Matrices de colágeno recombinantes humanas inyectables limitan el remodelado adverso y mejoran la función cardíaca después del infarto de miocardio

Diseño del estudio

Aquí, realizamos un estudio para (i) diseñar hidrogeles de colágeno clínicamente relevantes utilizando colágenos humanos recombinantes tipo I y tipo III; (ii) caracterizar y comparar las propiedades físicas de los materiales rHCI y rHCIII; (iii) evaluar el potencial terapéutico de los materiales para el tratamiento del IM en ratones; y (iv) identificar los mecanismos subyacentes a los efectos terapéuticos observados del tratamiento del rHC. Para los experimentos in vivo, se eligió la ligadura de arteria DA en ratones como modelo animal clínicamente relevante y bien establecido de IM. Para las evaluaciones funcionales, histológicas y moleculares, el número de animales por grupo se redujo al mínimo de tres a quince ratones, como se especifica en las leyendas de las figuras. Los ratones se asignaron aleatoriamente a grupos de tratamiento y todos los análisis se realizaron de forma ciega.

Preparación y caracterización de matrices rHC

Se preparó una solución de colágeno al 1% disolviendo 0,1 g de colágeno liofilizado (rHCI y rHCIII, a partir de fibrógenos) en 10 ml de sulfato de condroitina ddH2O ultra puro (CS; Wako), N-etil-N-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) se añadieron para producir una mezcla final con una relación de masa de 1:4:0.5:0.3 para colágeno:CS:NHS:EDC. Los materiales se prepararon en hielo utilizando un sistema cerrado que permite una mezcla homogénea sin agregar burbujas. Después de una mezcla completa, el pH se ajustó a 7.4 por NaOH (1.0 N). Las matrices sin CS se prepararon de manera similar, pero con PBS agregado para compensar el volumen de CS. Las matrices etiquetadas con Alexa-Fluor ® 594-NHS se prepararon agregando 20 µL de la solución madre de tinte (1 mg/ml en DMSO) a los geles antes de agregar el NaOH (25 nmol de tinte por hidrogel), seguido de 20 pasos de mezcla.

Viscosidad del material

Las mediciones de viscosidad se llevaron a cabo utilizando un reómetro Brookfield R/S plus (Brookfield) a 37 °C. Se utilizó un husillo cónico C25–2/30 para comprimir el material (desplazamiento de 50 µm) en un pedestal de temperatura controlada. La viscosidad se midió con un bloque de rotación de rampa a una velocidad de 1/min unidades preestablecidas a una velocidad de cizallamiento de cinco unidades durante un tiempo de 30 min.

Grado de reticulación

Se llevaron a cabo experimentos de calorimetría de barrido diferencial (DSC) para evaluar el grado de reticulación. Brevemente, se realizaron mediciones en un calorímetro diferencial de barrido Q2000 (Instrumentos TA) en el rango de 8 a 80 °C utilizando una velocidad de barrido de 5 °C min−1. Las matrices de colágeno (5-20 mg) se secaron en superficie con papel de filtro y se sellaron herméticamente con una tapa de aluminio (Tzero; Instrumentos TA) en una bandeja de aluminio para muestras (Tzero; Instrumentos TA). La temperatura de desnaturalización (Td) se midió al inicio del pico endotérmico.

Contenido de agua

El contenido de agua de los materiales se midió pesando el peso húmedo (W0) de la muestra, equilibrado en PBS durante 96 h a 4 °C. El material se secó al vacío a temperatura ambiente durante 96 h para obtener la masa seca (W). A continuación, se calculó el contenido total de agua de los hidrogeles (Peso) de acuerdo con la ecuación:

Degradación

La degradación enzimática se midió utilizando 50-100 mg de hidrogel colocados en 5 ml de colagenasa tipo I (10 U/ml en PBS) a 37 °C. La masa sólida restante se midió durante un período de hasta 24 h. La velocidad de degradación se calcula a partir de la pendiente inicial de las gráficas de masa restante vs.tiempo y se informa como mg/min.

Porosidad del material

Se realizaron mediciones de microscopía electrónica de barrido a baja temperatura (Crio-SEM) a -50 °C utilizando un Tescan (Modelo: Vega II – XMU) equipado con un soporte de muestra de etapa fría, un detector de electrones de retrodispersión (BSE) y un detector de electrones secundario (SE). Se midieron tamaños de poros de al menos 250 individuos de 4 a 6 áreas aleatorias de la muestra utilizando el software ImageJ®. El diámetro de los poros se cuantificó utilizando el eje longitudinal del poro utilizando la herramienta de línea recta. El área de la imagen se ajustó en función de la barra de escala de tamaño obtenida del sistema Tescan Vega II 65.

