Arabidopsis cmt3 mutaciones en cromometilasa bloquean la metilación no CG y el silenciamiento de un gen endógeno | Jiotower

Resultados y discusión

Para identificar los factores que controlan la metilación y el silenciamiento de los genes WS PAI, aislamos una variante mutante de WS, pai1C251Y, en la que el silenciamiento del gen metilado PAI2 singularizado se puede visualizar por la intensidad de un fenotipo de planta azul fluorescente bajo luz ultravioleta (UV) (Bartee y Bender 2001). En la cepa pai1C251Y, las únicas fuentes potenciales de actividad de la enzima PAI son el gen PAI1, que está paralizado por una mutación sin sentido, y el gen PAI2, que está silenciado. Debido a esta deficiencia de PAI, la cepa acumula intermedios de la vía del triptófano fluorescente, además de mostrar pigmentación de hojas de color amarillo verdoso, tamaño reducido, aumento de la espesura y fertilidad reducida. Sin embargo, las mutaciones de segundo sitio que alivian el silenciamiento de PAI2 suprimirán los fenotipos deficientes en PAI (Bartee y Bender 2001). Por lo tanto, mutagenizamos la cepa pai1C251Y y seleccionamos plántulas con fenotipos fluorescentes débiles suprimidos. Como prueba secundaria, probamos la metilación de PAI mediante el análisis Southern blot con enzimas de restricción sensibles a la metilación. Específicamente, analizamos la metilación con los isosquizómeros HpaII y MspI, que reconocen la secuencia 5 ‘- CCGG-3’. El HpaII es sensible a la metilación de las citosinas internas (CG) y externas (CNG), mientras que el MspI solo es sensible a la metilación de las citosinas externas. Estas enzimas se rompen una vez en cada locus WS PAI y revelan tanto la densidad como el patrón de metilación para cada gen (Bender y Fink 1995; Luff et al. 1999; Melquist et al. 1999).

A partir de esta estrategia de cribado, aislamos 11 alelos de pérdida de función en el gen CMT3 (ver a continuación y Materiales y métodos). Los mutantes cmt3 en el fondo de pai1C251Y mostraron una fluorescencia fuertemente reducida en el desarrollo temprano de las plántulas y una fluorescencia parcialmente reducida en plantas adultas, con aumento de tamaño, disminución de la espesura y aumento de la fertilidad (Fig. (Higo.1).1). Estos aislados fluorescentes intermedios de cmt3 no volvieron a la no fluorescencia, que es un diagnóstico de pérdida de metilación residual de PAI2 (Bender y Fink 1995), a una frecuencia detectable. Mostraron un aumento parcial de la escisión con HpaII y un fuerte aumento de la escisión con MspI para los genes PAI en relación con pai1C251Y parental (Fig. (Higo.2A).2A). El patrón de escisión sugirió que los mutantes cmt3 fueron los más afectados en el mantenimiento de la metilación CNG de los genes PAI. Para determinar si los mutantes cmt3 también afectaban a la metilación de una secuencia genómica altamente repetida, le reprochamos a la mancha sur de HpaII/MspI una sonda a las secuencias de repetición asociada a centrómeros (CEN) de 180 bp (Vongs et al. 1993). Esta sonda reveló poco efecto sobre la escisión del HpaII, pero aumentó la escisión del MspI, consistente con el patrón observado para los genes PAI (Fig. (Higo.2B).2B). También se observó un patrón similar de aumento de la escisión del IPM con el ADNr repetido (datos no mostrados). Todos los 11 alelos cmt3 analizados tenían patrones de metilación idénticos en estos ensayos. Además, cuando los alelos cmt3 se separaron del alelo pai1C251Y en un fondo WS de tipo salvaje, también mostraron patrones de metilación idénticos en estos ensayos (Fig. (Higo.2).2). Los patrones de metilación de PAI y CEN fueron distintos de los patrones inducidos por las mutaciones caracterizadas con deficiencia de metilación ddm1 y met1 (Fig. (Higo.2; 2; Bartee y Bender 2001).

