Hepatitis necrótica infecciosa causada por Clostridiumnovyi tipo B en un caballo: informe de caso y revisión de la literatura | Jiotower

La hepatitis necrótica infecciosa (INH) es causada por Clostridium novyitype B. La enfermedad afecta típicamente a las ovejas, en la que también se conoce como”enfermedad negra”, dada la decoloración oscura del tejido subcutáneo causada por la congestión venosa intensa observada en los cadáveres de animales que mueren a causa de esta enfermedad.6 Aunque también se cree que la INH ocurre en otras especies, como el ganado bovino, las cabras y los caballos, se dispone de información muy limitada sobre esta enfermedad en animales distintos de las ovejas.2,3,19,15 Además, debido a su estricta naturaleza anaeróbica,rara vez se logra el aislamiento y la identificación de C. novyi tipo B.15 Por esta razón, los informes de INH se limitan comúnmente al diagnóstico presuntivo basado en histopatología, prueba de anticuerpos fluorescentes (FAT) y/o inmunohistoquímica (IHQ). El tipo de C. novyi es raramentedeterminado. Presentamos un caso confirmado de INH equino causado por C.novyi tipo B, y también revisar la literatura sobre la enfermedad.

Un caballo castrado de Cuarto de bahía de 14 años de edad, de 511 kg, fue sometido al San Bernardinobranch del Sistema de Laboratorio de Salud Animal y Seguridad Alimentaria de California para un examen post mortem y un análisis de diagnóstico. El animal tenía un historial 3d de signos neurológicos progresivos, temperatura rectal de 38,8-40,5°C, y había sido tratado sin éxito con antiinflamatorios no esteroideos, antes de morir.Se realizó una autopsia completa ~6 h después de la muerte.

En la autopsia, el caballo se encontraba en buen estado nutricional, con una cantidad adecuada de reservas de grasa y en un estado moderado de descomposición post mortem. Hubo coloración amarillenta de la esclerótica, tejido subcutáneo y adiposo, y artílagos articulares. Se presentaron hemorragias equimóticas a sofusivas multifocales en la mayoría de los músculos, la serosa del tracto intestinal, el mesenterio, el bazo, la pleura y los músculos internos del corazón. La sangre venosa era de color rojo oscuro-negro. El pericardioac estaba distendido con una gran cantidad de líquido serosanguíneo, y había ~5 L de un líquido similar que contenía abundantes hebras de fibrina en la cavidad abdominal.El hígado estaba notablemente agrandado y tenía bordes redondeados; el lóbulo izquierdo era firme, de color rojo oscuro a negro, y tenía numerosas burbujas de gas subcapsulares y profundas en el parénquima y abundante fibrina sobre la cápsula (Fig. 1A). En la sección cortada de este lóbulo,había un área pálida de ~15 cm de diámetro rodeada por un borde hemorrágico delgado (Fig. 1B). Las meninges que invadían el cerebro y la médula espinal estaban muy congestionadas, y había hemorragias cerebrales en toda la corteza cerebral. No se observaron otros grosullos significativos en el resto de la canal.

Se recogieron muestras de cerebro, pulmón, corazón, diafragma, hígado, bazo, estómago, intestino,páncreas, glándula suprarrenal, mesenterio, riñón y vejiga urinaria y se colocaron en formalina tamponada al 10% (pH 7,2) durante 48 h y se procesaron de forma rutinaria para la producción de secciones teñidas de hematoxilina y eosina de 4 µm de grosor (H&E). Las secciones hepáticas y renales también se teñieron con tinciones de Gram y Okajima,respectivamente.

