o xileno, varios otros P. se han encontrado cepas de putida con propiedades similares, y muchos grupos de investigación han tratado de descubrir los mecanismos subyacentes a la tolerancia a los disolventes. En la mayoría de estas bacterias, el Cti ha estado involucrado en la tolerancia a los disolventes.

No solo se probaron disolventes orgánicos o aumento de temperatura, sino también algunos otros captadores de tensión para determinar su efecto sobre la ITC. En resumen, se demostró que todos los estímulos que afectan a la membrana, como los disolventes orgánicos, el estrés osmótico (causado por NaCl y sacarosa), los metales pesados, el choque térmico y los antibióticos activos en la membrana activan el sistema . Sin embargo, las condiciones de estrés, como el estrés osmótico causado por glicerol, choque frío y pH alto, que se sabe que no son activadores de la captación celular de K+, la primera reacción celular al daño de la membrana que conduce a una mayor permeabilización, no causaron la activación de la Itc . Tales hallazgos indican claramente que la relación cis/trans es presumiblemente parte de un mecanismo general de respuesta al estrés de los microorganismos .

3 Bioquímica y biología molecular de la Itc

Siguiendo la descripción fisiológica de la función general de la Itc en bacterias para adaptarse a diferentes tensiones, se realizaron investigaciones biológicas y bioquímicas moleculares para caracterizar este sistema de respuesta adaptativa único.

Sobre la base de las pruebas de actividad del Itc en compartimentos celulares, se consideró la membrana citoplasmática como la ubicación de la enzima donde también están presentes sus sustratos, los ácidos grasos fosfolípidos. Sorprendentemente, sin embargo, la Ict se purificó a partir de la fracción periplásmica de Pseudomonas oleovorans y Pseudomonas sp. cepa E-3 . La clonación de la enzima permitió su aislamiento como una proteína P8 de P. putida marcada con His, expresada de forma heteróloga en Escherichia coli. La ITC es una proteína neutra de 87 kDa y se ha demostrado que está transcrita monocrónicamente y expresada constitutivamente. La secuencia de nucleótidos del gen cti de P. putida P8, P. putida DOT-T1E y P. oleovorans Gpo12 finalmente hizo evidente que la isomerasa posee una secuencia de señal hidrofóbica N-terminal, que se escinde después de dirigir la enzima al espacio periplasmático.

Se ha construido un mutante knockout cti de P. putida DOT-T1E que es incapaz de isomerizar ácidos grasos insaturados cis. Este mutante tiene una tasa de supervivencia cuando se sorprende con 0.08% (vol/vol) de tolueno más bajo que la cepa silvestre, y también muestra una fase de retraso más larga que la cepa parental cuando se cultiva con tolueno suministrado en la fase gaseosa , resultados que implican claramente Cti en la respuesta de tolueno en esta cepa. Sin embargo, es poco probable que la isomerización cis–trans sea el único mecanismo de adaptación necesario a los disolventes orgánicos, ya que se conocen cepas que pueden realizar la isomerización y siguen siendo sensibles a los disolventes .

Holtwick et al. proporcionó evidencia de que la enzima es una proteína de tipo citocromo c, ya que podrían encontrar un sitio de unión al hemo en el polipéptido Cti predicho. Para un preparado enzimático de Pseudomonas sp. la cepa E-3, que es presumiblemente homóloga al producto del gen cti de P. putida P8, se sugirió que el hierro (probablemente Fe3+) juega un papel crucial en la reacción catalítica . Se encontró que la isomerización Cis-trans es independiente de la cardiolipina sintasa, una enzima que facilita la adaptación a largo plazo de la membrana al aumentar la síntesis de cardiolipina .

Muy recientemente, se dilucidó el mecanismo molecular de la reacción de isomerización. En experimentos de suplementación con ácido oleico de doble deuterado se demostró que el ácido oleico se convertía exclusivamente en ácido elaídico de doble deuterado después de la activación de la Itc. Se debe excluir una saturación transitoria del doble enlace durante la isomerización, así como una reacción de hidratación y deshidratación acoplada . Por lo tanto, se propone un mecanismo enzimático: se forma un complejo enzima–sustrato en el que el hierro electrofílico (probablemente Fe3+), proporcionado por el dominio heme presente en la enzima, elimina un electrón del doble enlace cis, transfiriendo el enlace sp2 a un sp3. El doble enlace se reconstituye después de la rotación a la configuración trans. Un esquema de este mecanismo enzimático propuesto se presenta en la Fig. 2. Tal mecanismo está de acuerdo con los experimentos de mutagénesis dirigidos al sitio llevados a cabo para destruir el motivo de unión al hemo en la Ict de P. putida P8 . Estas mutaciones resultan en la pérdida de la función de la enzima y, por lo tanto, proporcionan evidencia de la presencia de citocromo c y hemo en el centro catalítico de la enzima. Dado que la reacción de la enzima no depende de un cofactor, la actividad de la ITC difiere de todas las demás enzimas que contienen hemo conocidas que actúan sobre los ácidos grasos como sustratos. Sin embargo, no hay necesidad de un cofactor porque no se consume energía neta de electrones.

