Proteína de unión gap Connexin-43 es un regulador de transcripción directa de N-cadherina in vivo

Manipulación embrionaria

Adulto X. los laevis se mantuvieron a 17 °C y se utilizaron de acuerdo con las regulaciones de la Unidad de Servicio Biológico del University College de Londres, cumpliendo con las directrices del Ministerio del Interior del Reino Unido establecidas en la Ley de Animales 1986 tal y como se describe45. Los embriones de X. laevis se obtuvieron y estadificaron como se describió previamente46, 47. Para apuntar específicamente a la cresta neural, se inyectaron embriones en los blastómeros ventrales de los animales en la etapa de ocho células en un lado para todos los experimentos, excepto cuando se usaron lisados embrionarios. En este caso, los embriones se inyectaron en ambos lados de los animales de embriones de dos células. Se realizaron microinyecciones embrionarias de acuerdo con48. En caso necesario, se utilizaron como trazadores fluoresceína-dextrano (FDx; Invitrogen, D1821, 20 ng) o rodamina-dextrano (RDx; Invitrogen, D1824, 20 ng). Oligomorfolinos frente a X. laevis Cx43 (Cx43MO1; 8-24 ng, 5 ‘- TTCCTAAGGCACTCAGTCACCCAT-3′, Cx43MO2; 8-24 ng, 5′-AAAAATGGTTTTCTGGGGTCGA – 3′) y BTF3 (BTF3MO, 40 ng, 5′-AACGGACGGGTTTAAAGGCTTCCT-3′) fueron sintetizados y proporcionados por Gene Tools LLC. Se utilizaron concentraciones equimolares de morfolino de control estándar (CTLMO: 3′-ATATTTAACATTGACTCCATTCTCC-5’). Las cantidades de morfolinos corresponden a las cantidades inyectadas en un lado de embriones en estadio de ocho células, mientras que el otro lado se utilizó como control interno. Cuando se utilizaron embriones para la recolección de lisados embrionarios, se inyectaron en estadio de dos células en ambos blastómeros animales y se utilizó el doble de las dosis mencionadas. Para probar la eficiencia de Cx43MOs en el ARNm endógeno cx43, se realizó un análisis de western blot. Ambos Cx43MOs redujeron de manera eficiente los niveles de proteína de los endógenos Cx43FL y Cx43iso (Fig. 3a, b). Para validar la eficiencia de BTF3MO, probamos mediante inmunotinción de las células de la cresta neural la expresión de la proteína BTF3, que mostró niveles disminuidos de BTF3 en las células BTF3MO en comparación con CTLMO (Fig.Suplementaria. 3a).Se realizó hibridación in situ

como se describió previamente49, 50. Brevemente, los embriones se fijaron en MEMPFA, seguidos de hibridación nocturna con sondas marcadas con digoxigenina, incubados con un anticuerpo AP y la actividad AP se desarrolló utilizando sustratos NBT/BCP. Se prepararon sondas de ARN marcadas con digoxigenina para foxD348 snail251, twist52, n-cadherin53, C353, btf3 (Xenbase: XL075i22), y sox1054, sox954. Se utilizaron C3 (1 µg/ml), snail2 (0,8 µg/ml), foxD3 (2 µg/ml), sox10 (1 µg/ml), sox9 (1 µg/ml) y twist (0,7 µg/ml) para evaluar la inducción de la cresta neural, twist (0.7 µg / ml) para la migración de la cresta neural, n-cadherina (1 µg/ml) para evaluar los niveles de expresión y el patrón de expresión btf3 (0,7 µg/mL). La inmunotinción de montura completa se llevó a cabo como se describió previamente55 utilizando anticuerpos Cx43 (1:1000, Sigma, C6219). Brevemente, los embriones se fijaron en MEPMFA y se incubaron durante la noche con el anticuerpo en la dilución descrita.