Se recogieron muestras de hígado de forma aséptica y se sometieron a cultivo aeróbico y anaerobio en placas de agar ovino al 5% durante 48 h. Se realizó PCR para el virus del Nilo Occidental(VNO) en muestras agrupadas del sistema nervioso central y para el herpesvirus equino 1 (VHE-1)en un hisopo nasal. Se realizó un cribado de metales pesados con plomo, manganeso, hierro, mercurio,arsénico, molibdeno, zinc, cobre y cadmio en muestras de hígado.El líquido cefalorraquídeo se analizó para detectar anticuerpos contra la Sarcocistisneurona utilizando una GRASA indirecta. Los frotis hepáticos fueron procesados por FATfor Clostridium chauvoei,Clostridium septicum, Clostridium sordelli y C. novyi utilizando conjugados comerciales (VMRD, Pullman, WA). Además, se procesaron secciones de hígado fijadas en formalina e incrustadas en parafina mediante una técnica de inmunoperoxidasa indirecta para C. novyi, utilizando un kit comercial (RTU VECTASTAINElite ABC system, Vector Laboratories, Burlingame, CA). La actividad de peroxidasa endógena se extinguió con una solución de peróxido de hidrógeno al 3%, seguida de un tratamiento con peps para la recuperación de antígenos. Las muestras se incubaron con un punzón de fondo (Biocare Medical, Concord, CA) para bloquear la unión inespecífica, antes de la incubación con el anticuerpo policlonal de cabra anti–C. novyi (VMRD) a 37°C durante 60 min. Se utilizó cromógeno vector NovaRED para visualización (VectorLaboratorios). Se utilizaron como control negativo secciones de hígado incubadas con suero normal de cabra en lugar de anticuerpos primarios. Hígado de vaca en la cual. novyi había sido identificado por cultivo, y la PCR se utilizó como un control positivo.

Se procesaron muestras de hígado para la extracción de ADN (kit de tejidos FFPE de ADN QIAamp, Qiagen,Hilden, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN extraído se utilizó como plantilla para un ensayo de PCR múltiple para amplificar segmentos de flagelingenos (fliC) de C. septicum, C. novyi tipo A, C. novyi tipo B, C. chauvoei, y Clostridium haemolyticum, como se describe anteriormente.17 Además, desarrollamos una PCR convencional para amplificar un segmento de theC. gen de la toxina alfa novyi tipo B (TcnA) (GenBank accession JENV01000127.1), el principal factor de virulencia de este microorganismo. Se diseñaron las siguientes secuencias de oligonucleótidos: 5 ‘-TGATGTTGACCATCCTTGCTCT-3′ (CNtBaF) y 5′-CCTTATGCAAAGGGATGGCG-3’ (CNtBaR),que amplifican un fragmento de ADN de ~342 bp del gen diana. La PCR convencional se realizó en un volumen total de 25 µL que contenía 5 µL de ADN extraído, 0.25 µL de cada imprimación (10 µM), 7 µL de agua libre de nucleasas y 12,5 µL de Mezcla Maestra de PCR(2X, Promega, Madison, WI), que contiene ADN polimerasa Taq (pH 8,5, 50 U/mL), dNTPs(400 µM) y MgCl2 (3 mm). Los perfiles de termociclador fueron los siguientes: 94 ° C durante 5 min, 30 ciclos de 94°C durante 1 min, 55°C durante 1 min y 72°C durante 1,5 min, seguidos de un paso de extensión final a 72°C durante 7 min. Las muestras se mantuvieron a 4 ° Cuntil las reacciones de PCR se visualizaron bajo luz ultravioleta en geles de agarosa al 1% teñidos con etidiumbrómido (Amresco, Solon, OH) (Agarosa SFR, Amresco). ADN extraído de C. se utilizaron cultivos de novyi tipo B (ATCC 25758), C. novyi tipo A, C. septicum, C. chauvoei y C. haemolyticum como controles positivos. Se utilizó agua en lugar de ADN en las reacciones de control negativo.

Microscópicamente, la cápsula hepática estaba cubierta por abundante fibrina mezclada con iris celular, y había ampollas enfisematosas subcapsulares y parenquimatosas profundas de varios tamaños. El hallazgo más llamativo fue la necrosis coagulante multifocal a focalmente extensiva, rodeada por un borde de un gran número de neutrófilos viables y degenerados, hemorragia, fibrina, restos celulares y grandes agregados de bastones bacterianos positivos a gramos, algunos de los cuales tenían esporas subterminales (Fig. 1C,, D).D). En elparénquima interviniente y en el hígado menos afectado, hubo estasis biliar, hemorragia multifocal y necrosis fibrinoide segmentaria a difusa de los vasos sanguíneos, muchos de los cuales también contenían trombos de fibrina. El epitelio tubular renal tenía vacuolización mildcitoplasmática, y en el lumen de los túbulos renales había proteínas y moldes granulares. Los moldes se teñían positivamente con tinción de Okajima (Fig. 1E). En el cerebro, había congestión difusa, hemorragos perivasculares multifocales y dispersos aleatoriamente, y expansión moderada a marcada del espacio Virchow-Robin con edema acidofílico. El peritoneo visceral estaba cubierto por abundante fibrina mezclada con un gran número de neutrófilos viables y degenerados; la mayoría de los vasos sanguíneos peritoneales estaban congestionados y/o contenían trombos de fibrina. Algunas arterias y venas pequeñas en la corteza y la médula de la glándula suprarrenal también tenían trombos de fibrina. La lámina tenía congestión vascular y hemorragia parenquimatosa multifocal y capsular. Los pulmones estaban muy congestionados y presentaban hemorragias multifocales y edema, además de algunos vasos sanguíneos que contenían trombos de fibrina. Se observaron hemorragias subendocárdicas, subepicárdicas y subpleurales múltiples.

