Refinar el filo Chlorobi resolviendo la filogenia y el potencial metabólico del representante de un linaje profundamente ramificado y sin cultivar
Reconstrucción genómica de NICIL-2
Análisis de composición de comunidad microbiana de consorcios bacterianos termofílicos adaptados para crecer en sustratos de biomasa (celulosa, xilano y pasto conmutador) como su única fuente de carbono a 60 °C identificó consistentemente un OTU97 que estaba lejanamente relacionado con miembros cultivados del filo Chlorobi(Eichorst et al., 2013, 2014). Para comprender la filogenia y el potencial metabólico de la población representada por este OTU97, se realizó la secuenciación metagenómica de un consorcio adaptado para crecer en pasto conmutador pretratado líquido iónico, en el que abundaba el OTU97 relacionado con el Clorobi. Ensamblaje (ver Materiales y métodos) y binning automatizado (Wu et al., 2014) del metagenoma de este consorcio se obtuvieron 20 contenedores genómicos (Tabla Suplementaria S3), de los cuales los contenedores más abundantes fueron una población estrechamente relacionada con la cepa de Chitinophagaceae NYFB (61,8%), que se aisló de un enriquecimiento relacionado cultivado en celulosa (Eichorst et al., 2013), y el bin relacionado con el Clorobi (23,1%). Los contenedores presentes en > 1% incluyeron múltiples poblaciones no cultivadas agrupadas con Paenibacillaceae (contenedores 003 y 006), una población no cultivada agrupada con Verrucomicrobia subdivisión 3 (contenedor 004) y una población estrechamente relacionada con Thermobipora bispora (contenedor 005), un termófilo actinobacteriano.
El contenedor relacionado con Chlorobi se llamó NICIL – 2 (para el Líquido Iónico de abono de Newby Island, 2o en abundancia). El análisis de las proteínas predichas a partir del genoma de NICIL-2 fue consistente con su identificación como una población lejanamente relacionada con miembros del superfilo del FCB, siendo los Bacteroidetes (33%) y la Ignavibacteria (15,7%) los que tenían las secuencias de proteínas más estrechamente relacionadas (Figura 1). El borrador del genoma de NICIL-2 recuperado era relativamente pequeño (2,67 Mbps) y casi completo (95,3%; 102 de 107 genes marcadores de copia única en 152 andamios). La longitud N50 para el borrador del genoma de NICIL-2 fue de 168 929 pb y el contig más grande fue de 1.1 MB, lo que sugiere que la mayoría de los andamios representaban un ensamblaje de alta calidad (Tabla 1).
La distribución del linaje mejor adaptado para todas las proteínas NICIL – 2. Los porcentajes se estiman dividiendo los recuentos de proteínas que coinciden con cada linaje contra el número de todas las proteínas NICIL – 2. Consulte Materiales y métodos para obtener más detalles.
Análisis filogenético de NICIL-2
Se recuperó un gen ARNr 16S (1451 pb) del genoma borrador de NICIL-2. El ribotipo más estrechamente relacionado con el gen 16S rRNA de NICIL-2 (> 99% idéntico) se secuenció a partir de un clon fosmid (JFF029_06) recuperado de una corriente térmica (70 °C) en una secuencia de mina de oro japonesa (Nunoura et al., 2005). Los genes del ARNr 16S de representantes cultivados de Bacteroidetes y Clorobi fueron < 85% idénticos a la secuencia NICIL-2. Un árbol filogenético construido mediante la alineación de secuencias génicas de ARNr 16S relacionadas con NICIL-2 demostró que el linaje que contenía NICIL-2 era distinto de los Bacteroidetes y Clorobi (Figura 2). El linaje NICIL-2 contenía dos líneas de descenso basadas en la temperatura del ambiente de muestreo. El grupo de alta temperatura (representado en rojo en la Figura 2) incluyó ribotipos recuperados principalmente de ambientes de alta temperatura que oscilaban entre 55 °C y 80 °C, como el clon OPB56 (Hugenholtz et al., 1998). El segundo grupo incluyó ribotipos recuperados principalmente de ambientes de temperatura moderada que oscilaban entre 20 ° C y 32 °C (representado en verde en la Figura 2). Dado que OPB56 fue el primer clon descubierto que está afiliado a este cluster filogenético, el linaje que contiene NICIL-2 se conoce como el clado OPB56. En la Figura suplementaria S1 se muestra una vista ampliada del árbol genético del ARNr 16S.
