Objetivo de anticuerpos de claudin-1 como terapia potencial para el cáncer colorrectal

Muestras de CCR

Para el perfil de expresión génica, seleccionamos 143 muestras de tumores de 143 pacientes incluidos en tres cohortes: el estudio prospectivo de un solo centro REGP (19 pacientes) (GSE62322) , el estudio retrospectivo multicéntrico COSIVAL (68 pacientes) y el estudio prospectivo multicéntrico BIOCOLON (56 pacientes) (GSE62080 y GSE72970) . Para estos tres estudios, los criterios de inclusión fueron: adenocarcinoma de colon probado histológicamente, tumor avanzado y medible bidimensionalmente (estadio IV), edad entre 18 y 75 años y estado funcional ≤2 de la Organización Mundial de la Salud (OMS). Antes de cualquier tratamiento, todos los pacientes se sometieron a cirugía para resección del tumor primario o biopsia endoscópica.

Para el análisis de western blot, se utilizaron 13 muestras tumorales adicionales del estudio prospectivo de un solo centro REGP, pero no incluidas en las 143 muestras.

Para el análisis inmunohistoquímico, se seleccionaron retrospectivamente muestras de tejido de 52 pacientes adicionales con CCR de los archivos de patología del Instituto de Investigación del Cáncer de Montpellier solo cuando se disponía de muestras de mucosa, adenoma y adenocarcinoma normales para el mismo paciente.

Todos los estudios que utilizaron muestras de tejido humano fueron aprobados por los comités de ética pertinentes y todos los participantes fueron informados sobre los objetivos y métodos del estudio y firmaron un consentimiento informado por escrito antes de la inscripción.

Análisis de expresión génica

Muestras de colon (colon normal, tumor primario y metástasis hepática para el estudio REG/P, pero solo muestras de tumor primario para los ensayos COSIVAL y BIOCOLON) se recolectaron en el momento de la cirugía siguiendo un procedimiento estandarizado para obtener ARN de alta calidad . Las muestras se hibridaron con matrices de genoma humano U133 Más 2.0 (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA).

Para identificar nuevas dianas terapéuticas para la terapia basada en anticuerpos en el cCRM, comparamos los perfiles de expresión génica de muestras de tejido de mucosa normal (n = 17), tumor primario (n = 20) y metástasis hepáticas (n = 19).

Como la heterogeneidad del CCR se debe tener en cuenta al comparar perfiles de expresión génica, las muestras de tumores primarios (n = 143) se clasificaron utilizando las clasificaciones moleculares del CCR basadas en perfiles de expresión génica propuestos por tres grupos independientes y la clasificación de consenso reciente . Brevemente, De Sousa E. Melo et al. se propone agrupar tumores en tres clases: CCS1 (CCR con inestabilidad de microsatélites, MSI), CCS2 (cáncer con inestabilidad cromosómica, CIN) y CCS3 (subtipo nuevo) . Sadanandam et al. se identificaron cinco subtipos moleculares, basados en el fenotipo celular: en forma de copa, Amplificante de Tránsito (TA), Enterocito, en forma de tallo e Inflamatorio . Marisa et al. se describieron seis subtipos moleculares (C1 a C6) con las siguientes características principales: C1 = NIC y regulación a la baja de las vías inmunitarias, C2 = MSI, C3 = KRAS mutados, C4 = fenotipo de células madre, C5 = NIC y regulación al alza de las vías WNT, y C6 = NIC y perfil de expresión génica de tipo normal . Finalmente, a partir de seis firmas publicadas previamente, un consorcio internacional presentó una clasificación con cuatro subtipos de consenso: MSI (CMS1), canónico (CMS2), metabólico (CMS3) y mesenquimal (CMS4) (para revisión ). La distribución de la muestra de CCR según el subtipo molecular se muestra en el archivo adicional 1: Tabla S1.

Análisis inmunohistoquímico

Las muestras se ensamblaron en un micro-array de tejidos (TMA) utilizando tres núcleos de tejidos (de 0,6 mm de diámetro cada uno) como se describió anteriormente . Brevemente, secciones de 3 µm de la TMA se desparafinizaron y rehidrataron en alcoholes graduales. La recuperación de antígenos inducida por calor se realizó incubando secciones de MAT en tampón EDTA (pH 9) a 98 °C en baño maría durante 20 min. Después de la neutralización de la actividad de la peroxidasa endógena, se incubaron secciones de MAT con un anticuerpo policlonal anti-CLDN1 (JAY-8, Zymed laboratories Inc, CA, EE.UU.) o un diluyente de anticuerpos (Dako, Glostrup, Dinamarca) solo durante 60 min. La unión de anticuerpos primarios se visualizó utilizando el sistema Envision ® y el Dako Autostainer® (Dako, Glostrup, Dinamarca). Se evaluó el porcentaje de células CLDN1 positivas y la intensidad de tinción (0, sin tinción; 1, amarillento; 2, marrón; y 3, marrón oscuro) para cada punto de MAT individual.

