Prospecto de Medio Condicionado con Células Madre en Medicina Regenerativa

Resumen

Antecedentes. El medio condicionado derivado de células madre tiene una perspectiva prometedora para ser producido como productos farmacéuticos para medicina regenerativa. Objetivo. Investigar varios métodos para obtener medio condicionado derivado de células madre (CM) para obtener una idea de su perspectiva de aplicación en diversas enfermedades. Método. Revisión sistemática utilizando palabras clave “células madre” y ” medio condicionado “o” secretoma “y ” terapia”.”Se anotaron, agruparon, tabularon y analizaron los datos relativos a las condiciones/enfermedades tratadas, el tipo de célula que se cultivó, el medio y los suplementos para cultivar las células, la condición de cultivo, el procesamiento de CM, los factores de crecimiento y otras secreciones que se analizaron, el método de aplicación y el resultado. Resultado. La mayoría de los estudios de CM que utilizaron mostraron buenos resultados. Sin embargo, los diversos CM, incluso cuando se derivaban del mismo tipo de células, se produjeron por diferentes condiciones, es decir, a partir de diferentes pasajes, medios de cultivo y condiciones de cultivo. Los rendimientos del factor de crecimiento de los diversos tipos de células estaban disponibles en algunos estudios, y se podía calcular el número de células que se necesitaba para producir CM para una aplicación. Conclusion. Varios medios condicionados derivados de células madre se probaron en varias enfermedades y, en su mayoría, mostraron buenos resultados. Sin embargo, es necesario llevar a cabo métodos estandarizados de producción y validaciones de su uso.

1. Introducción

Se están acumulando datos sobre el uso de células madre en diversas enfermedades. Algunos estudios reportaron efectos beneficiosos de la terapia con células madre en enfermedades degenerativas como el infarto de miocardio y revelaron que las células madre causan reparación de tejidos debido a su capacidad para secretar factores tróficos que ejercen un impacto beneficioso en el tejido dañado, en lugar de su capacidad para diferenciarse en las células necesarias . Varios estudios sobre factores secretados derivados de células madre mostraron que el factor secretado solo sin la célula madre en sí puede causar reparación de tejidos en varias condiciones que involucran daño a tejidos/órganos. Los factores secretados se conocen como secretoma, microvesículas o exosoma y se pueden encontrar en el medio donde se cultivan las células madre; por lo tanto, el medio se llama medio condicionado (CM) .

El uso de secretomas que contienen CM tiene varias ventajas en comparación con el uso de células madre, ya que el CM se puede fabricar, liofilizar, empaquetar y transportar más fácilmente. Además, al carecer de células, no hay necesidad de emparejar al donante y al receptor para evitar problemas de rechazo. Por lo tanto, el medio condicionado derivado de células madre tiene una perspectiva prometedora para ser producido como productos farmacéuticos para medicina regenerativa.

Hasta la fecha, no se ha notificado ningún ensayo clínico en el que se haya utilizado CM para una determinada enfermedad, excepto dos estudios piloto sobre el uso de CM de células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo para la regeneración del folículo piloso y la regeneración fraccionada de dióxido de carbono para la cicatrización de heridas en humanos, que mostraron buenos resultados. El uso de la CM para la terapia es muy atractivo y puede estar en auge en un futuro próximo, ya que se están acumulando estudios sobre el uso de la CM para diversas enfermedades . El medio acondicionado contiene varios factores de crecimiento y agentes regeneradores de tejidos, que fueron secretados por las células madre. El hecho de que las células madre secreten varios factores de crecimiento también fue demostrado por varios estudios proteómicos, que revelaron la presencia de varios factores de crecimiento y otras citocinas en la CM .

Sin embargo, varios estudios informaron el uso de varios tipos de células madre y varios métodos para obtener la CM para curar varios tipos de enfermedades degenerativas en varios modelos animales. Por lo tanto, esta revisión sistemática tuvo como objetivo investigar los diversos métodos para obtener la CM y las diversas enfermedades que se trataron, para obtener una idea de los diversos tipos de CM y sus beneficios de aplicación en diversas enfermedades.

2. Materiales y Métodos

Realizamos búsquedas de “todo el texto “sin restricción de tiempo el 23 de enero de 2014, en Pubmed/Medline utilizando palabras clave” células madre “y” medio condicionado “o” secretome ” y “terapia”, búsquedas de “todo el texto” en la biblioteca Cochrane (ensayos) utilizando palabras clave “secretome” o “medio condicionado” y ClinicalTrials.gov uso de palabras clave “células madre” y ” medio condicionado “o” secretoma “y ” terapia”.”Además, se agregaron artículos relevantes existentes en nuestra biblioteca.

