Síntesis de Colágeno
La regulación de la Síntesis de Colágeno Óseo
La síntesis de colágeno en cultivos de órganos de calvarias de roedores y cultivos celulares se ha evaluado utilizando varios ensayos diferentes . En el ensayo más utilizado, las calvarias y las células se incuban con prolina radiomarcada durante varias horas antes del final del cultivo. La incorporación de prolina radiomarcada en proteína digestible de colagenasa (etiquetado CDP) y proteína no colágena (etiquetado NCP) se mide en extractos de cultivos que utilizan colagenasa bacteriana altamente purificada . El porcentaje de síntesis de colágeno se calcula a partir de los valores de CDP y NCP después de corregir la mayor abundancia de prolina en el colágeno en relación con las proteínas no colágenas . La producción de colágeno también se puede determinar midiendo el contenido de hidroxiprolina de cultivos de células u órganos, ya que la hidroxiprolina es prácticamente única para los colágenos. Estos métodos no distinguen entre diferentes tipos de colágeno fibrilar. Sin embargo, el colágeno sintetizado por los cultivos de órganos óseos y la mayoría de los cultivos de células osteoblásticas es en gran medida de tipo I (>95%), por lo que el valor de etiquetado de CDP generalmente refleja la síntesis de colágeno de tipo I. Si se desea, la producción de diferentes tipos de colágeno se puede distinguir por cromatografía de intercambio iónico y electroforesis en gel de poliacrilamida de extractos radiomarcados de cultivos de células u órganos . La expresión de colágeno de tipo I en cultivos de células humanas también se ha evaluado midiendo la secreción del propéptido C-terminal del procolágeno I. Por último, se han utilizado sondas de ADNc específicas en blotting Norte y cebadores alélicos específicos en ensayos de reacción en cadena de polimerasa-transcriptasa inversa para evaluar la expresión de ARNm de colágeno en modelos óseos. La medición del efecto de 1,25(OH)2D3 sobre la síntesis de colágeno y los niveles de ARNm ha dado resultados comparables utilizando estos diferentes ensayos.
1,25 (OH)2D3 inhibe la síntesis de colágeno en cultivos de órganos de calvarios fetales de rata de 21 días y calvarios neonatales de ratón, con poco o ningún efecto sobre la síntesis de proteínas no colágenas. La inhibición máxima de la síntesis de colágeno por 1,25 (OH)2D3 en calvarias de rata (alrededor del 50%) se produce a 10 nM . 1,24 R, 25 – (OH)3D3 también inhibe la síntesis de colágeno, pero es menos potente que 1,25 (OH)2D3 . 25 – (OH)D3 y 24R,25 (OH)2D3 no alteran la síntesis de colágeno por debajo de 100 nM . Los metabolitos de vitamina D inhiben la síntesis de colágeno y estimulan la reabsorción de huesos largos fetales de rata con potencias relativas similares que se correlacionan con la afinidad de los metabolitos por los RDV esqueléticos . Para determinar la selectividad celular de la inhibición de 1,25(OH)2D3 de la síntesis de colágeno, se trataron cultivos de órganos de calvarias fetales de rata con 1,25(OH)2D3 durante 22 h y luego se incubaron con prolina tritiada durante las 2 h finales de cultivo. El hueso central (osteoblastos maduros) se diseccionó libre del periostio (osteoprogenitores y fibroblastos menos maduros) y se analizaron por separado ambos compartimentos para la incorporación de prolina tritiada. 1,25(OH)2D3 disminuye la síntesis de colágeno en el hueso central, pero no en el periostio, lo que indica selectividad del efecto 1,25 (OH)2D3 para osteoblastos maduros . Utilizando un protocolo in vivo en el que se administraron a ratas recién nacidas inyecciones múltiples de prolina tritiada para marcar radiomarcar la matriz ósea recién sintetizada, se administraron 25 ng de 1,25(OH)2D3 en los días 1, 3 y 5 síntesis inhibida de la matriz ósea evaluada mediante histomorfometría de autorradiógrafos de tibia y calvaria .