Análisis de Western blot

Las muestras de tejido tumoral de los pacientes se trituraron directamente en tampón de lisis (150 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% SDS, 1% Triton X-100, 0,5% NP-40, 2 mM PMSF, 100 mM NaF, 10 mM ortovanadato de sodio, un comprimido de cóctel inhibidor de la proteasa para 10 ml) utilizando una unidad Mixer Mill® MM 300 (Qiagen, Valencia, CA). La concentración de proteínas se determinó con el ensayo Bradford (Ensayo Pierce Coomassie Plus Protein). Luego, 50 µg de proteínas totales se resolvieron con un 12% de SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Whatman® Protran®, tamaño de poro de 0,45 µm). Los sitios de unión inespecíficos se bloquearon con leche descremada al 5% (peso/vol) en PBS con 0,1% (vol/vol) Tween 20 (PBS-T) a temperatura ambiente durante 1 h y luego se incubaron membranas a 4 °C con un anticuerpo policlonal anti-CLDN1 (JAY-8) durante la noche. Las membranas se lavaron e incubaron con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante apropiado durante 1 h. La revelación se realizó con un sistema de quimioluminiscencia (Amersham Biosciences); la expresión de β-tubulina se utilizó para la normalización.

Extracción de proteínas subcelulares

La extracción de proteínas se llevó a cabo como se describió anteriormente . Para cada muestra, se cortaron secciones de 20 µm de espesor con un criótomo, se mezclaron en nitrógeno líquido y se molieron suavemente con un micro-mortero. Para la extracción de proteínas subcelulares, se utilizó el Kit de Extracción de Proteomas Subcelulares ProteoExtract de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Calbiochem). Las fracciones subcelulares (10 µg/cada una) se cargaron en geles SDS-PAGE al 12%. La inmunoblotación se realizó como se describió anteriormente con los siguientes anticuerpos primarios: anti-CLDN1 (JAY-8), -CD71 (Invitrogen),- Histona H3 (Pierce) y-β-tubulina (Sigma T4026).

Líneas celulares

Se utilizaron las siguientes líneas celulares de CCR humano: SW480 (ATCC CCL-228), SW620 (ATCC CCL-227), Caco-2 (ATCC HTB-37), Difi (regalo de C. Montagut, Departamento de Oncología Médica, Hospital del Mar, Barcelona, España), HCT116 (CCL-247) y LS174T (ATCC CL-188). Para obtener la línea celular SW480 con CLDN1 positivo (SW480-CLDN1), las células SW480 se transfectaron de forma estable con el clon de ADNc CLDN1 humano (colección de MGC de Invitrogen) o con vector vacío (pcDNA) utilizando el reactivo de transfección jetPRIME™ (Polyplus-transfection Inc., Francia). Se seleccionaron clones CLDN1 positivos mediante células transfectadas en crecimiento en presencia de 500 µg/ml de geneticina. Para el silenciamiento de CLDN1, el SW620 se transdució con el vector pSIREN que contenía el shRNA contra CLDN1 (SW620shCLDN1) o contra luciferasa (shLUC, control negativo). Después de 24 h, se seleccionaron células con 1 µg/ml de puromicina y se agruparon clones estables. Todas las transfecciones transitorias se realizaron utilizando el reactivo de transfección jetPRIME™.

Producción de anti-CLDN1 mAb 6 F6

Para la producción de anticuerpos, ratones hembra BALB/c de 6-8 semanas de edad (Harlan, Gannat, Francia) fueron desafiados por inyección intraperitoneal (i.p.) de 4 millones de células de NIH de ratón transfectadas transitoriamente con ADNc CLDN1 (células de NIH-CLDN1) cada dos semanas (cinco inyecciones en total). Las células de NIH-CLDN1 se mezclaron con el adyuvante completo de Freund (Sigma) para la primera inyección, y con el adyuvante incompleto de Freund (Sigma) para las otras cuatro inyecciones. Se administró una inyección intravenosa de refuerzo de células NIH-CLDN1 tres meses después de la quinta inmunización. Tres días después, las células del bazo de ratones inmunizados se fusionaron con la línea celular de mieloma de ratón P3-X63-Ag.8.653 para producir hibridomas de ratón. Los sobrenadantes de clones recién generados se seleccionaron mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) utilizando células SW480-CLDN1 y SW480 (control negativo). Los resultados de los exámenes de detección se confirmaron mediante la realización de exámenes de detección adicionales con células SW620 y SW620-shCLDN1. El clon de hibridoma 6 F6 anti-CLDN1 se seleccionó y clonó mediante dilución limitante. El isotipado de anticuerpos mostró que 6 F6 era un IgG3k.