Los criterios de inclusión son todos los estudios que utilizaron CM para una determinada enfermedad. Los criterios de exclusión son los estudios que no contenían datos completos sobre el estado/modelo de enfermedad del sujeto, la fuente de MC y el resultado del tratamiento con MC.

La recolección de datos es la siguiente: condiciones/enfermedades tratadas, tipo de célula que se cultivó, composición detallada del medio y suplementos que se utilizaron para cultivar las células, condición de cultivo (hipoxia o normoxia) para obtener el CM, procesamiento del CM, factores de crecimiento y otras secreciones que se analizaron; el método (modo) de aplicación y el resultado de la aplicación del CM se anotaron, agruparon y tabularon.

La síntesis de los datos es la siguiente: los datos se agruparon de acuerdo con la enfermedad tratada y los tipos de células que se utilizaron para producir la CM. Además, para conocer los rendimientos del factor de crecimiento de los diversos tipos de células, cuando estaban disponibles, los niveles del factor de crecimiento se tabularon y agruparon de acuerdo con los tipos de células que produjeron el factor de crecimiento que contiene el medio condicionado, en relación con el número de células, el tipo y la duración del cultivo y el procesamiento del medio condicionado. Cuando se disponía de los datos, se calculaba el número de celdas que se necesitaban para producir el CM para una aplicación.

3. Resultados y discusión

Se obtuvieron 39 artículos que cumplieron los criterios de inclusión y 7 fueron excluidos por datos incompletos. Varias afecciones / enfermedades fueron tratadas con varios CM derivados de células y, en su mayoría, mostraron resultados prometedores (Tabla 1).

Los diversos medios condicionados, incluso cuando se derivaban del mismo tipo de células, se produjeron por diferentes condiciones, es decir, a partir de diferentes pasajes, número de células, medio de cultivo y condición de cultivo (Tabla 2). Los rendimientos del factor de crecimiento de los diversos tipos de células se pueden ver en la Tabla 3, y el número de células que se necesita para producir CM para una aplicación se puede ver en la Tabla 4.

Varios estudios mostraron que el medio condicionado se ha probado en varios tipos de enfermedades/afecciones (Tabla 1) , es decir, alopecia , isquemia aguda y crónica de las extremidades posteriores , cicatrización aguda y crónica de heridas , infarto de miocardio , lesión/insuficiencia hepática aguda , lesión cerebral/isquemia/accidente cerebrovascular , lesión de la médula espinal , lesión pulmonar y defecto óseo , y mostraron mejoría de las afecciones. Además, la enfermedad renal crónica que se trató con células madre mesenquimales derivadas de células madre embrionarias humanas (huESC-MSC) CM mostró disminución de la presión arterial sistólica y proteinuria, y mejoría en el daño tubular y glomerular, el flujo sanguíneo renal y la tasa de filtración glomerular . Sin embargo, la nefropatía que se trató con CM de células madre somáticas sin restricciones de sangre de cordón umbilical humano (huUCB-USSC) o CM de células madre mesenquimales de médula ósea de ratón (mBM-MSC) no mostró mejoría en los niveles séricos de urea y creatinina, daño histopatológico y puntuación de actividad física . Además, la prevención del cáncer mediante la línea de células madre mesenquimales humanas CM mostró un aumento de la proliferación de células tumorales y de la vascularización .

En los dos casos de enfermedad renal, se puede concluir que la CM de hu-ESC-MSC puede mejorar la condición, y el nivel de factor de crecimiento necesario es presumiblemente suficiente, ya que el procesamiento de la CM incluye un paso de concentración de 25 veces . Sin embargo, para hu-UCB-USSC o mBM-MSC-CM, la falta de datos sobre el procesamiento de la CM y el nivel del factor de crecimiento de la CM impide un análisis posterior para concluir si el fracaso para mejorar la condición se debe a la falta de cierto factor de crecimiento o debido al nivel de factores de crecimiento que fue demasiado bajo para dar un efecto.