El árbol filogenético de máxima probabilidad construido para el nuevo linaje NICIL-2 utilizando el gen de ARN ribosómico 16S. El clado más cercano a la especie NICIL-2 era de un fosmido aislado de una mina de oro japonesa(Nunoura et al., 2005). Los rangos de temperatura de las especies se determinaron a partir de la literatura asociada con cada número de adhesión de NCBI. La temperatura de los habitantes de las especies estaba marcada por rojo (>55 °C), verde (20-32 °C) o negro (indeterminado). La barra de escala denota 0,05 cambios por sitio de nucleótido. Los detalles para la construcción de árboles se proporcionan en Materiales y métodos. El árbol filogenético expandido que muestra todos los nodos se puede encontrar en la Figura suplementaria S1. Una versión a todo color de esta figura está disponible en el ISME Journal en línea.
Para establecer la afiliación filogenética de NICIL-2 y el clado OPB56 de forma más completa, se obtuvieron secuencias de proteínas ribosómicas adicionales a partir de datos recuperados de muestras naturales. Se encontraron homólogos de 22 genes ribosómicos conservados en NICIL-2 en dos clones de fosmidos de manantiales termales japoneses (JFF029_C06 y JFF027_B02). Este conjunto de 22 proteínas ribosómicas se utilizó para buscar conjuntos de datos metagenómicos de entornos de alta temperatura. Se identificaron conjuntos completos de estos genes ribosómicos conservados en cuatro conjuntos de datos metagenómicos obtenidos de entornos de alta temperatura. El binning automatizado de estos conjuntos de datos recuperó seis genomas borrador casi completos (> 90% completos) que contenían secuencias para las 22 proteínas ribosómicas conservadas en el genoma de NICIL-2 y los clones de fosmid de la mina de oro japonesa (Tabla Suplementaria S4). Cinco de las seis secuencias de proteínas concatenadas se agruparon en el linaje OPB56 con NICIL-2, mientras que una de las secuencias de Yellowstone Fairy Falls se agrupó con la Ignavibacteria (Figura 3a). Este árbol filogenético demostró que la Clorobea, Ignavibacteria y OPB56 formaban un clado monofilético con alta confianza (97%). Los Bacteroidetes formaron un grupo distinto, y la familia Rhodothermaceae, cuya afiliación con los Bacteroidetes ha sido cuestionada (Nolan et al., 2009), estaban afiliados a los Bacteroidetes con alta confianza (>80%). Se construyó un segundo árbol filogenético mediante la concatenación de una alineación de 86 genes de copia única compartidos entre Bacteroidetes, Clorobi y Fibrobacter (Figura 3b). Este árbol reprodujo la topología observada para el gen construido a partir de los 22 genes ribosómicos, apoyando aún más la afiliación de la Clorobea, Ignavibacteria y OPB56.
El árbol filogenético de máxima verosimilitud construido para el nuevo linaje NICIL-2 utilizando (a) 22 proteínas ribosómicas y (b) 86 proteínas de copia única compartidas entre grupos de Bacteroidetes, Clorobea, Ignavibacteria, OPB56 y Fibrobacter. La barra de escala denota 0,1 cambios por sitio de aminoácidos. Los detalles para la construcción de árboles se proporcionan en Materiales y métodos.
Un enfoque complementario para comprender las relaciones evolutivas entre Bacteriodetes y Clorobios ha sido identificar indels en proteínas conservadas (Gupta y Lorenzini, 2007). Las inserciones en la ADN polimerasa III (28 aa) y la alanil-ARNt sintetasa (12-14 aa) que se conservan entre el GSB y están ausentes entre los bacteriodetos se atribuyeron como características del filo Chlorobi. Las alineaciones de estas dos proteínas (Figuras Suplementarias S2 y S3) indican que la inserción de ADN polimerasa III en las secuencias de proteínas GSB no está presente en las proteínas predichas de los genomas Ignavibacterias y NICIL-2, mientras que 2-3 aminoácidos de la inserción en las secuencias de alanil-ARNt sintetasa de GSB se conservan en las secuencias de proteínas Ignavibacterias y NICIL-2.