Otra indicación de su singularidad proviene de las búsquedas de similitud: el Cti no mostró similitudes significativas con los péptidos homólogos cuando se comparó la secuencia de aminoácidos predicha con otras proteínas. Sin embargo, no es sorprendente que la comparación de las secuencias de aminoácidos de las siete proteínas Cti conocidas hasta el presente las identificara a todas como polipéptidos que contienen hemo del tipo c del citocromo . Independientemente del taxón, un grupo hemo del tipo citocromo c está presente como un motivo altamente conservado y como un dominio funcional en todas las enzimas en comparación , en particular, el sitio de unión al hemo en las proteínas c del citocromo se encuentra entre los grupos hemo-vinílicos y las dos cisteínas que se encuentran en el motivo de unión al hemo conservado CXXCH.

En todas las secuencias de Itc de las seis cepas de Pseudomonas investigadas hasta el momento, está presente una secuencia de señal N-terminal, indicativa de la localización periplásmica de la Itc. Tal localización ya ha sido probada para P. oleovorans y P. putida DOT-T1E . Sin embargo, una característica de péptido señal para la secreción dependiente de Sec no está presente en la proteína Cti de V. cholerae. Múltiples alineaciones de secuencia de las siete proteínas Cti conocidas revelaron que las proteínas de las cepas de Pseudomonas y Vibrio forman un árbol filogenético compuesto de tres ramas principales, lo que sugiere un ancestro común de la enzima. Curiosamente, el polipéptido predicho de V. cholerae obviamente no constituye un grupo separado, sino que emana del diverso grupo de proteínas de P. aeruginosa y P. sp. E-3 . Muy recientemente, estudios de alineación revelaron que los genes familiares a la itc también podrían estar presentes en los genomas de bacterias pertenecientes a los géneros Methylococcus y Nitrosomonas. También se sabe que estos organismos contienen ácidos grasos insaturados trans . Sin embargo, todavía falta evidencia fisiológica o bioquímica directa de la presencia de Cti en estas bacterias.

4 Regulación de la Itc

Una de las principales preguntas abiertas con respecto a la Itc de los ácidos grasos insaturados es cómo se regula la actividad de esta enzima periplásmica expresada constitutivamente. Una posibilidad sería un modelo complejo en el que los sustratos de la enzima, los ácidos grasos insaturados cis, se desprenden de la fase periplásmica de los fosfolípidos de membrana. El ácido graso insaturado libre resultante se isomerizaría por acción de Cti y posteriormente se volvería a unir al lisofosfolípido, dando como resultado un fosfolípido que contiene ácidos grasos insaturados trans . Sin embargo , un modelo tan complejo no está de acuerdo con los datos que confirman la actividad de la ITC en las células en reposo y en ausencia completa de fuentes de energía, ya que, al menos, la reincorporación de los ácidos grasos modificados a la membrana necesitaría energía.

La regulación de la actividad enzimática puede, sin embargo, lograrse simplemente dando al centro activo de la enzima la capacidad de alcanzar su sustrato, el doble enlace, que a su vez depende del estado de fluidez de la membrana. En consecuencia, la regio-especificidad observada de la enzima refleja la penetración del sitio activo de la isomerasa a una profundidad específica en la membrana . Las siliconas de la estructura de Cti y su periplásmico ubicación apoyar la presunción de que la enzima sólo puede alcanzar su objetivo, es decir, enlaces dobles de ácidos grasos insaturados que se encuentran a cierta profundidad de la membrana, cuando la membrana está “abierta” por condiciones ambientales que causan una desintegración de la membrana . Se ha demostrado previamente que una disminución en el orden de la cadena acilo puede resultar en una mayor penetración y translocación de proteínas en las membranas . Por analogía con ciertas fosfolipasas, es concebible que la Itc muestre una penetración más profunda en la membrana cuando se disminuye el orden de las cadenas aciles y se aumenta el espaciamiento de los grupos de cabezas de fosfolípidos. También es claramente concebible que la disminución del empaquetamiento de las membranas permitiría que los enlaces dobles se acercaran a las superficies de las membranas con mayor frecuencia , lo que en última instancia facilitaría la interacción con la isomerasa . A medida que el empaquetamiento de la cadena acilo aumenta por la isomerización cis a trans de los ácidos grasos insaturados , la penetración de la proteína se contrarresta y, concomitantemente, cis a la isomerización trans inhibida, lo que finalmente resulta en una regulación estricta del empaquetamiento de la cadena acilo sin la participación de mecanismos o vías de señalización indirecta. Después de la eliminación del compuesto activo de membrana, la recuperación de la proporción trans-cis regularmente baja ocurre muy probablemente por la síntesis de novo normal de ácidos grasos all-cis, ya que el proceso inverso (trans a cis) requeriría un aporte de energía.