La gran mayoría de bastones gram positivos intralesionales observados en el hígado fueron positivos para C. novyi IHC (Fig. 1F). La GRASA dio positivo para C.novyi, pero negativo para las otras especies clostridiales analizadas. Las muestras hepáticas fueron positivas para los genes FLIC y TcnA de C. novyi tipo B, y negativas para los genes fliC de los otros clostridios analizados (Fig. 2). Las muestras de líquido cefalorraquídeo fueron negativas para el ensayo de anticuerpos inmunofluorescentes de S. neurona. La PCR para WNV y EHV-1 fue negativa. No se logró un crecimiento bacteriano significativo mediante cultivo aeróbico o anaerobio. La pantalla de metal pesado reveló una elevada concentración de muestras de hierro en el recipiente (1.500 ppm; intervalo de referencia: 100-300 ppm).

Hicimos un diagnóstico presuntivo de INH basado en cambios macroscópicos y microscópicos,junto con resultados de GRASA e IHQ para C. novyi. El diagnóstico de INH producido por C. novyi tipo B se confirmó mediante la detección por PCR de los genes fliC y TcnA de este microorganismo. Hasta donde sabemos, sólo se han notificado previamente 6 casos de sospecha de NHI en caballos. Se produjeron tres casos en Australia,8,9,11 y uno en Nueva Zelandia,23 en Escocia,19 y en los Estados Unidos (Montana).16 En esos casos, el diagnóstico presuntivo se basó en los dientes macroscópicos y microscópicos, junto con la detección de C. novyi por GRASA,9,16,19 IHQ,23 y/o cultivo.9,19 Sin embargo, el tipo de C. novyiinvestigado no se determinó en ninguno de esos casos.

C. novyi es un bacilo anaeróbico grampositivo, formador de esporas, que se encuentra comúnmente en el suelo y las heces de los animales.15 Se clasifica en los tipos A, B y C en función de la gama de toxinas producidas.4C. novyi tipo A produce principalmente la alfatoxina letal, inductora de edema (TcnA), y la fosfolipasa no letal, toxina gamma; esta bacteria está asociada con la gangrena gaseosa del hombre y los animales, generalmente actuando junto con otros clostridios. C. novyi tipo B también produce TcnA, además de la toxina beta necrotizante y hemolítica, aunque la primera se considera el factor de virulencia más importante para la patogénesis de INH. C. novyi tipo C se considera no toxígeno y no patógeno.13,15 C. haemolyticum se conocía anteriormente como C. noviotipo D, y todavía es referido con este nombre por algunos autores; por lo tanto, también discutimos este microorganismo aquí. C. haemolyticum también produce toxina beta, pero en cantidades mucho mayores que C. novyitype B; esta toxina se considera el principal factor de virulencia de este microorganismo,y es responsable de la hemoglobinuria bacilar (HB), una enfermedad que afecta principalmente al ganado bovino y que es clínica y patológicamente muy similar a la HIN.11,10,14