Experimentos con animales

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Ottawa y se realizaron de acuerdo con la Guía del Instituto Nacional de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

modelo de IM

Se indujo un IM en ratones hembra C57BL/6 de 9 semanas de edad (Charles River; el número de ratones / grupo está en las leyendas de las figuras) y la administración del tratamiento se realizó utilizando un protocolo establecido26,27. Los ratones fueron anestesiados (2% de isoflurano), intubados y el corazón fue expuesto a través de la cuarta toracotomía intercostal. La arteria coronaria descendente anterior izquierda (DA) se ligó justo debajo de su aparición desde la aurícula izquierda. Este procedimiento resulta en un IAM grande que involucra las partes anterolaterales, posteriores y apicales del corazón, lo que se confirmó en el momento de la cirugía por blanqueamiento miocárdico en la región suministrada por la arteria. La buprenorfina de acción corta se administró al menos una hora antes de la cirugía, y la buprenorfina de acción prolongada se administró por vía subcutánea inmediatamente antes de la cirugía para la analgesia perioperatoria. A 1 semana después del IM (valor basal), se asignó al azar a ratones para recibir tratamiento de matrices PBS (control), rHCI o rHCIII, administradas en cinco inyecciones intramiocárdicas equivolumétricas (10 µl en cada sitio, 50 µl en total) a través de una aguja de 27 G mediante un procedimiento de tórax cerrado guiado por ultrasonido. La jeringa se fija en un micromanipulador (VisualSonics) y, antes del procedimiento de inyección, tanto la aguja como la sonda RMV están alineadas a lo largo del eje largo del corazón. A través del campo de visión ecográfico, el micromanipulador se utiliza para colocar la punta de la aguja en el lugar deseado dentro del miocardio para la administración de las inyecciones (ver la Fig. 1 y Vídeo Complementario 1). Los ratones se mataron con anestesia terminal a los 2 o 4 semanas después del tratamiento y se recolectaron corazones para la histología y/o las mediciones de las propiedades mecánicas.

Ecocardiografía

La ecocardiografía transtorácica se realizó en vistas de eje largo utilizando un sistema Vevo770 en modo B con una sonda de microvisualización en tiempo real serie 707B (VisualSonics). La imagen se realizó al inicio antes de la inyección del tratamiento (7 días después del IM) y a los 28 días después de la inyección para determinar la fracción de eyección del ventrículo izquierdo (FEVI), el cambio de área fraccional (FAC), el volumen sistólico final (VSG), el volumen diastólico final (VDE), el volumen ictus y el gasto cardíaco. Nótese que la FEVI, la VTS y la VDE se utilizan como predictores clínicos de IC y supervivencia después de MI44.

Imágenes ex vivo de la matriz marcada con Alexa-Fluor®594

Las matrices rHC marcadas químicamente (25 nmol de tinte por hidrogel) se inyectaron en el corazón de ratón infartado, como se describió anteriormente. Los animales fueron sacrificados a las 2 h, 2 días y 7 días después del tratamiento, y los corazones fueron cosechados y fotografiados ex vivo por IVIS® Spectrum (PerkinElmer) para visualizar la distribución de rHCI y rHCIII dentro de los corazones (λexcitación: 570 nm; λemisión: 640 nm). Para la histología, las secciones de tejido se prepararon en acetona y luego se teñieron con DAPI, seguido de imágenes con un escáner de diapositivas Leica Aperio Versa con un aumento final de ×20 y una pila en Z con ocho pasos a 1,5 µm.

Análisis de deformación

Se realizó ecocardiografía transtorácica en vistas de eje largo utilizando un sistema Vevo3100 en modo B con una sonda de microvisualización en tiempo real serie MX400 (VisualSonics). La imagen se realizó al inicio antes de la inyección del tratamiento (7 días después del IM) y 2 días después de la inyección para determinar la deformación endocárdica longitudinal en el momento del cierre de la válvula aórtica (representando la sístole del extremo). Se analizó la deformación en el segmento 5 (segmento medio anterior), correspondiente al área de la zona fronteriza objetivo para la inyección de tratamiento, utilizando la aplicación Vevostrain del software Vevo LAB 3.1.1 (VisualSonics)41. En la figura complementaria se incluyen ejemplos representativos de las mediciones realizadas. 10 para todos los grupos experimentales más un animal sano (no infectado).