Para determinar con mayor precisión los patrones de metilación en el fondo mutante de cmt3, realizamos una secuenciación genómica de los patrones de metilación en las regiones promotoras de PAI1 y PAI2 de un alelo cmt3 representativo mediante el uso de mutagénesis de bisulfito de sodio (Frommer et al. 1992). Este análisis reveló que la mayoría de las citosinas metiladas (87% en PAI1 y 70% en PAI2) se producían en residuos GC (Fig. (Higo.3; 3; Tabla Tabla 1).1). En comparación con el promotor WS PAI1 de tipo salvaje (Luff et al. 1999; Tabla Tabla1), 1), se redujo la metilación por CG en un 34%, se eliminó la metilación por CNG y se redujo la metilación asimétrica en un 93%; en el promotor PAI2, se redujo la metilación por CG en un 8%, se redujo la metilación por CNG en un 92% y se redujo la metilación sin CG en un 75%. Por lo tanto, la pérdida de la función CMT3 tiene un fuerte efecto en el mantenimiento del GNC y la metilación asimétrica y un efecto más débil en el mantenimiento de la metilación CG. Estos resultados son consistentes con los informes de que Arabidopsis CMT3 y maize ZMET2 son importantes para el mantenimiento de la metilación con GNC en varios sitios genómicos (Lindroth et al. 2001; Papa et al. 2001), pero muestran además que la CMT3 también es importante para el mantenimiento de la metilación asimétrica de los genes PAI. Este resultado implica que CMT3 controla directamente la metilación simétrica y asimétrica o que la reducción de la metilación simétrica en el fondo mutante de cmt3 causa una metilación asimétrica reducida como consecuencia secundaria. Debido a que las secuencias metiladas en el promotor y primer exón del gen reportero PAI2 (∼370 pb) contienen solo 16 motivos CG dispersos, la pérdida de metilación no CG hipometila significativamente esta región del gen (Fig. (Higo.3), 3), teniendo en cuenta la expresión mejorada de PAI2 en el mutante supresor.

El locus mutante cmt3 en los aislados supresores de pai1C251Y cmt3 se mapeó mediante cruces con la cepa polimórfica Nd-0, que tiene una disposición similar de genes de PAI densamente metilados que se encuentran en WS (Melquist et al. 1999). La progenie F2 con fenotipos débilmente fluorescentes diagnosticó homocigosidad tanto para pai1C251Y como para cmt3 mediante inspección visual bajo luz UV y fue confirmada por MSPI Southern blot para una fuerte escisión de PAI similar a la observada en los aislados supresores parentales. A continuación, se utilizó una población cartográfica de plantas F2 que cumplían estos criterios para determinar los loci genómicos vinculados al fenotipo suprimido. El análisis de mapeo reveló un enlace a un único locus en la parte inferior del brazo del cromosoma 1. Debido a que el supuesto gen de citosina metiltransferasa CMT3 se asigna a este locus, nos enfocamos en este gen como candidato. Dentro de cada población de mapeo, encontramos un enlace completo a un marcador polimórfico que se encuentra dentro de 100 kb del gen CMT3. Para confirmar que el gen CMT3 era de hecho el sitio de las mutaciones supresoras de metilación, clonamos y secuenciamos el gen de los 11 aislados mutantes. La secuenciación reveló un único cambio de base en la secuencia de codificación CMT3 en cada aislamiento. Tres de los alelos mutantes afectaron a aminoácidos absolutamente conservados en el dominio catalítico de la metiltransferasa, incluido el alelo representativo cmt3G456D utilizado para la secuenciación de bisulfito. Se predijo que otro alelo terminaría prematuramente la proteína. Dos alelos crearon mutaciones de unión de empalme. Los cinco alelos restantes afectaron a los aminoácidos entre el motivo IV de la metiltransferasa y el extremo C de la proteína, que están altamente conservados entre los genes CMT (Fig. (Higo.4).4).