Reconstrucción metabólica de NICIL-2
La fisiología de NICIL-2 se inferió por la reconstrucción metabólica y su potencial metabólico en comparación con representantes de GSB (Chlorobaculum tepidum), Bacteroidetes (Rhodothermus marinus y Salinbacter ruber) e Ignavibacteria (Ignavibacterium álbum y Meliobacter roseus). Genes que codifican proteínas relacionadas con la fotosíntesis, incluidos los homólogos de C. las subunidades del centro de reacción fotosintética de tepidum (CT1020, pscB, psC, pscD), las proteínas de envoltura de clorosoma (csmABCDEFHIJX) y las proteínas bacterioclorofila a (fmoA), están ausentes en todos los otros genomas, distinguiendo el GSB en este conjunto comparativo (Eisen et al., 2002). En la Figura 4 se presenta un resumen visual de la reconstrucción metabólica. Para obtener información completa sobre los genes, los números de las casillas y las abreviaturas, véanse las Tablas suplementarias S5 y S6.
Metabolismo reconstruido de NICIL-2 inferido del genoma reensamblado. Para obtener información completa sobre los genes, los números de las casillas y las abreviaturas, véanse las Tablas suplementarias S5 y S6. El texto rojo representa enzimas o vías biosintéticas que faltan en el genoma. Las flechas azules, verdes y moradas indican el flujo de ATP, NADH y NADPH, respectivamente.
Metabolismo del carbono
El genoma de NICIL – 2 codifica un conjunto completo de genes para la glucólisis, el ciclo de TCA y la gluconeogénesis (Figura 4). Los genes para el ciclo rTCA, que están presentes y expresados para la fijación autotrófica de carbono en el GSB, están ausentes. Además, la presencia de genes que codifican cofactores que contienen ácido lipoico en los complejos piruvato deshidrogenasa y α-cetoglutarato deshidrogenasa sugiere que el ciclo de TCA funciona en la dirección oxidativa. La mayor parte del ciclo de rTCA ha sido reconstruido en R. marinus e I. album, que incluye múltiples piruvato-ferredoxina oxidorreductasas y α-cetoglutarato-ferredoxina oxidorreductasas, dos enzimas necesarias para el ciclo rTCA. Los genomas de I. album y R. marinus carecen de citrato liasa dependiente de ATP, una enzima crítica para completar el ciclo de rTCA (Buchanan y Arnon, 1990). Se ha propuesto que I. album puede usar una citrato liasa independiente de ATP para funcionar en el ciclo de rTCA, aunque esta afirmación no se ha probado experimentalmente y ni I. album ni R. marinus han demostrado crecer autotróficamente (Liu et al., 2012a).
A pesar de su alta abundancia relativa en cultivos adaptados que crecen en biomasa vegetal, el NICIL-2 tenía una capacidad enzimática sorprendentemente limitada para deconstruir biomasa compleja. La comparación del potencial metabólico para la hidrólisis de polisacáridos entre los 20 contenedores extraídos del metagenoma del enriquecimiento de pasto interruptor pretratado demostró que NICIL-2 tiene relativamente menos genes para la deconstrucción de celulosa y hemicelulosa en comparación con otros miembros de la comunidad microbiana (Figura Suplementaria S4). En particular, la cepa NYFB, la población verrucomicrobial y los Firmicutos grampositivos múltiples tienen repertorios más extensos de genes para la hidrólisis de polisacáridos. La inspección adicional de los genomas reconstruidos afiliados a OPB56 a partir de muestras naturales de alta temperatura demostró que la falta de genes para la hidrólisis de polisacáridos era común a este clado. Entre los genomas agrupados con los Bacteroidetes y Chlorobi, R. marinus, M. el contenedor de piscina de Obsidiana de roseus y Yellowstone 062, que se agrupa con la Ignavibacteria, poseía un extenso repertorio de hidrolasas de glucósidos para deconstruir la biomasa vegetal. Estos análisis sugieren que NICIL-2 y miembros relacionados del clado OPB56 probablemente no están involucrados en la deconstrucción primaria de la biomasa en la comunidad adaptada y los ambientes naturales. Es concebible que el NICIL-2 pueda crecer en monómeros u oligómeros de azúcar; sin embargo, solo se identificó un gen transportador de disacáridos predicho en el genoma.
Aunque la selección de NICIL-2 se realizó en condiciones aeróbicas, puede poseer la capacidad de fermentación. Los genes para la producción fermentativa de etanol están presentes (a través de la alcohol deshidrogenasa, EC 1.1.1.1), mientras que los genes para el formiato (a través de la piruvato formiato liasa, EC 2.3.1.54), el lactato (a través de la lactato deshidrogenasa, EC 1.1.1.27) y el propionato (a través de la metilmalonil-COA carboxil transferasa, 2.1.3.1) están ausentes. El genoma de NICIL – 2 codifica un gen para la fosfotransacetilasa (EC 2.3.1.8), pero no para la acetato quinasa (EC 2.7.2.1), ambos necesarios para la producción de acetato fermentativo. Tanto I. album como M. roseus contienen genes para la producción de lactato y acetato, mientras que C. tepidum no lo hace.