Los explantes de capuchón de animales se diseccionaron de blástulas Xenopus (estadio 8) utilizando una técnica normal48,56 y se prepararon para la hibridación in situ como se describió anteriormente. Para los ensayos de cap en animales, se inyectaron 500 pg de ARNm en el lado animal de los dos blastómeros de embriones en estadio de dos células. El análisis de ISH se realizó en 20-25 embriones por condición para cada experimento independiente.

Manipulación de la cresta neural y obtención de imágenes

Se realizaron trasplantes de cresta neural como se informó previamente57. Brevemente, la cresta neural tomada de embriones con etiqueta fluorescente en estadio 18 se diseccionó con cuchillos de cejas y se injertó en embriones huéspedes sin etiqueta. Para experimentos in vitro, se diseccionaron explantes de cresta neural craneal en la etapa 18 utilizando una técnica normal58, 59 y se platearon en platos recubiertos de fibronectina (Sigma, F1141) como se describió previamente53. Para los ensayos unicelulares, las células de la cresta neural se disociaron brevemente en medio de Danilchick libre de Ca2+/Mg2+53. Para cada condición, se analizaron diez embriones trasplantados con NC marcado con fluorescentes por experimento.

Se realizó inmunotinción en explantes de cresta neural como se describió previamente54 utilizando anti-N-cadherina (1:50, IgG de rata, MNCD2 clon, DSHB), anti-E-cadherina (1:250, mouse IgG, clone 5D3, DSHB), anti-BTF3 (1:100, Abcam, ab107213), anti-rabbit IgG Alexa488 (1:500, Invitrogen, A11034) and anti-rat IgG Alexa488 (1:500, LifeTechnologies). When required, 4′,6- diamidino-2-phenylindole (DAPI; 1 μg/mL, Sigma, D9542) and/or phalloidin tetramethylrhodamin-b-isothiocyanate (PhR; 1 μg/mL, Sigma, P1951) were used.

Imaging of fixed embryos was performed using a MZFLIII Leica fluorescence stereomicroscope equipped with a DFC420 Leica camera controlled by Leica IM50 software. La imagen de la migración de la cresta neural in vitro se realizó mediante fotografía de lapso de tiempo, como se describió previamente53, 60. Brevemente, las células de la cresta neural se cultivaron en placas de petri de plástico o vidrio recubiertas con fibronectina, y se inició una microcopia de lapso de tiempo después de una hora de cultivo in vitro. Para la movilidad y migración celular, se utilizaron microscopios compuestos (ya sea un microscopio Nikon Eclipse 80i con una cámara digital Hamamatsu o un microscopio DMRXA2 Leica con una cámara digital Hamamatsu controlada por un programa PCI Simple) equipados con etapas motorizadas y una lente seca de 10×/0,30 NA. Los cultivos de NC se prepararon como se describió anteriormente. Las imágenes se obtuvieron cada 5 minutos durante un período de 12 h. Para la obtención de imágenes de morfología celular, se utilizó un microscopio TCS SP8 con lentes objetivo de inmersión en agua de 63 × /0,90 NA y controlado por el software LAS–AF. Se obtuvieron imágenes de células fijas utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 63 × /1,4 NA y un microscopio confocal Leica TCS SPE controlado por el software LAS–AF.

Para localización de constructos o niveles de FI endógenos, se analizaron 10-15 CCN para cada condición por experimento.