Para confirmar aún más que el gen CMT3 era el locus mutante, transformamos los aislados cmt3 de pai1C251Y con un clon genómico WS de tipo salvaje del gen CMT3. Las plántulas transformantes eran fuertemente fluorescentes, de manera similar a las de la cepa pai1C251Y (Fig. (Higo.1).1). Las líneas transformantes analizadas por análisis de blot sureño en la generación T2 mostraron remetilación del gen PAI2 a los niveles observados en la cepa original de pai1C251Y (datos no mostrados). Por lo tanto, el gen CMT3 clonado podría complementar los defectos de metilación mutantes. Como control, el mutante representativo pai1C251Y cmt3G456D también se transformó con un clon genómico WS de tipo salvaje del gen CMT2. Las plántulas transformantes CMT2 eran débilmente fluorescentes, de manera similar a las de la cepa parental no transformada (Fig. (Higo.1), 1), y no mostró remetilación detectable de PAI2. Este análisis muestra que la CMT2 no puede sustituir a la función CMT3. En este sentido, es interesante observar que la CMT2 difiere de la CMT3 principalmente en su secuencia N-terminal (Fig. (Higo.44).

Cepas de Arabidopsis deficientes en metilación caracterizadas previamente con defectos en el gen DDM1 relacionado con el factor de remodelación de la cromatina SWI2/SNF2 (Jeddeloh et al. 1999) o el gen MET1 de citosina metiltransferasa relacionado con Dnmt1 muestra anomalías progresivas del desarrollo (Finnegan et al. 1996; Kakutani et al. 1996; Ronemus et al. 1996). Nuestro análisis preliminar de cepas consanguíneas de seis generaciones de pai1C251Y cmt3 y de dos generaciones de cepas consanguíneas de cmt3 no reveló una segregación obvia de los cambios morfológicos. Esta diferencia entre cmt3 y otros mutantes deficientes en metilación probablemente refleje el hecho de que la metilación GC se retiene en mayor grado en cmt3 que en ddm1 o met1 (Fig. (Higo.2; 2; Bartee y Bender 2001). Debido a que muchos de los sitios metilados endógenos en el genoma de Arabidopsis, como las repeticiones CEN (Fig. (Higo.2; 2; Vongs et al. 1993; Lindroth et al. 2001), y el promotor del gen homeo-dominio FWA (Soppe et al. 2000; Lindroth et al. 2001), llevan principalmente metilación por CG, no se espera que las mutaciones cmt3 afecten fuertemente estos loci. En cambio, la CMT3 probablemente actúa como una metilasa de refuerzo que agrega una capa adicional de metilación a regiones genómicas particulares, como los genes PAI, en los que el aumento de la densidad de metilación conduce a un mayor silenciamiento. Un modelo específico es que la capa basal de metilación por GC proporcionada por otras funciones como MET1 podría servir como guía para CMT3, que luego decoraría la capa basal con metilación por GC adicional y sin GC. El reclutamiento de CMT3 en regiones específicas podría implicar interacciones de la proteína de la cromatina con el motivo del cromodominio (Henikoff y Comai 1998), junto con interacciones mediadas por las secuencias N-terminales únicas.

Porque hongos como Neurospora crassa y Ascobolus immersus pueden mantener la metilación sin GC (Selker et al. 1993; Goyon et al. 1994), estos organismos podrían codificar genes CMT. Por el contrario, debido a que los animales como los humanos y los ratones carecen de metilación sin GC, se predice que estos organismos carecerán de genes CMT, como es el caso de los análisis de las bases de datos de secuencias actuales. La aparente falta de metilasas similares a CMT en los genomas animales (Finnegan y Kovac 2000) sugiere que los animales han desarrollado mecanismos alternativos para reforzar los estados de cromatina.