Las esporas de C. los novyi son altamente resistentes a las condiciones ambientales y, dado que las esporas se encuentran comúnmente en el suelo, los animales de pastoreo pueden ingerirlas con frecuencia.6,19 Aunque no está completamente probado, el dogma actual es que, después de la ingestión, las esporas de C. novyi tipo B se absorben del intestino y llegan al hígado a través de la circulación portal, después de lo cual se extienden a otros órganos. Las esporas son fagocitadas y permanecen latentes en las células Kupfer del hígado, y en los macrófagos del bazo y la médula ósea.El 2,6 INH se ha considerado generalmente como la contraparte de la BH porque se cree que ambas enfermedades ocurren después de una lesión hepática, causando necrosis y las condiciones anaeróbicas asociadas que se requieren para la germinación de esporas latentes y la producción de toxinas.14 La migración de formas inmaduras de Fasciola hepática a través del hígado se considera el factor predisponente más importante tanto para rumiantes HB como para rumiantes inhalados, y ambas enfermedades son más comunes en áreas con alta prevalencia de fascioliasis.1 INH de rumiantes también se ha asociado con Quistes, polvo y otros parásitos, incluyendo Fascioloides, dendriticum Dicrocoelium y Tisanosoma actinoides,2,6,15,21, aunque no se ha demostrado el papel de estos parásitos en la patogénesis de la enfermedad.Sin embargo, cualquier lesión hepática que lleve a la generación de condiciones anaeróbicas puede ser un factor de predisposición para la INH. Estos incluyen, entre otros, análisis hepáticos, biopsias, cambios de grasa, telangiectasia y agentes tóxicos. Una vez que el TcnA se produce y libera por las formas vegetativas de C. novyi tipo B, su actividad monoglicosil transferasa inactiva varias proteínas de unión a guanosin5′-trifosfato (GTP) en las células del huésped, lo que resulta en una alteración y redistribución del citoesqueleto de actina.3 El TcnA también interrumpe el sistema de vimentina y tubulina.7,18 Estos cambios parecen ser más dramáticos en el endotelio capilar, lo que lleva a la extravasación de fluido extendido observada en la INH15 y probablemente a la trombosis multisistémica observada en el caballo de nuestro informe. En las ovejas, la naturaleza altamente aguda de la enfermedad dificulta la detección de signos clínicos, ya que los animales suelen encontrarse muertos. En los casos en que se observan signos, son inespecíficos, e incluyen debilidad, letargo, anorexia,hipertermia, taquipnea, hiperpnea y finalmente recostamiento. Los cambios clinicopatológicos pueden incluir neutrofilia con desplazamiento izquierdo, azotemia,acidosis metabólica y actividades enzimáticas hepáticas y musculares elevadas.15,19

Dado que solo se han descrito anteriormente 6 casos de presunción de HIN en caballos, la información epidemiológica, clínica y patológica disponible es escasa. En base a este número limitado de casos, no existe una predisposición aparente al sexo o a la raza en los casos de equinos INH, y tanto los animales jóvenes como los adultos pueden verse afectados. El curso clínico es generalmente más largo en caballos que en rumiantes, dura 12-72 h,y el resultado siempre ha sido fatal. Los signos clínicos varían de depresión leve a severa y renuencia a moverse, signos neurológicos que incluyen ataxia y punta de la cabeza, membranas mucosas hiperémicas y/o ictéricas y esclerótica ocular, dolor abdominal y recostación.20,23 En un caso en el que se realizó abdominocentesis,se obtuvo una mayor cantidad de líquido turbio con concentración de proteínas elevada y gravedad específica.9

Los perfiles clinicopatológicos de los caballos con HIN son muy variables y pueden representar diferentes etapas de toxemia y daño hepático. Estas alteraciones pueden incluir neutrofilia con desplazamiento izquierdo,actividad enzimática hepática elevada, trombocitopenia, hiperfibrinogenemia, hiperbilirrubinemia y disminución de la concentración de electrolitos.9,16,19 Además, se han notificado tiempos de tromboplastina parcial, protrombina y trombina activados aumentados.23 Estos cambios, en combinación con los microtrombios capilares observados, son sugestivos de coagulación intravascular diseminada, un proceso que probablemente ocurra durante el curso de la toxemia y la hemólisis en animales grandes.22,23 El consumo resultante de factores de coagulación, su disminución de la síntesis por fallo hepático y la acción sinérgica del TcnA sobre el endotelio vascular son responsables de las hemorragias generalizadas observadas en los casos de INH.

Aunque la ictericia no se describe en rumiantes, los caballos a veces pueden presentar este signo asociado con INH.19,23 La ictericia parece estar relacionada con la gravedad del daño hepático y, en cierta medida, con la hemólisis, como en nuestro caso, en el que la hemoglobina se visualizó en los túbulos renales mediante tinción de Okajima. El caballo de nuestro estudio presentó un aumento moderado de la concentración de hierro en el hígado, lo que sugiere un proceso hemolítico.5 Sin embargo, este nivel de hierro en el hígado es un hallazgo común en el secado de caballos por una variedad de causas y a menudo se considera un hallazgo incidental asociado con la congestión y la autólisis postmortem (observación no publicada de los autores).