Análisis de migración celular y morfología celular

El ensayo de quimiotaxis se realizó siguiendo un procedimiento normal61 utilizando perlas acrílicas de heparina (Sigma, H5263) recubiertas con 1 µg/ml de factor 1 derivado de células estromales humanas purificadas (Sigma, SRP3276). La motilidad celular y la quimiotaxis se analizaron con herramientas de análisis ImageJ (https://imagej.nih.gov), como se describió previamente53, 60. En resumen, cada celda individual fue rastreada manualmente usando el complemento de Seguimiento Manual de ImageJ, los datos fueron recopilados y analizados usando el complemento de Quimiotaxis de ImageJ. La morfología celular se evaluó mediante el despliegue del índice de circularidad (círculo completo = 1) y se estimó mediante herramientas de análisis ImageJ. La dispersión celular se analizó utilizando el algoritmo de triangulación de Delaunay (Complementos ImageJ) y se trazó como área promedio del triángulo explante, como se describió anteriormente 54. Se analizó el área de protuberancia celular en las células de la cresta neural en el borde de un explante midiendo el área de crecimiento que se deriva de dos marcos de tiempo consecutivos con un intervalo de tiempo de 4 minutos; estos dos marcos consecutivos se restaron para generar la nueva zona12. Para el análisis de quimiotaxis celular y dispersión celular se analizaron 10-15 explantes por condición para cada experimento independiente. Para la motilidad celular, se analizaron la morfología celular y las protuberancias celulares 15-25 CCN por condición y experimento.

Biología molecular, plásmidos y reactivos

Para la síntesis de ADNc, se aisló ARN total de 10-15 embriones en las etapas 23-24 o 10-15 caps de animales en la etapa 8 de X. laevis por condición para cada experimento independiente y se utilizaron tres réplicas técnicas dentro de cada experimento25. Quantitative PCR (qPCR) was performed on an Applied Biosystems ABI 7900HT machine using the Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, 4385612) and the following primers: ef-1 forward 5′- ACCCTCCTCTTGGTCGTTT-3′, ef-1 reverse 5′-TTTGGTTTTCGCTGCTTTCT-3′15, ncad forward 5′-CAGGGACCAGTTGAAGCACT-3′, ncad reverse 5′-TGCCGTGGCCTTAAAGTTAT-3′62. n-cad mRNA expression was plotted as relative expression normalized against the housekeeping gene ef-1.

Plasmids: Cx43 constructs were synthesized using the X. laevis Cx43 sequence from cDNA clone (UniGene ID XL.1109) como plantilla. Cx43 (Cx43FL, aa 1-379), Cx43 construcción truncada terminal carboxi (Cx43Trunc, aa 1-212) y Cx43-20k (Cx43Tail, aa 213-379) se clonaron en vectores pCS2+ o PCS2-EGFP de 5’BamHI/3’XhoI. El vector pCS2-EGFP fue amablemente proporcionado por el Dr. Masa Tada. La construcción inducible de Cx43Tail se preparó fusionando el Cx43-20kTail (aa 219-379) con el dominio de unión de ligandos del GR humano (aa 512-777). Cx43 – 20k fue clonado en 5 ‘ EcoRI/3’SACI y GR en 5’SacI/3’XhoI de pCS2+ y pCS2-EGFP. Las construcciones BTF3 se sintetizaron usando la X. secuencia de laevis del clon de ADNc (ID UniGene XL. 3536). BTF3FL (aa 1-162) se clonó en 5 ‘ EcoRI/3’XhoI de pCS2+ o pCS2-EGFP. La construcción de eliminación BTF3 que carecía de la región NLS RRKKK (BTF3-dNLS, aa 1-158) se clonó en 5’BamHI/3’ClaI de pCS2+. Para los experimentos BiFC (Fig. 4b, c), Cx43Tail y Cx43Trunc fueron clonados en 5’BamHI/3’BamHI de pCS2-VC155. BTF3FL fue clonado en 5’BamHI/3’BamHI de pCS2-VN9m. Los vectores BiFC fueron proporcionados amablemente por el profesor James C. Smith. Todas las secuencias de construcción se verifican mediante secuenciación automatizada de ADN (Source Biosciences, Reino Unido). When required, plasmids were linearized and mRNA transcribed as described before25, using sp6MessageMachine (Ambion). The mRNA constructs injected were: membrane GFP (mGFP, 300 pg), membraneRFP (mRFP, 300 pg) nuclearRFP (nRFP, 300 pg), lifeactin-GFP (400 pg), N-cadherin-GFP (500 pg), Cx43FL (500 pg), Cx43Trunc (500 pg), Cx43-20k (500 pg), BTF3FL (500 pg), BTF3-dNLS (500 pg), Cx43-20k-VC (500 pg), Cx43Trunc-VC (500 pg), and BTF3-VN9m (500 pg). The following plasmids were injected as DNA: pcDNA3.2-Cx43-HA (800 pg/embryo,22); pcDNA3.2-Cx43-ML-HA (800 pg/embryo;22); ΔΜ213 Cx43 (800 pg / embrión,63).