Electrocardiografía

Se obtuvieron electrocardiogramas simultáneamente con ecocardiografía utilizando un sistema Vevo3100 (VisualSonics) al inicio del tratamiento antes de la inyección (7 días después del IM) y 2 días después de la inyección. Se exportaron electrocardiogramas de Vevo LAB 3.1.1. software (VisualSonics). La duración de los intervalos PR, QT y QRS se determinó utilizando el software ImageJ (Tabla Suplementaria 1).

Propiedades mecánicas del miocardio

Los ratones fueron sacrificados con anestesia terminal a los 2 o 28 días del tratamiento, y los corazones fueron cosechados. Se extirparon piezas rectangulares (2,5 × 5 mm) del ventrículo izquierdo que comprendían la cicatriz y la zona fronteriza. Para determinar la elasticidad a la tracción del tejido (módulo de Young), las muestras se sometieron a pruebas mecánicas en un probador universal mecánico Instron (Modelo 3342, Instron) equipado con software de la Serie IX/S, utilizando una velocidad de cruceta de 10 mm min−1.

Histología / Inmunohistoquímica

Se prepararon láminas de secciones de tejido miocárdico a partir de un subconjunto de corazones que no se utilizaron para medir las propiedades mecánicas. A los 28 días de la inyección, los corazones se cosecharon, se perfundieron con PBS, se incrustaron en OCT y se congelaron a presión en nitrógeno líquido. Se cortaron secciones de 10 µm con un criostato. Para evaluar el tamaño de la cicatriz, las secciones de tejido se fijaron en AFP al 4% durante 1 h y se teñieron con el procedimiento de tricrómico de Masson (Sigma). Se utilizaron imágenes tomadas con un microscopio Olympus BX50 utilizando un objetivo de 2 × y ocho secciones por ratón para medir el espesor de pared remoto y determinar el tamaño de la cicatriz utilizando el método de arco de línea media utilizando el software miquant66. Para inmunohistoquímica, las secciones de tejido se fijaron en acetona durante 20 min, se permeabilizaron con Tritón al 0,1% durante 10 min y luego se bloquearon en suero al 10% durante 1 h a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios se aplicaron durante la noche a 4 °C en suero al 10%, y luego se enjuagaron los portaobjetos y se trataron con anticuerpos secundarios durante 1 h a temperatura ambiente, antes de montarse con medio de montaje fluorescente (Dako). Para la detección de vasos sanguíneos y miofibroblastos, PECAM-1 (también conocido como CD31; Santa Cruz 101454, 1:50) y α-SMA (Abcam 5694, 1:200) se utilizaron y detectaron anticuerpos con AF594 anti-rata (Life Technologies A11008, 1:500) y AF488 anti-conejo (Life Technologies A11007, 1: 500), respectivamente. Se detectaron macrófagos M2 mediante anticuerpos anti-CD206 conjugados con AF488 (Biolegend 141710, 1:50). Para la tinción de troponina I cardíaca, se incubaron secciones con aglutinina de germen de trigo marcada con AF488 (ThermoFisher, W11261) durante 1 h a 37 °C, seguida de incubación con anticuerpo primario de troponina I cardíaca de cabra (Abcam ab56357, 1:200) y se detectó con anticuerpo secundario AF594 de burro (Life Technologies A-11058, 1:500). Finalmente, para la tinción de connexina 43, se incubaron secciones con anticuerpos primarios de connexina 43/GJA1 (Abcam ab11370, 1:400) y troponina cardíaca I (Abcam ab188877, 1:200), seguidos de detección con anticuerpos secundarios AF488 anti-conejo (Life Technologies A11007, 1:500) y AF594 anti-cabra de burro (Life Technologies A-11058, 1:500), respectivamente. Se obtuvieron imágenes fluorescentes utilizando un microscopio observador Zeiss Axio con un objetivo ×20 y para las secciones teñidas de connexin 43 se utilizó un escáner de diapositivas Leica Aperio Versa con un objetivo de 20×. Para todas las tinciones de CIH, se analizaron cuatro secciones por ratón y para cada sección se utilizaron 2-4 imágenes dentro de la zona fronteriza, el infarto y las regiones remotas para el análisis. Para la tinción de H& E, las secciones de tejido se fijaron en formalina al 10%. Las secciones se teñieron primero en la solución de hematoxilina No. 2 de gill durante 7 minutos, seguido de diferenciación de alcohol ácido, y luego de eosina al 0,5% durante 7 minutos, seguido de deshidratación (todas las soluciones de Sigma). Las imágenes se tomaron con un microscopio Olympus BX50. La zona fronteriza se designó como el campo de visión directamente adyacente a cada lado de la región del infarto, que comienza cuando el 50% del VI es tejido cicatricial fibrótico (ver la Fig.Suplementaria). 11 para una representación esquemática).