3.1. Medio de cultivo y Suplemento

Algunos estudios utilizaron suero fetal bovino u otro medio completo que contenía suplemento, mientras que otros estudios utilizaron medios libres de suero. Además, los medios basales utilizados fueron variables, por ejemplo, aMEM, DMEM, DMEM / F12, M199, EBM2, EGM-2, in vivo 15 o medio químicamente definido, y el mismo tipo de célula puede ser cultivado en diferentes tipos de medio basal (Tabla 2). El medio de cultivo en cultivo in vitro representa el microambiente en condiciones in vivo y puede determinar el destino celular y, por lo tanto, la secreción celular . Por lo tanto, el mismo tipo de células puede secretar diferentes niveles de factores de crecimiento cuando se cultivaron en diferentes medios, como se puede ver en la Tabla 3 .

3.2. Duración del cultivo

La producción de CM varía en duración del cultivo de dieciséis horas a cinco días (Tabla 3). En caso de que se utilizara un medio completo, la corta duración del cultivo podría dejar ciertos factores de crecimiento derivados del suero que no fueron consumidos por las células y podría aumentar el nivel del factor de crecimiento o, por el contrario, suprimir la secreción del factor de crecimiento por las células. La posibilidad de la presencia de factor de crecimiento residual del medio se puede ver en un estudio, que mostró que el medio sin célula contenía un nivel de TGF-b1 de pg/mL (Tabla 3) .

3.3. Condición de cultivo

La mayoría de los estudios produjeron CM en cultivo monocapa, pero varios estudios utilizaron cultivos esferoides (Tabla 3). Los cultivos esferoides necesitan un manejo y un equipo especiales (matraz giratorio), pero producen más células en comparación con los cultivos monocapa convencionales y, por lo tanto, más factores secretados (Tabla 4). Además, las células ubicadas en el centro del esferoide pueden estar en una condición hipóxica relativa en comparación con las células de la superficie, lo que aumenta aún más el rendimiento de ciertos factores de crecimiento.

3.4. Papel del Factor Secretado en la Mejora de Enfermedades

Varias citocinas fueron secretadas por células madre en el CM, y jugaron un papel en la mejora de varias enfermedades/condiciones. Esas citocinas se pueden agrupar en factores de crecimiento, citocinas proinflamatorias y antiinflamatorias y otras citocinas. Varios estudios utilizaron varios métodos para evaluar varias citocinas en el CM acondicionado, desde los ensayos ELISA convencionales hasta los métodos de perfilado proteómico .

3.4.1. Factores de crecimiento

Además, los estudios que analizaron varios factores de crecimiento informaron la presencia de varios factores de crecimiento, que fueron secretados por varias células madre en su medio condicionado (Tabla 3), a excepción del MSC humano (Lonza) que no secretó FGF-2, PDGFBB, BMP-2 y SDF-1, sino que secretó IGF-1, VEGF, TGF β1 y HGF . Además, diferentes condiciones de cultivo y medios pueden producir diferentes niveles de secreciones del factor de crecimiento .

3.4.2. Citoquinas Proinflamatorias y Antiinflamatorias

3.4.3. Otras citocinas

3.5. Traducción del Uso del Medio Condicionado en Pacientes

En medio condicionado, varios factores pueden estar presentes como un cóctel y actuar en conjunto para promover la regeneración. Por lo tanto, es importante analizar un conjunto completo de factores de crecimiento y niveles de citoquinas para cada tipo de medio condicionado derivado de células madre y conocer la condición de cultivo, el procesamiento del medio condicionado y las enfermedades/condiciones que responden a un determinado tratamiento del medio condicionado. Cuando se conoce el contenido de las diversas citocinas en un determinado medio condicionado, se puede determinar el resultado del medio condicionado en una determinada enfermedad/condición, y se abre el camino a la traducción en pacientes.

De los estudios que analizaron el nivel de VEGF, podemos concluir que la mayoría de las células madre secretan VEGF. Como el VEGF desempeña un papel importante en la angiogénesis en la regeneración de tejidos/órganos lesionados/dañados, varios medios condicionados derivados de células madre pueden curar diversas enfermedades y tendrán un mayor impacto en las enfermedades con isquemia. Además, el VEGF puede prevenir la apoptosis en condiciones hipóxicas, previniendo así daños adicionales .

Además, el FGF2 es un factor angiogénico más potente en comparación con el VEGF, con un efecto adicional en la proliferación de fibroblastos, preadipocitos y células madre endoteliales, epiteliales y neurales, en la migración de células gliales y miogénicas derivadas de la cresta neural y en la diferenciación de células neuroepiteliales en neuronas maduras y células gliales .