Todos los análisis de constructos fluorescentes se evaluaron normalizando la fluorescencia de fondo y, cuando fue necesario, la fluorescencia del área celular total.

Se utilizaron los siguientes reactivos: ácido flufenámico (50 µM para incubación de explante NC −100 µm para tratamiento embrionario, Sigma, F9005), ácido meclofenámico (50 µM para incubación de explante NC −100 µm para tratamiento embrionario, Sigma, M4531), actinomicina D (20 µM, Sigma, A1410), CHX (10 µM, Sigma, C7698) y dexametasona disuelta en etanol (10 µM) se agregaron al medio de cultivo en etapas 14-15 y se mantiene hasta las etapas embrionarias migratorias de la cresta neural (etapa 23). Para controlar la posible fuga de quimeras inducibles, se cultivó un lote de embriones de hermanos sin dexametasona y se procesó para hibridación in situ. Para la prueba de acoplamiento (prueba de la actividad del canal de unión de separación), se analizaron 10-15 CCN por condición y experimento.

Inmunoprecipitación, fraccionamiento y western blotting

Para cada condición se utilizaron 10-15 embriones para la preparación de lisados embrionarios por experimento. Se prepararon embriones enteros para western blot después de la homogeneización en tampón de lisis (20 mm Tris, 100 mm NaCl, 0,01% Triton-X, pH 8,0) con inhibidores de proteasa añadidos (Roche, 11836153001) e inhibidores de fosfatasa (Roche, 04906837001)54,64. Para los western blots, se utilizaron los siguientes anticuerpos: Connexin 43 (Sigma, C6219, 1:1000), N-cadherin (DSHB, clone MNCD2, 1:800), E- cadherin (DSHB, clone 5D3, 1:1000), p42/44 MAPK (Cell Signaling, 9102S, 1:2000), α-tubulin (DSHB, clone 12G10, 1:1000), phospho-histone H3 (Millipore, 06579, 1:2000), GFP (Invitrogen, A11122, 1: 2000), HA-tag (Sigma H6908, 1:2000), rabbit IgG HRP-linked (Amersham ECL, NA934, 1:3000), mouse IgG HRP-linked (Amersham ECL, NA931, 1:3000) and rat IgG HRP-linked (Sigma, A9037, 1:2000). Immunoprecipitation was performed using GFP-Trap® kit (Chromotek); brevemente, las células se suspendieron en tampón de lisis y se centrifugaron a 20.000×g durante 5 minutos a 4 °C, se recuperó el sobrenadante y se ajustó el volumen con tampón de dilución. Las perlas se equilibraron en tampón de dilución y se mezclaron con el lisado de células resuspendidas. La mezcla se purificó magnéticamente y se preparó para western blot. El aislamiento de fracciones nucleares de embriones de X. laevis se realizó mediante protocolos de centrifugación diferencial con modificaciones64, 65. Brevemente, fase 18 X. los lisados embrionarios de laevis utilizan una aguja de 22 G y un tampón de homogeneización de 20 µL (HB: Sacarosa de 250 mm, Hepes de 20 mM, KCl de 10 mM, EDTA de 1 mM, EGTA de 1 mM, TDT de 1 mM, inhibidores de la fosfatasa y de la proteasa) por embrión. Todas las muestras se centrifugaron a 250 × g durante 5 minutos para eliminar los restos embrionarios. Después de recoger el sobrenadante, se distribuyó en tres tubos diferentes y se hiló a tres velocidades diferentes (400×g, 600×g) durante 5 minutos para aislar los núcleos celulares. Los sobrenadantes postnucleares se mantuvieron para su posterior procesamiento. Los pellets nucleares se lavaron una vez más en HG tampón y se centrifugaron a la velocidad adecuada (400×g, 600×g). Los pellets nucleares se resuspendieron en 40 µL de glicerol al 10%/0,1% SDS/1% Tritón-X en HB. Se agregó una cantidad adecuada de tampón de muestra a cada muestra, y las muestras se procesaron para electroforesis en gel de acrilamida y análisis de western blot. Para evitar errores de carga, la misma membrana se borró contra el control de carga después de la extracción,como se describió anteriormente 54, 64.