Experimentos con ratones Cx3cr1-EGFP

Para evaluar el reclutamiento de células mononucleares circulantes en el miocardio después del tratamiento con rHC, se compraron ratones B6.129P-Cx3cr1 tm1Litt/J (Cx3cr1-EGFP) en el Laboratorio Jackson. Estos ratones expresan proteínas fluorescentes verdes mejoradas en monocitos, células dendríticas, células NK y microglía cerebral, y son un modelo reportado para el estudio del reclutamiento de células mononucleares al corazón67. A 1 semana después del IM, los ratones recibieron tratamiento de 50 µl de PBS, rHCI o rHCIII, como se describió anteriormente. Los animales fueron sacrificados 2 días después del tratamiento, y la sangre se recogió en tubos de EDTA. Además, los corazones se perfundieron con SBP y se recolectaron el ventrículo derecho y la región apical del ventrículo izquierdo. Los tejidos se enjuagaron con HBSS y se digerieron en 2.4U / ml de dispasa I (Roche) y 1 mg/ml de Colagenasa B (Roche) durante 40 min a 37 °C. Las muestras se lavaron tres veces con PBS, se centrifugaron durante 5 min a 400 g y las células aisladas se prepararon para citometría de flujo (FACS Aria III; Becton Dickinson). Las células fueron etiquetadas con CD11b anti ratón/humano APC (Biolegend 101211), PE anti ratón Ly-6G/6C (Biolegend 108407), PE/Cy5 anti ratón F4/80 (Biolegend 123111), PE/Cy7 anti ratón CD38 (Biolegend 102717) y Alexa Fluor® 700 anti ratón CD206 (Biolegend 141733), siguiendo las diluciones recomendadas por el fabricante (0.25 µg/L por 1 × 106 células para CD11b, Ly-6G/6C, CD38 y CD206, y 1 µg/L por 1 × 106 células para F4 / 80). Véase la Fig. 12 para la estrategia de clasificación/compuerta.

Aislamiento celular y citometría de flujo para subconjuntos de monocitos

Dos días después del tratamiento, se mató a ratones inyectados por inhalación de CO2 seguida de dislocación cervical. Se recolectó sangre de ratones mediante punción cardíaca en una solución EDTA de 50 mm y se lisaron glóbulos rojos con tampón de lisis de glóbulos rojos (GR) de acuerdo con el protocolo del fabricante (Biolegend 420301). Se aislaron células de corazones de ratón recolectados utilizando un tampón de digestión que contenía: DNasa I (50 U/µL; Sigma D5025), colagenasa tipo II (400 U/mL; ThermoFisher 17101015), colagenasa D (0,15 U/mL; Sigma 11088866001) y hialuronidasa (10 U/ml; Sigma H3506). Tras una hora de digestión a 37 °C, las células cardíacas aisladas pasaron a través de un filtro de 70 µm. Finalmente, los bazos de ratón recolectados se trituraron y trituraron a través de un filtro de 70 µm seguido de incubación con tampón de lisis de glóbulos rojos (RBC). Los pellets de células se recogieron por centrifugación a ×400 g durante 5 minutos a 4 °C. Se incubaron células aisladas de todos los tejidos con tinte de viabilidad reparable Zombie Aqua (1: 500, Biolegend 423101) durante 20 minutos a temperatura ambiente. A continuación, los receptores Fc se bloquearon con el reactivo TruStain X (1: 100, Biolegend 103319) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células se incubaron con un cóctel de anticuerpos durante 45 minutos a temperatura ambiente que contenía CD45-APC/Fire 750 (1:160, Biolegend 30-F11), CD11b-PE/Cy7 (1:80, Biolegend M1/70), Ly6G-PerCP/Cy5.5 (1:160, Biolegend 1A8), CD3-PE (1:160, Biolegend 17A2), B220-AF488 (1:50, Biolegend RA3-6B2), F480-AF647 (1:100, Biolegend BM8) y Ly6C-BV421 (1:80, BD Biosciences AL-21). La citometría de flujo se realizó con un BD FACS Aria III, y los datos se analizaron con el software FlowJo V10.5. 2 (ver Fig. Suplementaria. 12 para la estrategia de clasificación/compuerta). El número total de células viables para cada tejido después del aislamiento se determinó mediante exclusión de azul tripano utilizando un hemocitómetro. El número total de células dentro de cada población de leucocitos se determinó utilizando el porcentaje de células vivas para una población celular dada, y el número total de células vivas contadas después del aislamiento, que luego se normalizó a mg de tejido o mL de sangre recolectada. Estrategia de compuerta: Las células individuales se cerraron con base en FSC-A y FSC-H. Las células individuales vivas se cerraron con tinción baja para el tinte Zombie Aqua live/dead. De esta población unicelular viva, los leucocitos fueron CD45+. Los subconjuntos de leucocitos se caracterizaron de la siguiente manera: los neutrófilos CD45+CD11b++ Ly6G, Ly6C bajo los monocitos CD45+CD11b+Ly6G−F480−Ly6C−, Ly6C alta monocitos CD45+CD11b+Ly6G−F480−Ly6C+, macrófagos CD45+CD11b+Ly6G−F480+, T células CD45+CD11b−Ly6G−CD3+B220− y B de células CD45+CD11b−Ly6G−CD3−B220+. Nota para la expresión de sangre F480 no se utilizó en la estrategia de apertura. Las puertas se establecieron en relación con los controles de isotipo.