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices del gobierno francés para estudios experimentales con animales (acuerdo CEEA-LR-12052).

Radiomarcaje e imágenes de SPECT-CT

Se compraron ratones desnudos atímicos femeninos (de 6 a 8 semanas de edad) de Harlan. El 6 F6 mAb se radiomarcó con 125I (Perkin Elmer) a la actividad específica de 370 MBq/mg para la tomografía computarizada por emisión de fotones únicos (SPECT), utilizando el IODO-GEN (Pierce Chemical Co.) método. Después de la inyección en la vena de la cola de 16 MBq/50 µg, se obtuvieron imágenes de tomografía por emisión de fotón único de cuerpo entero/tomografía computarizada (SPECT/CT) con una cámara nanoespect de múltiples orificios de 4 cabezales y multiplexación (Bioscan Inc., Washington, EE.UU.) en varias horas (48, 72 y 96 h). De forma concomitante, se obtuvieron imágenes de micro TC de todo el cuerpo para el registro anatómico conjunto con datos de SPECT. Los datos reconstruidos de SPECT y TC se visualizaron y se registraron conjuntamente con Invivoscope®.

Ensayo clonogénico

Las células de cáncer colorrectal se sembraron en una placa de 6 pocillos (150, 250 o 400 células/pocillo) y se dejaron adherir a 37 °C durante la noche. A continuación, se añadió 1 ml de RPMI con o sin 6 F6 mAb (concentración final: 100 µg/ml) a cada pocillo y se cultivaron células durante seis días. Después de seis días más en medio sin anticuerpos, las placas se leyeron utilizando un citómetro de imagen Celigo™ y la aplicación de” Verificación de una sola colonia”. El citómetro Celigo™ es un sistema de análisis celular in situ de sobremesa que proporciona imágenes de pozos mediante iluminación de campo brillante (Nexcelom Bioscience, MA, EE.UU.).

Establecimiento de cultivos esferoides tridimensionales (3D)

Para la formación de esferoides se utilizaron placas de 96 pocillos de fondo redondo de fijación ultrabaja (Co-Modelo Corning). Las celdas SW480, SW480-CLDN1 o SW620 se sembraron a una densidad de 5 × 104. Células agregadas y fusionadas en esferoides 3D en 24-72 h. Las imágenes de los pozos se tomaron con un microscopio de contraste de fase utilizando un objetivo de 5× o se capturaron con el citómetro de imágenes Celigo™ utilizando la aplicación “Tumorosfera”. La viabilidad celular se evaluó con el Ensayo de Viabilidad Celular Luminiscente CellTiter-Glo (Promega, Madison, WI, EE. UU.). Después de añadir 100 µl de reactivo CellTiter Glo a cada pocillo durante 10 min, se midió la luminiscencia en un lector de microplacas de luminiscencia MicroBeta TriLux 1450 (Perkin Elmer).

El análisis de ciclo celular y proliferación en esferoides

Los esferoides se prepararon mediante el enchapado de 1000 células DiFi por pocillo en placas de 96 pocillos de fijación ultrabaja, y su cultivo en presencia de 100 µg/ml del 6 F6 mAb o MAB irrelevante (retuximab) durante 5 días. Para el análisis del ciclo celular, las células fueron peletizadas, tripsinizadas, lavadas con PBS, fijadas en etanol al 75% y teñidas con yoduro de propidio de 40 µg/ml en presencia de 100 µg ml−1 de RNasa (Qiagen). La distribución del ciclo celular se determinó con un Citómetro de Flujo FC500 Beckman Coulter utilizando el canal FL-3. Las células se cerraron en una gráfica de puntos que mostraba el pico de pulso de ADN frente al área de pulso de ADN para excluir dobletes. Las distribuciones de ciclos celulares se ilustraron utilizando el software de análisis Flow Jo (Treestar, FLOWJO, Ashland, OR, USA).