Los datos de Western blot se analizaron utilizando herramientas de análisis ImageJ. Se normalizaron las intensidades de imagen y la relación entre la proteína de interés y el control de carga (p. ej., Mapk o α-tubulina), se trazaron las proporciones medias. Las manchas sin recortar se incluyen como cifras suplementarias (Figs suplementarias. 5–7).

Cultivos celulares

Las células HeLa (Colecciones de Microorganismos y Cultivos Celulares del Instituto Leibniz, DSMZ, Alemania) se cultivaron en DMEM suplementado con suero fetal de ternera al 10% (Life Technologies, CA, EE.UU.) a 37 °C en una atmósfera humidificada de 10% de CO2 y se transfirieron según lo indicado utilizando Rotifect (Carl Roth, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Los fibroblastos embrionarios Xenopus (XTC, un regalo amable de Ana Losada) se cultivaron en un 67% de DMEM/H2O suplementado con un 10% de suero fetal de ternera a 25 °C en una atmósfera humidificada de 5% de CO2 y se transfirieron según lo indicado con Viafect (Promega, EE.UU.). Los plásmidos para transfección fueron los indicados y se analizaron 10-20 células Hela o XTC para cada condición por experimento.

Para los experimentos con siRNA, se transfectó una combinación de tres siRNA dirigidos contra BTF3 como se describió anteriormente. Se utilizó un siRNA estándar (codificado de Sigma) como control. El número de catálogo de estos siRNA comerciales frente a BTF3 es: SASI_Hs01_00124567; SASI_Hs02_00308337; SASI_Hs01_00124566. Las células se recolectaron 48 h después de la transfección y se procesaron para realizar experimentos de qPCR, western blot o Inmunohistoquímica. Como se describe en las secciones respectivas.

Todas las líneas celulares fueron analizadas para detectar contaminación por micoplasma.

Tinción inmunohistoquímica y faloidina

Para la detección de proteínas, se fijaron células de mamíferos o explantes de cresta neural en formaldehído al 4% en PBS-T al 0,2% (PBS + 0,2% Tritón X-100) durante 10 minutos y se bloquearon con NGS al 10% durante 1 h. Los anticuerpos primarios se incubaron a 4 °C en un 10% de NGS. Se utilizaron los siguientes anticuerpos: 1/100 anti-BTF3 (Abcam, ab107213), 2,5 µg/ml de anti-N-cadherina (Banco de Hibridomas de Estudios de Desarrollo MNCD2) y 1:100 anti-Cx43 (Sigma, C6219) en 10% NGS y se incubaron a 4 °C. Los explantes se lavaron 3 veces con PBS + 0,2% Tween-20 y se incubaron a 4 °C con anticuerpo secundario, se diluyeron a 1:350 en 10% NGS. La DAPI se diluyó a 1:1000 y se mezcló con los anticuerpos secundarios.