Aunque se puede suponer que los caballos son más susceptibles que otras especies a la acción de la toxina beta hemolítica producida por C. novyitype B, no se han descrito cambios hemoglobinúricos en supuestos casos de INH.16,23 En comparación con C. haemolyticum, C. novyi tipo B produce niveles más bajos de toxina beta;15 por lo tanto, se presume que su contribución a la patogénesis de la INH es beminor, causando cierto grado de hemólisis en caballos, pero no lo suficiente para inducir cambios asociados a la hemoglobinuria. Además, ninguno de los casos anteriores descartó el papel de C. haemolyticum como agente causal de la enfermedad, por lo que no se pueden extraer conclusiones finales de esos casos. C. haemolyticum ha sido implicado en un caso de peritonitis séptica en una yegua por identificación con MALDI-TOF; sin embargo, en ese caso en particular no se intentó la identificación por PCR o toxina.11

No siempre se ha determinado el factor predisponente de INH en caballos, aunque se han sugerido las migraciones hepáticas de F. hepatica y trematodos relacionados, así como de miembros de la familia Strongylidae.9,12,19 Además,se ha sugerido que el tratamiento antihelmíntico previo al conjunto de signos clínicos es un posible desencadenante de la enfermedad9,16,23, presumiblemente por causar algún grado de necrosis hepática asociado con la destrucción de parásitos migratorios. Sin embargo, no se dispone de pruebas científicas que respalden esta hipótesis. Desafortunadamente, en nuestro caso no se determinaron factores de expulsión conocidos.

Como en nuestro caso, la mayoría de los informes anteriores describían un foco único (múltiple en un caso19) de necrosis que afectaba al hígado, consistentemente localizado en el lóbulo izquierdo. Esto contrasta con el INH de ovejas en las que los focos necróticos pequeños distribuidos aleatoriamente son más comunes.6,15 Se desconoce la razón de esta variación en la distribución. Es posible que el predominio de lóbulos en el lóbulo izquierdo esté relacionado con el llamado flujo portal, que es responsable del flujo diferencial de sangre portal a lóbulos particulares del receptor. Debido a que C. novyi se absorbe presumiblemente del intestino pequeño, y la sangre de este órgano sigue un flujo portal hacia el lóbulo izquierdo, esto puede resultar en que este lóbulo se vea predominantemente afectado.6 La ausencia de cambios asociados con la encefalopatía hepática (p. ej., Astrocitosis de Alzheimer tipo II asociada con hiperamonemia) 6 puede sugerir que los signos neurológicos en este y en casos anteriores fueron consecuencia de hemorragias, congestión y edema perivascular observado en el cerebro, relacionado con la toxemia y la acción del TcnA sobre el endotelio capilar.

INH debe estar en la lista de diagnósticos diferenciales de caballos con signos neurológicos clínicos, toxemia, insuficiencia hepática aguda y peritonitis. Aunque el tratamiento con dosis altas de penicilina y tetraciclinas puede ser eficaz contra el cáncer. novyi, la producción avanzada de toxinas generalmente resulta en un mal pronóstico.19 En áreas en las que la enfermedad está claramente asociada con gusanos hepáticos u otros parásitos, como medidas preventivas se puede intentar reducir la carga parasitaria y limitar el acceso de los animales a pastos mal drenados.15

Dado que se supone que varias enfermedades clostridiales están asociadas con una descomposición post mortem acelerada, una consideración importante para el diagnóstico correcto de la INH es la necesidad de una evaluación y conservación rápidas de los tejidos después de la muerte del animal.6,23 La historia clínica, la autopsia de rutina, la histopatología y la inmunotinción de C. novyi en lesiones hepáticas son esenciales para proporcionar un diagnóstico presunto de INH. Debido a que el aislamiento no siempre es exitoso, dados los estrictos requisitos anaeróbicos del microorganismo,la identificación molecular por PCR es una herramienta valiosa para proporcionar un diagnóstico etiológico y para diferenciar a C. novyi tipo B de otros patógenos cerebrales.