Obtener CLARIDAD: El proceso de hidrogel crea cerebro transparente
Proceso de claridad: entrevista con el bioingeniero y psiquiatra de Stanford Karl Deisseroth. Longitud: 3:58
“Estudiar sistemas intactos con este tipo de resolución molecular y alcance global, para poder ver el detalle fino y el panorama general al mismo tiempo, ha sido un objetivo importante no cumplido en biología, y un objetivo que la CLARIDAD comienza a abordar”, dijo Deisseroth.
” Esta hazaña de la ingeniería química promete transformar la forma en que estudiamos la anatomía del cerebro y cómo la enfermedad la cambia”, dijo Thomas Insel, MD, director del Instituto Nacional de Salud Mental. “El estudio en profundidad de nuestro órgano tridimensional más importante ya no estará limitado por métodos bidimensionales.”
Cerebro de ratón adulto intacto antes y después del proceso de CLARIDAD de dos días. En la imagen de la derecha, las estructuras finas del cerebro se pueden ver débilmente a medida que las áreas de desenfoque por encima de las palabras “número”, “inexplorado”, “continente” y “se estiran.”
La investigación de este estudio se realizó principalmente en el cerebro de un ratón, pero los investigadores han utilizado CLARITY en peces cebra y en muestras de cerebro humano preservadas con resultados similares, estableciendo un camino para futuros estudios de muestras humanas y otros organismos.
“LA CLARIDAD promete revolucionar nuestra comprensión de cómo los cambios locales y globales en la estructura y actividad cerebral se traducen en comportamiento”, dijo Paul Frankland, PhD, científico senior en neurociencias y salud mental en el Hospital para Niños Enfermos Research Institute en Toronto, que no participó en la investigación. La colega de Frankland, la científica senior Sheena Josselyn, PhD, agregó que el proceso podría convertir el cerebro de “una misteriosa caja negra” en algo esencialmente transparente.
Un lugar inescrutable
El montículo de materia gris enrevesada y cableado que es el cerebro es un lugar complejo e inescrutable. Los neurocientíficos han luchado por comprender completamente sus circuitos en su búsqueda de comprender cómo funciona el cerebro y por qué, a veces, no funciona.
Karl Deisseroth
CLARITY es el resultado de un esfuerzo de investigación en el laboratorio de Deisseroth para extraer los elementos opacos, en particular los lípidos, de un cerebro y, sin embargo, mantener las características importantes intactas. Los lípidos son moléculas grasas que se encuentran en todo el cerebro y el cuerpo. En el cerebro, especialmente, ayudan a formar las membranas celulares y le dan al cerebro gran parte de su estructura. Sin embargo, los lípidos representan un doble desafío para el estudio biológico, ya que hacen que el cerebro sea en gran medida impermeable tanto a los productos químicos como a la luz.
A los neurocientíficos les hubiera gustado extraer los lípidos para revelar la estructura fina del cerebro sin cortarlos o seccionarlos, pero por un problema importante: la eliminación de estas moléculas estructuralmente importantes hace que el tejido restante se desmorone.
Las investigaciones anteriores se han centrado en su lugar en la automatización del enfoque de corte/seccionamiento, o en el tratamiento del cerebro con moléculas orgánicas que facilitan la penetración de la luz solo, pero no sondas macromoleculares. Con CLARIDAD, el equipo de Deisseroth ha adoptado un enfoque fundamentalmente diferente.
” Recurrimos a la ingeniería química para transformar el tejido biológico en un nuevo estado intacto, pero ópticamente transparente y permeable a las macromoléculas”, dijo Chung, el primer autor del artículo.
Esta nueva forma se crea reemplazando los lípidos del cerebro con un hidrogel. El hidrogel se construye desde el interior del cerebro en un proceso conceptualmente similar a la petrificación, utilizando lo que inicialmente es una suspensión acuosa de moléculas individuales cortas conocidas como monómeros de hidrogel. El cerebro intacto post mortem está sumergido en la solución de hidrogel, y los monómeros infunden el tejido. Luego, cuando se” activan térmicamente”, o se calientan ligeramente a una temperatura corporal aproximada, los monómeros comienzan a congelarse en largas cadenas moleculares conocidas como polímeros, formando una malla en todo el cerebro. Esta malla mantiene todo unido, pero, lo que es más importante, no se une a los lípidos.
Con el tejido apuntalado de esta manera, el equipo puede extraer lípidos de forma vigorosa y rápida a través de un proceso llamado electroforesis. Lo que queda es un cerebro transparente en 3D con todas sus estructuras importantes (neuronas, axones, dendritas, sinapsis, proteínas, ácidos nucleicos, etc.) intactas y en su lugar.
Ir las cosas una mejor
CLARIDAD entonces va una mejor. Al preservar la continuidad completa de las estructuras neuronales, la CLARIDAD no solo permite rastrear las conexiones neuronales individuales a largas distancias a través del cerebro, sino que también proporciona una forma de recopilar información molecular rica que describe la función de una célula que no es posible con otros métodos.