Metabolismo de nitrógeno y azufre
Se detectaron genes para la asimilación de amonio, glutamina sintasa (EC 6.3.1.2) y glutamato sintasa (EC 1.4.1.13) en el genoma de NICIL-2. Sin embargo, no se identificaron genes para la reducción de nitratos diferentes, la reducción de nitratos asimilables, la desnitrificación, la fijación de nitrógeno y la nitrificación. C. tepidum codifica los genes nif necesarios para la fijación de N2, mientras que M. roseus (Kadnikov et al., 2013), I. album (Liu et al., 2012a)y R. marinus (Nolan et al., 2009) no. C. tepidum es un oxidante de azufre obligado y, por lo tanto, puede oxidar sulfuro, tiosulfato, sulfito y azufre elemental. C. tepidum oxida preferentemente sulfuro a azufre elemental, luego azufre elemental y tiosulfato a sulfato (Chan et al., 2008). Además, el sulfito puede oxidarse cuando se suministra en el medio de crecimiento, pero no puede sostener a C. tepidum como único donante de electrones (Rodríguez et al., 2011). NICIL-2, I. album, M. roseus and R. el marinus carece de todos los genes necesarios para la oxidación de compuestos de azufre reducidos.
Biosíntesis de aminoácidos
Al genoma de NICIL-2 le faltan muchos genes clave para la biosíntesis de aminoácidos. Las vías completas están codificadas para alanina, arginina, asparagina, aspartato, β-alanina, glutamato, glicina, lisina y metionina. NICIL-2 carece de ilvC y leuABCD y, por lo tanto, posee vías incompletas para la biosíntesis de valina, leucina e isoleucina. Del mismo modo, la I. el genoma del álbum carecía de todos los genes necesarios para la biosíntesis de valina, leucina e isoleucina a partir del piruvato, excepto la amino transferasa de cadena ramificada (ilvE), mientras que M. roseus y C. tepidum contienen vías completas. Ni NICIL-2 ni I. album codifican los genes necesarios para la biosíntesis de prolina a partir de glutamato (proBAC), mientras que tanto C. tepidum como M. roseus lo hacen. El gen serbio para la biosíntesis de la serina falta en NICIL-2, I. album, M. roseus, y se encuentra en algunos GSB, incluyendo C. tepidum. El NICIL – 2 también puede usar aminoácidos como sustratos de crecimiento. Complete degradation pathways are present for branched-chain amino acids (leucine, isoleucine and valine), similar to pathways observed in ‘Candidatus Thermochlorobacter aerophilum’ (Liu et al., 2012b).
Electron transport
The major electron transport chain components were identified in the NICIL-2 genomes including: NADH:ubiquinone oxidoreductase (Complex I, EC 1.6.5.3), membrane-bound succinate dehydrogenase (Complex II, EC 1.3.5.1), quinol-oxidizing alternative Complex III (ACIII) (Yanyushin et al., 2005; Pereira et al., 2007), several cytochrome c oxidases (Complex IV, EC 1.9.3.1) and an F-type H+-transporting ATPase (Complex V, EC 3.6.3.14). NICIL-2 contains one complete set of genes for NADH:ubiquinone oxidoreductase (14 subunits, nuoABCDEFGHIJKLMN), although they are not assembled in one operon (Supplementary Figure S6). En cambio, la mayoría de los genes están dispuestos de forma independiente a lo largo del andamio NICIL-2 más grande (nuoGHI, nuoJK, nuoF, nuoD, nuoE y nuoMN), y los genes restantes se encuentran en tres andamios más pequeños (nuoAB, nuoL y nuoC), lo que indica que la ausencia de una estructura operónica no es un artefacto de ensamblaje. C. tepidum contiene un conjunto de genes que codifican para la NADH: ubiquinona oxidorreductasa que carece de nuoEFG (11 subunidades). I. album y M. roseus contienen dos conjuntos de nuoABCDHIJKLMN y un conjunto de nuoEFG cada uno (Figura suplementaria S6). Curiosamente, el complejo I de NICIL-2 está más estrechamente relacionado con los de Rhodothermus marinus y Salinibacter ruber de los Bacteroidetes, los cuales contienen un conjunto completo de genes para NADH:ubiquinona oxidorreductasa (Figura 5a). También se identificaron homólogos para las 11 subunidades del Complejo I en los seis contenedores relacionados con el NICIL-2 recuperados de Yellowstone y Great Boiling Spring, y un conjunto concatenado de estas secuencias de proteínas agrupadas con las secuencias de NICIL-2.