En el día 4 de cultivo, la proliferación celular se midió incubando células con 5-etinil-2 ‘ – desoxiuridina (EdU) durante 24 h. La EdU se incorpora al ADN durante la síntesis activa de ADN. Luego, después de la tripsinización celular y la fijación/permeabilización en etanol al 75%/PBS, se etiquetó la EdU incorporada y se detectó con el Kit de Prueba de Citometría de Flujo Alexa Fluor 488 de EDU Click-iT (Invitrogen). Las células se incubaron con 1 µg/ml de 4’,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) en PBS/0,1% Triton X100 a 37 °C durante 30 min. La aplicación Celigo™ “Análisis de expresión” (Máscara Target 1+) se utilizó para cuantificar la señal fluorescente y para el análisis de datos. Las células se identificaron utilizando la tinción nuclear DAPI y la síntesis de ADN se cuantificó midiendo la incorporación de EdU.

Modelos de xenoinjertos de ratón

1,5 × 106 células SW620 o 3 × 106 células DiFi se suspendieron en medio de cultivo y se inyectaron subcutáneamente (s. c.) en el flanco derecho de ratones atímicos desnudos de Harlan de 6 a 8 semanas de edad. Cuando el volumen tumoral alcanzó aproximadamente 100 mm3, los ratones se aleatorizaron en diferentes grupos y se trataron con inyección intravenosa de NaCl al 0,9% o 6F6 mAb (15 mg/Kg por inyección) dos veces por semana durante tres semanas consecutivas para el primer experimento y tres veces por semana para el segundo experimento. Los tumores se midieron quincenalmente con un calibrador y los volúmenes se calcularon con la fórmula: D1 x D2 x D3 / 2.

Modelo de colonización hepática intraesplénica

En cada experimento, se inyectaron 2 millones de células SW620 que expresaban luciferasa (células SW620-LUC) en el bazo de ratones desnudos atímicos femeninos de 6 a 8 semanas de edad. Se extirpó el bazo 2 minutos después de la inyección celular. El día 1 después de la inyección, los ratones se dividieron aleatoriamente en dos grupos de 10 ratones que fueron tratados con 15 mg/kg de 6 F6 mAb o NaCl al 0,9% por inyección i.p., tres veces por semana. Para evaluar la formación y diseminación metastásica, se monitorizó la expresión de luciferasa mediante imágenes de luminiscencia después de la inyección de luciferina (Cámara Ivis Lumina II, PerkinElmer®) una vez por semana. En la semana 5 después de la cirugía, se sacrificaron ratones, se extrajeron hígados, se fotografiaron y se contaron metástasis visibles macroscópicamente en la superficie hepática.

Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó utilizando el software STATA 13.0 (StataCorp). Para experimentos de expresión génica o inmunohistoquímica, se analizaron las diferencias entre los grupos utilizando la prueba de Kruskall Wallis/Dunn. Se evaluaron las correlaciones entre la expresión del gen CLDN1 y la supervivencia sin progresión (SSP) y la supervivencia general (SG) en todo el grupo (n = 143 pacientes) y de acuerdo con el subtipo molecular tumoral. Con este fin, los 143 pacientes se dividieron en dos grupos en función de la mediana de la expresión génica de CLDN1 (es decir, 9,75 ). Los valores de SLP y SG se compararon mediante el método de Kaplan-Meier y las diferencias entre las distribuciones de supervivencia se evaluaron mediante la prueba de rango logarítmico.

Se utilizó la prueba t pareada para comparar el efecto de la incubación con el 6 F6 mAb en experimentos in vitro.

En experimentos in vivo, se utilizó un modelo de regresión lineal mixta para determinar la relación entre el crecimiento tumoral y el número de días después de la inyección. La parte fija del modelo incluía variables correspondientes al número de días posteriores al injerto y a los diferentes grupos de tratamiento. Se incorporaron términos de interacción en el modelo; se incluyeron intercepciones aleatorias y pendientes aleatorias para tener en cuenta el efecto temporal. Los coeficientes del modelo se estimaron por máxima verosimilitud. Se calcularon las tasas de supervivencia desde la fecha de la inyección hasta la fecha en que el tumor alcanzó un volumen de 1.500 mm3 utilizando el método de Kaplan–Meier. Las curvas de supervivencia se compararon mediante la prueba de rango logarítmico. Para los experimentos de colonización hepática, las diferencias entre los grupos fueron evaluadas con la prueba U de Mann-Whitney. Para todos los experimentos, las diferencias fueron consideradas significativas cuando P < 0,05.