Espectrometría de masas

Para la coinmunoprecipitación de la cola CX43 marcada con BANDERA para análisis espectrométrico de masas, se lisaron células y se incubaron lisados durante la noche con anti-HA y se equilibraron perlas de alta afinidad a 4 °C, luego se lavaron y elutaron los inmunoprecipitados 27. Posteriormente de la elución ácida con glicina de 0,1 M pH 2,5, el pH de los eluidos se ajustó a pH 8,0 con Tris de 0,5 M. Para la digestión de proteínas, las muestras se incubaron durante la noche con 2 µg de tripsina (Tripsina Gold, Promega, EE.1 µg de Lys-C (Roche, Alemania) e incubación durante 6 h adicionales. Los péptidos se desalaron en puntas de fase invertida C-18 (Grupo Nido, EE.UU.), se secaron al vacío y se almacenaron a -20 °C hasta el análisis. Las mezclas de péptidos secos se recuperaron en ácido fórmico de 3 µl al 30% y se diluyeron con agua a 23 µl. Se inyectaron cinco µl del digerido en un sistema Nano-LC (Eksigent425 2D Nano-LC; Sciex, EE. UU.) y se separaron los péptidos mediante cromatografía de fase inversa en columnas de C-18 preparadas internamente (Reprosil-Pur C18-AQ, 1,9 µm, Dr. Maisch, Alemania, Columnas de picofrito, 75 µm i.d., New Obejctive, USA) en un gradiente lineal de 100% de eluyente A (0,1% de ácido fórmico) a 55% de eluyente B (60% de actenitrilo, 0,1% de ácido fórmico) en 120 min. El sistema LC se configuró como columna ventilada y la muestra se cargó y desalinizó a un caudal de 400 nl / min y la separación se llevó a cabo a un caudal de 200 nl/min. El sistema nano-LC se dividió en dos partes con el espectrómetro de masas (Q-Exactive HF, Thermocientific, Alemania) que se operaba en modo dependiente de datos. La interpretación de los datos se realizó con Mascot V2.2 (Matrixscience, Reino Unido) y Progenesis LC–MS V4.1 (Dinámica No lineal, Reino Unido). La interpretación de los datos se realizó con MaxQuant V1.6.1.0 y Perseus V1.6.1.3 (MPI de Bioquímica, Alemania).

Ensayo de acoplamiento

La comunicación intracelular de unión de huecos se probó utilizando un ensayo de acoplamiento de tinte. Aquí se utilizó el colorante fluorescente Calceína-AM (Sigma, 17783). Una población de cresta neural disecada de embriones no inyectados se incubó con el tinte Calceína-AM durante aproximadamente 10 minutos o hasta que el tinte se cargó en todas las células. Otra población de cresta neural de embriones inyectados con un marcador nuclear (inyecciones de ARNm de pFNR, ver más arriba) se diseccionó por separado. Después de que las dos poblaciones se disociaron en ausencia de calcio y magnesio, se mezclaron e incubaron durante 1 h a 14 °C en un tubo de ensayo. Después de la centrifugación suave, los explantes de la cresta neural se cortaron en piezas de tamaño similar y se cultivaron como se describió anteriormente y luego se filmaron. Para probar la actividad del canal de las uniones entre huecos, se utilizaron bloqueadores de uniones entre huecos; ácido meclofenámico (Sigma, M4531) y ácido flufenámico (Sigma, F9005). La comunicación celular se evaluó mediante la estimación de la relación entre el número de células que muestran ambos marcadores, el marcador nuclear y la calceína, y el número total de células que tienen el marcador nuclear.

Análisis estadístico

La estimación del tamaño de la muestra se realizó siguiendo trabajos publicados previamente y no se utilizó un método estadístico específico. Los experimentos no fueron aleatorizados y, debido a la naturaleza de los experimentos, los autores no estuvieron ciegos a la asignación durante los experimentos y el análisis de los resultados. Solo se analizaron embriones viables y explantes. No se incluyeron embriones mal inyectados para experimentos de hibridación in situ. La inyección correcta se determinó mediante la inyección de trazadores lineales. Nuestros parámetros experimentales se midieron al azar una vez que se seleccionaron embriones viables y adecuadamente inyectados.