Este modelo para la regulación de la actividad de la ITC también explica suficientemente la relación a menudo comunicada entre el grado de isomerización cis–trans y la toxicidad causada por una determinada concentración de un factor de estrés ambiental . Como otro resultado de la reacción catalizada por la enzima, se produce una reducción de la fluidez de la membrana y, como la enzima no puede alcanzar su objetivo cuando la fluidez de la membrana ha alcanzado su nivel normal, la enzima se ve forzada a salir de la bicapa .

5 Observaciones finales

Aunque la isomerización cis-trans de ácidos grasos insaturados no se ha comprendido completamente, se hizo evidente que forma parte de un sistema general de respuesta al estrés en las células de Pseudomonas y Vibrio. Otra indicación para la función general de la Itc es también su dependencia a menudo descrita de la inducción / activación de otros mecanismos de respuesta al estrés .

Evidentemente, constituye un mecanismo de adaptación urgente que permite modificaciones rápidas de membranas para hacer frente al estrés ambiental emergente. Una respuesta tan rápida, que actúa en términos de minutos, proporciona tiempo para que otros mecanismos, dependiendo del crecimiento celular, faciliten su papel en la respuesta adaptativa, ya que la reacción inmediata garantiza la supervivencia en diversas condiciones de estrés. En cuanto a la tolerancia a los disolventes, una especie de cascada de mecanismos rápidos (urgentes), a medio y largo plazo, evidentemente, trabajan juntos para lograr una adaptación completa al estrés ambiental. Sin duda, la ITC representa uno de los principales sistemas urgentes que ayudan a las células a resistir el primer choque de tolueno, permitiendo la activación e inducción de mecanismos de adaptación adicionales que finalmente provocan la adaptación completa .

Debido a su fácil función y efectividad y porque funciona sin regulaciones complejas, es sorprendente que tal mecanismo de isomerización cis a trans no esté presente en todas partes en bacterias gramnegativas. Una posible explicación puede provenir de la presencia generalizada de los dos géneros Pseudomonas y Vibrio. Entre las bacterias no especializadas, se sabe que los miembros del género Pseudomonas son microorganismos altamente adaptables, habiendo conquistado todos los nichos de un gran número de ecosistemas que comprenden el suelo, la piel humana y el agua de mar. Los miembros del género Vibrio también conquistaron una amplia gama de ecosistemas, incluyendo suelos y aguas profundas. Para poder colonizar todos estos nichos, deben ser extremadamente flexibles y adaptables a las condiciones ambientales cambiantes. Cti proporciona a las células un mecanismo eficaz para lograr tal adaptabilidad. Esto no es necesario en otras bacterias gramnegativas, como E. coli, que están especializadas en la vida en el tracto gastrointestinal de los mamíferos, donde pueden vivir felizmente sin un mecanismo de adaptación de membrana tan urgente.

Los lípidos de membrana ofrecen una herramienta prometedora como biomarcadores para el análisis de los cambios en la población microbiana. De hecho, Guckert et al. han sugerido utilizar una relación trans / cis mayor de 0.1 (índice normal reportado para la mayoría de las muestras ambientales) como índice de inanición o estrés. Como la medición de perfiles de ácidos grasos se ha convertido en un método rutinario en muchos laboratorios, parece un enfoque prometedor para la evaluación de los efectos tóxicos. Por lo tanto, la determinación del índice trans/cis puede ser una opción valiosa para estudiar el estado de toxicidad de las muestras naturales, especialmente cuando no se pueden realizar pruebas dependientes del crecimiento, por ejemplo, en hábitats naturales. El principal campo de aplicación de este indicador parece ser la medición de la toxicidad y el estrés ambiental durante los procesos de biorremediación in situ en los que los perfiles de ácidos grasos tienen importancia como marcador para las investigaciones ecológicas de la microflora del suelo. Por ejemplo, durante la biorremediación de sitios contaminados, el nivel de ácidos grasos trans insaturados se puede utilizar como marcador para el estrés general y la reducción del estrés para controlar el proceso de biodegradación . La aplicación de la isomerización cis–trans como herramienta de evaluación de la toxicidad general de los compuestos orgánicos ya se ha descrito para los compuestos carbonílicos aromáticos . Otros estudios dirigidos a mejorar el uso de la isomerización de cis a ácidos grasos insaturados trans como indicador de estrés son vitales y, en última instancia, pueden resultar en una técnica aplicable para el monitoreo ambiental.