Árboles proteicos concatenados sin enraizar vecinos del Complejo I (a) y Complejo alternativo III (b). Los números entre paréntesis indican el número de subunidades utilizadas para construir el árbol. La barra de escala denota x cambios por sitio de aminoácidos.
La ACIII es una nueva clase de oxidorreductasas de membrana bacteriana que se encuentran en organismos que a menudo carecen del complejo bc1 (Yanyushin et al., 2005). El ACIII de R. marinus (Pereira et al., 2007; Refojo et al., 2013) y la bacteria fototrófica anoxigénica filamentosa Chloroflexus aurantiacus (Gao et al., 2009, 2013) ha sido purificado y estudiado. Recientemente, se encontró un gran número de grupos de genes que codifican para subunidades ACIII, con variaciones en la constitución y organización, en un rango de genomas bacterianos (Refojo et al., 2013). Por ejemplo, R. marinus contiene los genes actABCDEF en un operón que codifica seis subunidades ACIII; los homólogos de este grupo de genes se han identificado en múltiples miembros de los Bacteroidetes (Thiel et al., 2014). Un árbol filogenético representa la relación de ACIII de NICIL-2 con sus parientes más cercanos (Figura 5b). Los GSB no poseen ACIII y por lo tanto no están representados en este árbol. Sin embargo, ‘ Candidatus Thermochlorobacter aerophilum, que no es miembro del GSB, codifica un ACIII que probablemente funciona en la respiración aeróbica (Liu et al., 2012b). Es importante tener en cuenta que tanto I. album como M. roseus son únicos entre este conjunto de ACIII, ya que contienen cinco subunidades, con las subunidades actDE identificadas como una proteína de fusión. Un complemento completo de genes que codifican para todas las subunidades ACIII, que se recuperaron de dos contenedores genómicos relacionados con el NICIL-2 de los metagenomas de Yellowstone, se encontró que contenían la fusión actDE y se agruparon con I. album y M. roseus. NICIL – 2 no contiene esta fusión y los genes de su complejo ACIII están más estrechamente relacionados con R. marinus y S. ruber.
Los aceptores de electrones terminales de NICIL-2 incluyen una citocromo c oxidasa tipo aa3 (Complejo IV) y posibles alternativas de citocromo c oxidasas, anotadas como CoxMOP. Es poco probable que el NICIL-2 sea microaerofílico porque no se detectaron oxidasas de tipo cbb3 en el genoma. Además, no se detectó el citocromo bd. Para comparación, los genomas de I. album y M. roseus contienen genes para la citocromo c oxidasa tipo cbb3 y un complejo citocromo bd.
El genoma de NICIL – 2 contiene un conjunto incompleto de genes masculinos para la síntesis de menaquinona. Una vía biosintética completa de menaquinona contiene menFDHCEBAG (Bentley y Meganathan, 1982) y el genoma de NICIL-2 solo incluye menBAG. Para comparación, C. tepidum e I. el álbum contiene caminos completos para hombres, mientras que los genomas de M. roseus y R. marinus tienen anotaciones para todos los genes requeridos, excepto MenB y menH, respectivamente. Homólogos de genes que codifican enzimas de la vía biosintética alternativa de la menaquinona, la vía futalosina (Arakawa et al., 2011), no fueron detectados en NICIL-2. Los genes biosintéticos de ubiquinona también están ausentes. El genoma de NICIL-2 puede tener una cobertura incompleta en esta área y se pueden encontrar genes masculinos adicionales con un genoma completamente ensamblado. Alternativamente, NICIL – 2 puede participar en el intercambio de quinona con otros miembros de la comunidad, como se observó para el consorcio fototrófico ‘Chlorochromatium aggregatum’ (Liu et al., 2013).
Flagelos y quimiotaxis
Los genes que codifican proteínas para el cuerpo basal, el gancho y el ensamblaje de filamentos están presentes en el genoma de NICIL-2. Sin embargo, el NICIL-2 carece de genes que codifican la maquinaria de quimiotaxis, aparte de una proteína reguladora, CheY. Los GSB son considerados no móviles y carecen de quimiotaxis y flagelos, mientras que I. album, M. roseus y R. marinus tienen maquinaria flagelar y quimiotaxis.