“Pensamos que si pudiéramos eliminar los lípidos de forma no destructiva, podríamos lograr que la luz y las macromoléculas penetraran profundamente en el tejido, lo que no solo permitiría la obtención de imágenes en 3D, sino también el análisis molecular en 3D del cerebro intacto”, dijo Deisseroth, titular de la Cátedra D. H. Chen.
Utilizando anticuerpos fluorescentes que se sabe que buscan y se adhieren solo a proteínas específicas, el equipo de Deisseroth demostró que puede apuntar a estructuras específicas dentro del cerebro de ratón CLARITY-modificado o “clarificado” — y hacer que esas estructuras y solo esas estructuras se iluminen bajo iluminación. Los investigadores pueden rastrear circuitos neuronales a través de todo el cerebro o explorar profundamente los matices del cableado de circuitos locales. Pueden ver las relaciones entre las células e investigar las estructuras subcelulares. Incluso pueden ver las relaciones químicas de complejos de proteínas, ácidos nucleicos y neurotransmisores.
Una representación tridimensional del cerebro clarificado fotografiado desde abajo (mitad ventral). Un video de cerebro de roedor está disponible aquí.
“Poder determinar la estructura molecular de varias células y sus contactos a través de la tinción de anticuerpos es una capacidad central de CLARIDAD, separada de la transparencia óptica, que nos permite visualizar las relaciones entre los componentes cerebrales de formas fundamentalmente nuevas”, dijo Deisseroth, uno de los 15 expertos en el “equipo de ensueño” que trazará los objetivos de la iniciativa de investigación cerebral de $100 millones anunciada el 2 de abril por el Presidente Obama.
Y en otra capacidad significativa desde el punto de vista de la investigación, los investigadores ahora pueden desterrar el cerebro clarificado, eliminar los anticuerpos fluorescentes y repetir el proceso de tinción utilizando diferentes anticuerpos para explorar diferentes blancos moleculares en el mismo cerebro. Este proceso de tinción/decoloración se puede repetir varias veces, mostraron los autores, y los diferentes conjuntos de datos se alinean entre sí.
Abrir la puerta
CLARITY ha hecho posible, en consecuencia, realizar análisis estructurales finos y altamente detallados en cerebros intactos, incluso tejidos humanos que se han conservado durante muchos años, según demostró el equipo. Transformar cerebros humanos en muestras transparentes pero estables con cableado accesible y detalles moleculares puede producir una mejor comprensión de los fundamentos estructurales de la función cerebral y la enfermedad.
Vista tridimensional del hipocampo teñido que muestra neuronas que expresan fluorescentes (verde), interneuronas de conexión (rojo) y glía de soporte (azul).
Más allá del beneficio inmediato y aparente para la neurociencia, Deisseroth advirtió que la CLARIDAD ha superado nuestra capacidad para lidiar con los datos. “Convertir grandes cantidades de datos en información útil plantea inmensos desafíos computacionales que habrá que abordar. Tendremos que desarrollar enfoques computacionales mejorados para la segmentación de imágenes, el registro de imágenes en 3D, el rastreo automatizado y la adquisición de imágenes”, dijo.
De hecho, tales presiones aumentarán a medida que la CLARIDAD pueda comenzar a apoyar una comprensión más profunda de los sistemas y órganos biológicos intactos a gran escala, tal vez incluso de organismos enteros.
“De particular interés para el estudio futuro son las relaciones intrasystem, no solo en el cerebro de los mamíferos, sino también en otros tejidos o enfermedades para las que solo es posible una comprensión completa cuando se puede realizar un análisis exhaustivo de sistemas únicos e intactos”, dijo Deisseroth. “LA CLARIDAD puede ser aplicable a cualquier sistema biológico, y será interesante ver cómo otras ramas de la biología pueden usarlo.”
Otros coautores incluyen a la estudiante de pregrado Jenelle Wallace; estudiantes de posgrado: Sun – Yon Kim, Kelly Zalocusky, Joanna Mattis, Aleksandra Denisin y Logan Grosenick; asistentes de investigación: Sandhiya Kalyanasundaram, Julie Mirzabekov, Sally Pak y Charu Ramakrishnan; estudiosos posdoctorales: Aaron Andalman, PhD, y Tom Davidson, PhD; ex estudiante de pregrado Hannah Bernstein; y ex científica Viviana Gradinaru.
La investigación fue apoyada por el Instituto Nacional de Salud Mental (grant MH099647) ; la Fundación Nacional de Ciencias; la Fundación Simons; el Presidente y Rector de la Universidad de Stanford; las fundaciones Wiegers, Snyder, Reeves, Gatsby y Yu; el programa DE reparación DARPA;y el Fondo Burroughs Wellcome.
El Departamento de Bioingeniería de Stanford también apoyó el trabajo. El departamento es operado conjuntamente por la Escuela de Ingeniería y la Escuela de Medicina.