1,25 (OH)2D3 también inhibe la producción de colágeno en células osteosarcoma osteoblástico de rata ROS 17/2 , 8 , células osteoblásticas primarias de rata y ratón y una línea celular de osteoblasto murino inmortalizada (MMB-1). El 1,25 (OH) 2D3 tiene un mayor efecto inhibitorio en la síntesis de colágeno tipo I durante el crecimiento en fase logarítmica de las células osteoblásticas primarias murinas que en la confluencia, tal vez porque las células proliferantes contenían más VDR . Del mismo modo, la inhibición de 1,25(OH)2D3 de la síntesis de colágeno es mayor en cultivos dispersos de células MMB-1 que tienen niveles de VDR más altos que las células MMB-1 confluentes . La inhibición de 1,25(OH)2D3 de la síntesis de colágeno es equivalente en células osteoblásticas primarias de rata dispersas y confluentes , pero el número de VDR no cambió durante el crecimiento de las células . Tomados en conjunto, estos datos muestran que el grado de inhibición de la síntesis de colágeno por 1,25(OH)2D3 está determinado en gran medida por la cantidad celular de VDR. 1,25 (OH)2D3 inhibe los niveles de ARNm de colágeno durante la fase proliferativa de cultivos a largo plazo de células osteoblásticas primarias de rata y previene la formación de nódulos óseos mineralizados por estos cultivos . Estos estudios muestran que el 1,25 (OH)2D3 inhibe la diferenciación de osteoprogenitores que forman nódulos mineralizados en cultivos celulares osteoblásticos primarios de rata . Sin embargo, la inhibición de la formación de nódulos por 1,25(OH)2D3 puede ser secundaria a la supresión de la síntesis de colágeno tipo I en los cultivos.
En contraste con los efectos inhibitorios descritos anteriormente, 1,25(OH)2D3 estimula transitoriamente la síntesis de proteínas de colágeno y no colágeno (aproximadamente el doble), que alcanza su punto máximo entre 12 y 24 h, en la línea celular osteoblástica murina inmortalizada MC3T3-E1 . En este estudio, no se informó del porcentaje de colágeno sintetizado por los cultivos (colágeno en relación con la síntesis total de proteínas); como resultado, no fue posible determinar la selectividad del efecto 1,25(OH)2D3 para la síntesis de colágeno. El 1,25 (OH) 2D3 también aumenta la expresión de colágeno en la línea celular de osteosarcoma osteoblástico humano MG-63 y en cultivos primarios de células osteoblásticas humanas . Curiosamente, el aumento de la síntesis de colágeno en 1,25(OH)2D3 en las células MG63 está bloqueado por la proteína 5 de unión al factor de crecimiento similar a la insulina, que interactúa directamente con el VDR y previene la heterodimerización con el receptor retinoide X RXR . Sin embargo, en otros estudios, se ha demostrado que el 1,25(OH)2D3 disminuye el porcentaje de síntesis de colágeno en las células MC3T3-E1 . MC3T3-E1 y MG-63 representan células preosteoblásticas que se someten a diferenciación osteogénica in vitro con ácido ascórbico; 1,25 (OH)2D3 inhibe el crecimiento celular y aumenta la expresión de osteocalcina y la actividad de la fosfatasa alcalina en ambas líneas celulares. Las células MC3T3E1, como la mayoría de las líneas celulares osteoblásticas inmortalizadas, muestran una variación fenotípica significativa . Por lo tanto, algunos de estos resultados discrepantes pueden deberse a variaciones en las células utilizadas para los experimentos. En conjunto, estos datos sugieren que el 1,25 (OH) 2D3 puede actuar como una hormona diferenciadora en las primeras células del linaje osteoblástico, lo que resulta en un aumento de la expresión de colágeno tipo I. En contraste, el 1,25 (OH) 2D3 inhibe la expresión de colágeno tipo I en osteoblastos maduros.