La comparación de porcentajes se realizó mediante tablas de contingencia66. La normalidad de los conjuntos de datos se probó con la prueba de Kolmogorov–Smirnov, la prueba de d’Agostino y Pearson y la prueba de Shapiro–Wilk con Prism6 (GraphPad). Los conjuntos de datos que seguían una distribución normal se compararon con la prueba t de Student (varianzas desiguales de dos colas) o ANOVA con comparaciones múltiples de Dunnett después de la prueba utilizando Excel o Prism6 (GraphPad). Los conjuntos de datos que no seguían una distribución normal se compararon utilizando la prueba de Mann Whitney o una ANOVA no paramétrica (Kruskal Wallis con comparaciones múltiples de Dunn después de la prueba) utilizando Excel o Prism6. Las comparaciones cruzadas se realizaron solo si el valor total de p del ANOVA era inferior a 0,05. En todas las leyendas de figuras N = número de experimentos independientes; n = tamaño total de la muestra.

X. identificación parcial del promotor de n-cadherina de laevis

Para identificar el promotor básico de Xenopus n-cad se utilizó la siguiente estrategia. La región promotora básica de genes de n-cadherina de pollitos y mamíferos se ha descrito en las regiones 5′-UTR, dentro de la posición -3000 a -1 pb respecto al sitio de iniciación de traducción41,67. Utilizando el recurso del Proyecto Genoma de X. laevis (https://xenopus.lab.nig.ac.jp/) identificamos una región de 2800 pb en el 5′-UTR del gen de N-cadherina de X. laevis (Suplemento Fig. 4). Dado que nuestros datos indican que Cx43Tail, BTF-3 y Pol II forman un complejo, utilizamos ElemeNT tool68 para buscar cajas de TATA potencialmente activas en la región que aislamos. Nuestro análisis in silico revela una región rica en cajas de TATA entre las posiciones -166 a -618 pb, en relación con el sitio de inicio de la traducción (Fig. 4). Finalmente, diseñamos cebadores superpuestos para amplificar fragmentos de 200 bp en esta región. Las secuencias de cebadores se enumeran en la sección ChIP y sus regiones de unión se resaltan en la Fig.Suplementaria. 4.

Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)

Para la inmunoprecipitación de cromatina (ChiP), se siguió un procedimiento estándar para los embriones de X. laevis69,70. Para cada experimento independiente se utilizaron dos réplicas técnicas y 250-300 embriones Xenopus por condición. Brevemente, los embriones de neurula stages X. laevis se fijaron durante 15 min y se utilizaron 3 µg de anticuerpo Pol II (Diagenode, C15100055) o anticuerpo de grado ChIP GFP (Abcam, ab290). Para la extracción de ADN seguimos un protocolo normal69, 70. Usando el recurso de análisis de elementos, buscamos cajas de TATA putativas en la X. laevis n-cad promoter region (Supplementary Fig. 4). Primers flanking these TATA boxes were designed to analyze ChiP samples by PCR. PCR was performed using the following protocol 95 °C for 30 s, 56 °C for 40 s, and 72 °C for 30 s for 32 cycles. Primers used for ChiP-PCR were:

P5F: 5′-CTTCCAAGAGATGAAGCTCATAT-3′,

P5R: 5′- AACACTCTATATGGCAGATAAC-3′,

P6F: 5′-CCTTTAAATGCATACACTTACC-3′,

P6R: 5′-ACAGAAAAAGCATTTGCTTCCT-3′,

P7F: 5′-CAATCAGATCCTTATATGTCCC-3′,

P7R: 5′ – GCCAAGTTTTCCCTTTTGTTGT-3′,

P8F: 5′ – GGAAGCAAATGCTTTTTTCTGTC-3′,

P8R: 5 ‘- AGTCTGCTTTAGGAGACAACG-3 ‘

y sus puntos de unión relativos se muestran en la Fig. Suplementaria. 4b. Los experimentos con ChIP se cuantificaron de la siguiente manera: se promedió la relación normalizada de intensidad de banda para cada condición y se calculó el aumento de pliegues respecto al control de IgG y se trazó como enriquecimiento de pliegues. La intensidad de la banda se registró utilizando el complemento ImageJ Gels analysis. Los geles sin recortar se muestran en la Fig. 7c, d.