Los estudios de cardiomiocitos neonatales

Los miocitos ventriculares de rata neonatal (MNR) se aislaron recientemente utilizando un protocolo establecido68. Los ventrículos izquierdos recolectados de ratas Sprague-Dawley de 2 días de edad (Harlan) fueron digeridos por tripsina (Amersham Biosciences) y colagenasa tipo II (bioquímica de Worthington). Las células aisladas fueron resuspendidas en el medio M-199 (Life Technologies) suplementado con 10% de FBS, glucosa de 19,4 mM, l-glutamina de 2 mM, 2 U/ml de penicilina, 0,8 µg/mL de vitamina B12, HEPES de 10 mM y aminoácidos no esenciales de 1 × MEM (Sigma-Aldrich). Se realizaron dos rondas de pre-recubrimiento de 60 min, durante las cuales los fibroblastos cardíacos se adhieren al fondo del plato, enriqueciendo así a la población no adherida para RMN. Las células no adherentes (MNR) se sembraron en las diferentes matrices de colágeno en placas de 24 pocillos (40.000 células/cm2). Para el ensayo de supervivencia, los VRN cultivados de 3 días se sometieron a medios M-199 que contenían peróxido de hidrógeno de 50 µM durante 3 h, después de lo cual se realizó un ensayo de etiquetado de extremo de nick dUTP (TUNEL) de desoxinucleotidil transferasa Terminal y se contaron células muertas en tres campos de visión aleatorios.

Cultivos celulares

Utilizando un protocolo establecido, se aislaron macrófagos derivados de médula ósea de mice69 C57BL/6J de 8-12 semanas de edad. Los ratones fueron sacrificados por inhalación de CO2 y dislocación cervical, y los huesos de la tibia fueron recolectados y lavados con medios para aislar la médula ósea. El aislado de médula ósea se pipeteó repetidamente para obtener una suspensión unicelular, que luego se pasó a través de un colador celular. Las células recién aisladas se cultivaron durante 1 semana en DMEM suplementado con 10% de FBS, 20% de medios acondicionados con L929 y penicilina-estreptomicina, y luego se volvieron a platear en los hidrogeles de rHC durante 3 días. Se recolectaron células de los hidrogeles rHC utilizando solución salina tampón de 3 mm de CaCl2 Hank que contenía 250 unidades de colagenasa I (Gibco). La polarización de macrófagos se evaluó mediante citometría de flujo (FACS Aria III; Becton Dickinson) utilizando CD86 y CD206 (Biolegend) para identificar macrófagos M1 y M2, respectivamente. Para el aislamiento de células mononucleares, se recolectó médula ósea de huesos de tibia como se describió anteriormente. Las células mononucleares se purificaron por centrifugación de gradiente de densidad utilizando Histopaque® (Sigma) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células fueron marcadas con 0.5 µg / ml de DAPI (Sigma) durante 30 min a 37 °C.

