PCR de colonias
La PCR de colonias es un método conveniente de alto rendimiento para determinar la presencia o ausencia de ADN insertado en construcciones de plásmidos. Los transformantes individuales pueden lisarse en agua con un paso de calentamiento corto o añadirse directamente a la reacción de PCR y lisarse durante el paso de calentamiento inicial. Este paso de calentamiento inicial causa la liberación del ADN plásmido de la célula, por lo que puede servir como plantilla para la reacción de amplificación. Los cebadores diseñados para apuntar específicamente al ADN insertado se pueden usar para determinar si la construcción contiene el fragmento de ADN de interés. Alternativamente, se pueden usar cebadores dirigidos al ADN vectorial que flanquea el inserto para determinar si el inserto tiene el tamaño molecular correcto o no. Los cebadores específicos de inserción pueden proporcionar información sobre la especificidad y el tamaño del ADN de inserción, mientras que el uso de cebadores específicos de vectores permite el cribado de múltiples construcciones simultáneamente. La PCR de colonias también se puede usar para determinar la orientación del inserto. La amplificación por PCR del plásmido mediante un imprimador específico de inserción emparejado con un imprimador específico de vector se puede diseñar para producir un amplicón de un tamaño específico solo si el inserto está en la orientación correcta. En todos los diseños experimentales, la presencia o ausencia de un amplicón de PCR y el tamaño del producto se determinan mediante electroforesis junto con un marcador de tamaño de ADN en un gel de agarosa.