Otros factores de crecimiento contribuyen a la regeneración de órganos tisulares lesionados/dañados, con especial énfasis en la proliferación, es decir, el PDGF para el tejido conectivo, las células gliales y otras, el EGF para las células mesenquimales, gliales y epiteliales, y el IGF-I e IGF-II para varios tipos de células . Además, el PLGF que es miembro de la familia VEGF aumenta la actividad del VEGF in vitro e in vivo , el KGF inhibe la muerte celular epitelial inducida por estrés oxidativo , el NGF promueve el crecimiento de las neuritas y la supervivencia de las células neuronales, el BDNF es neuroprotector, promueve la supervivencia celular y reduce la formación de cicatrices astrogliales , y algunos factores de crecimiento, como el HEGF, el FGF-7, el EGF y el HGF promueven la regeneración hepática .

Las citocinas proinflamatorias que desempeñan un papel en la regeneración son la IL-1b debido a su función protectora del hígado , la IL-8 debido a su actividad angiogénica y la IL-9 debido a la actividad de promoción de la cicatrización de heridas . Además, las citoquinas antiinflamatorias previenen la inflamación y promueven la regeneración hepática .

El receptor MCSF (MCSFR) promueve el crecimiento y desarrollo del progenitor mieloide, fagocito mononuclear y trofoblasto placentario, y el PDGFR puede interactuar con varias moléculas de señalización o integrinas para causar proliferación celular , motilidad, diferenciación o supervivencia por inhibición de la apoptosis .

Además, un factor puede contribuir a más de un modo de acción regenerativa, como el MCP-1 que participa en la angiogénesis y la actividad de protección hepática . Además, para la producción de CM que se aplicará en diversas enfermedades humanas, los datos de estudios en animales que mostraron resultados prometedores son muy valiosos.

3.5.1. Producción de CM para su Traducción en Diversas Enfermedades Humanas

Para usar CM para diversas enfermedades humanas, el método de producción del CM debe estandarizarse en términos del tipo y número de células que se necesitaban para producir el CM, el medio de cultivo y la condición, y el procesamiento del medio condicionado. Además, el volumen y el modo de entrega también son importantes. Como varios estudios utilizaron varios números y tipos de células y varias dosis de CM, es importante conocer el número de células que produjeron el CM para una aplicación, que puede interpolarse para estudios en humanos. Por lo tanto, en la Tabla 4 resumimos todos los datos que pueden ser necesarios para la interpolación en estudios humanos, es decir, las enfermedades tratadas, la especie y la edad o el peso corporal del animal, el tipo de célula, el medio de cultivo y la condición, el número de células para producir CM para una aplicación, el volumen y el modo de aplicación. Además, en la Figura 1 se resumen varias posibles aplicaciones de la CM para diversas condiciones.

Figura 1

Varias de las posibles aplicaciones de CM para diversas condiciones.

Además, para la traducción a los pacientes, es muy importante analizar y anotar los diversos contenidos de citocinas de los diversos medios condicionados. Además, para cada medio acondicionado con contenido de citocinas conocido, se debe realizar la validación de su uso en diversas enfermedades. Por último, se debe evaluar la posibilidad de promover el cáncer existente para cada CM, y se debe tener precaución antes de la terapia con CM para garantizar que el receptor esté libre de cáncer.

Las ventajas de la producción de varios CM para pacientes residen en la posibilidad de producción en masa por parte de las compañías farmacéuticas, cuando los métodos de producción se han estandarizado. Los medios acondicionados no son como las células madre que necesitan una instalación de buenas prácticas de fabricación (GMP) para ser aplicada a los pacientes . Cuando la CM se ha empaquetado correctamente, se puede transportar fácilmente como medicamentos y no necesita criopreservación, como la que necesitan las células madre. Sin embargo, en comparación con las células madre que pueden sobrevivir durante un período bastante largo, la CM debe administrarse con más frecuencia , ya que las vidas medias de las citocinas y los factores de crecimiento son en su mayoría más cortas, lo que es una desventaja para los pacientes, pero dará más beneficios a las compañías farmacéuticas.

4. Conclusión

Se produjeron varios medios condicionados derivados de células madre mediante diversos métodos y procesos y se probaron en diversas enfermedades y, en su mayoría, mostraron buenos resultados. Sin embargo, es necesario llevar a cabo métodos estandarizados para la producción de diversos medios condicionados y validaciones de su uso en diversas enfermedades.

Conflicto de intereses

El autor declara que no existe conflicto de intereses con respecto a la publicación de este artículo.

Reconocimiento

Este estudio fue financiado por la beca de investigación del Ministerio de Educación y Cultura de Indonesia (Pusnas 2014), número de Contrato 2218/H2. R12 / HKP.05.00/2014.