Ensayo de adhesión a macrófagos

Se aislaron células mononucleares lavando las tibias y los fémures de ratones de 6 a 12 semanas de edad. Las células se purificaron por centrifugación de gradiente de densidad utilizando Histopaque ® (Sigma) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se contaron células mononucleares y se etiquetaron con DAPI. Las células se platearon en los diferentes biomateriales a una concentración de 50.000 células/cm2 durante 24 h. Las células se fijaron con PFA al 4% durante 5 min y se contaron las células. Los datos se expresaron en relación con el control (pozos no recubiertos, p. ej., TCPS) para minimizar el efecto de la variabilidad celular entre donantes.

Ensayo de migración de macrófagos

Se cultivaron células mononucleares de médula ósea en DMEM suplementado con un 10% de FBS, un medio condicionado con L929 al 20% y Pen/estreptococo durante 7 días para generar macrófagos derivados de la médula ósea (BMDMs) y etiquetados con DAPI, como se describió anteriormente. Los BMDM (2 × 105) se resuspendieron en MBE sin factores de crecimiento y suero, y se cargaron en la cámara superior de una placa Transwell (Life Technologies) recubierta con 100 µL de rHCI o rHCIII. La cámara inferior contenía medios de macrófagos completos como se describió anteriormente. Después de 24 h, se retiraron los insertos y el número de BMDM que migraron a través del biomaterial se cuantificó de manera ciega utilizando un microscopio de fluorescencia Zeiss Z1. Los datos se expresaron en relación con el control (pozos no recubiertos, es decir, TCPS) para minimizar el efecto de la variabilidad celular entre donantes.

Ensayo de polarización de macrófagos

Se generaron BMDM en DMEM suplementado con 10% de FBS, 20% de medio acondicionado L929 y Pen/Estreptococo durante 7 días, como se describió anteriormente. Para experimentos de activación de macrófagos, las células se estimularon durante 3 días con lipopolisacárido (1 µg/ml; Sigma) más IFN-γ (50 ng/ml; Sigma) para la activación M1, o con IL-4 (20 ng/ml; sistemas R&D) para la activación M2. El ARN total se extrajo utilizando el reactivo Tri (Zymo Research), de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ADNc de primera hebra se sintetizó con transcriptasa inversa Smartscribe (Takara Bio USA) y cebadores hexámeros aleatorios (Fisher Scientific). Los niveles de ARNm del gen diana se evaluaron mediante RT-PCR cuantitativa con el LightCycler 480 SYBR Green I Mastermix (Roche) y un Sistema de PCR en Tiempo Real LightCycler 480 (Roche). Las secuencias para los pares de cebadores se enumeran en la Tabla complementaria 2. Los cambios relativos en la expresión del ARNm se determinaron por el método de TC ERS, expresado como niveles relativos a 18 S. Los datos se expresaron en relación con el control (pocillos no recubiertos, es decir, TCPS) para minimizar el efecto de la variabilidad celular entre donantes.

Supervivencia después de la exposición a H2O2

Se cultivaron células durante 7 días en DMEM suplementado con 10% de FBS, 20% de medio acondicionado con L929 y Pen/estreptococo. En el día 7, el medio se cambió a DMEM que contenía peróxido de hidrógeno de 0,5 mm, y las células se cultivaron durante 3 h antes de teñirse con 7-AAD para su análisis por citometría de flujo. Los datos se expresaron en relación con el control (pozos no recubiertos, es decir, TCPS) para minimizar el efecto de la variabilidad celular entre donantes.

Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó utilizando el gráfico Kaleida 4.5®. Todos los datos se presentan como media ± SEM. Para la comparación de datos in vivo entre tratamientos, se utilizó un ANOVA seguido de la corrección de Holm para comparaciones múltiples. El tamaño de la cicatriz se analizó mediante regresión múltiple, incluido el grupo de tratamiento (ICR, ICRII y SBP) y la FEVI basal. La ICD y la ICDII en comparación con el SBP fueron predictores significativos del tamaño del infarto, además de la FEVI basal. El coeficiente de correlación para el modelo es de 0,6 utilizando regresión lineal múltiple STATA. Los datos de MRN, macrófagos y fibroblastos cardíacos in vitro se analizaron mediante una prueba t de Student o mediante un ANOVA unidireccional con corrección Holm para comparaciones múltiples, como se especifica en las leyendas de las figuras.

Resumen de informes

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de Informes de Investigación de la Naturaleza vinculado a este artículo.