Transformación del plaguicida recalcitrante clordecona por Desulfovibrio sp.86 con un cambio de la decloración con apertura de anillo a la actividad de sulfuración reductiva / Informes científicos

Aislamiento de Desulfovibrio sp.86
Análisis genómico de Desulfovibrio sp.86
Desulfovibrio sp.86 degrada la clordecona en productos de transformación conocidos, así como un compuesto inesperado que contiene azufre
Síntesis del estándar de clordecttiol y confirmación de que el producto de transformación F1 es idéntico al clordecttiol
La capacidad de Desulfovibrio sp.86 para degradar productos de transformación de clordecona
Investigación de las condiciones de incubación que conducen a la sulfuración reductora bacteriana
Relevancia ambiental de la sulfuración reductora de clordecona

Aislamiento de Desulfovibrio sp.86

Aislamiento de Desulfovibrio sp.86 se logró a partir del consorcio degradador de clordecona 865 utilizando condiciones reductoras de sulfato. Como el consorcio bacteriano 86, capaz de transformar la clordecona, se obtuvo de un medio mineral enriquecido (MM) llamado MM + 5, complementado con clordecona, se mantuvo la composición química principal, pero se modificaron los donantes y aceptores de electrones. Varias formulaciones de medios utilizados para enriquecer bacterias reductoras de sulfato utilizan ácidos orgánicos, por ejemplo,lactato,como fuentes de carbono y energía (donante de electrones) y sulfato que se utiliza como aceptor de eletrón para el crecimiento15,16, 17, 18. En este contexto, el piruvato en el medio líquido MM + fue reemplazado por lactato y se agregó sulfato (medio líquido MMD, ver sección “Métodos”). El enriquecimiento se extendió en agar MMD y las colonias bacterianas pardas en forma de vibrio (observadas bajo microscopio óptico) se purificaron más a través de dos rayas de placas adicionales (Fig. S1). Se encontró que una cepa bacteriana aislada era idéntica a Desulfovibrio sp.86 del consorcio 86 basado en identidades al 100% de sus genes 16S rRNA (1538 pb cada uno).

Análisis genómico de Desulfovibrio sp.86

El genoma completo consiste en un único cromosoma circular de 3.464.070 bp. El análisis checkm19 realizado con 61 genomas y 284 linajes indica que el genoma pertenece a la Deltaproteobacteria y que la integridad de CheckM es del 100% (falta el marcador esencial cero). El contenido promedio de G + C para el ADN es del 58,06%. Se predijeron un total de 3.342 secuencias de ADN codificante (CDSs) para el cromosoma, 4 pseudogenes y 10 ARN misceláneos (ARN misceláneo), 3 operones de ARNr y 54 genes de ARNt.

Los tres genes ARNr 16S de Desulfovibrio sp.86 son idénticos. Sus mejores éxitos de BLAST (NCBI)fueron de Desulfovibrio sp. clones de pilas de combustible microbianas como MFC63A04 (número de acceso al Genbank : FJ823865; cobertura del 98%; identidad del 99,87%)20. Un árbol filogenético utilizando el ARNr 16S disponible de bacterias cultivables confirmó las similitudes entre Desulfovibrio sp.86 y Desulfovibrio simplex DSM4141 (Genbank 16S rRNA número de acceso: NR_117110; cobertura 99%; identidad 99, 22%; secuencia genómica no disponible) (Fig. S2) 21. A nivel genómico, Desulfovibrio sp.86 ocupa el primer lugar con Desulfovibrio desulfuricans subsp. desulfuricans str. ATCC 27.774 genoma (GenBank:NC_011883). Sin embargo, Desulfovibrio sp.86 comparte solo 1,408 genes (43%) con D. desulfuricans (más del 80% de identidad de aminoácidos y 80% de cobertura de alineación). Además, las identidades promedio de nucleótidos (ANI) entre Desulfovibrio sp.86 y los genomas de Desulfovibrio secuenciados son inferiores al valor de corte ANI del 95% generalmente aceptado para la delineación de especies (Fig. S3) 22. Estos resultados indican que Desulfovibrio sp.86 es probablemente una nueva especie del filo Desulfovibrio. La presencia de dos superóxido dismutasas y un gen catalasa explica su tolerancia relativa al oxígeno. Como era de esperar, el Desulfovibrio sp.86 el genoma presenta un extenso complemento genético para el metabolismo del azufre, que abarca las vías respiratorias de azufre con fuentes inorgánicas como sulfato, sulfito, bisulfito y tetrationato como aceptores de electrones. Las fuentes orgánicas de azufre pueden ser proporcionadas por productos de fermentación de biomasa de azufre (sulfoquinovosa de lípidos sulfoquinovosil) sulfoacetato, el aminoácido sulfogénico no proteogénico taurina a través de sulfoacetaldehído o alcanosulfonatos23.

Desulfovibrio sp.86 degrada la clordecona en productos de transformación conocidos, así como un compuesto inesperado que contiene azufre

, La capacidad degradante de la clordecona del Desulfovibrio sp aislado.la cepa 86 se investigó utilizando técnicas de GC-MS (Cromatografía de Gases, Espectrometría de Masas) y LC-HRMS (Cromatografía de Líquidos, Espectrometría de Masas de Alta Resolución) en condiciones de crecimiento aplicadas con éxito para Desulfovibrio sp.86 aislamiento (medio líquido MMD). Se utilizó Na2S como reductor y se aplicó una atmósfera anaeróbica N2/H2 (98/2; V/V) utilizando un sistema de guantera. Estas condiciones de incubación llevaron a la desaparición completa de la señal de clordecona en GC–MS y LC-HRMS, y resultaron en perfiles de GC–MS y LC-HRMS TP similares a los obtenidos con Citrobacter sp.866: monohidroclordecona A1, pentacloroindeno B1, tetracloroindenos B3-B4 y ácidos policloroindecarboxílicos C1-C2 y C3-C4 (Fig. 1a, b). En el sistema de guantera, se realizaron cultivos bacterianos utilizando viales de vidrio de 100 mL con una película porosa hidrófoba para permitir el intercambio de gases y evitar la contaminación. Esta condición de incubación fue considerada como condición de “atmósfera renovada” (AR). En este sistema, la atmósfera se renovaba regularmente con N2/H2 (98/2; V/V) y la caja no estaba controlada termostáticamente, por lo que la temperatura variaba entre 25 y 33 °C. Para controlar mejor las condiciones de crecimiento y degradación, Desulfovibrio sp.se colocaron 86 cultivos en medio MMD utilizando viales de vidrio de 100 mL, sellados con septos de goma de butilo, en un horno a 30 °C. Los viales sellados se purgaron inicialmente con gas N2/H2 (98/2; V/V) para asegurar la anaerobiosis. Esta condición de incubación se consideró como condiciones de “atmósfera confinada” (CA).

Después de seis semanas de incubación con clordecona, el plaguicida ya no era detectable mediante las mismas técnicas analíticas. Concomitantemente, apareció un solo compuesto clorado desconocido llamado F1. Fue detectable solo a través de GC-MS (25,6 min) (Fig. 1c). Al igual que en los cultivos de degradación de clordecona5,6 notificados anteriormente, la transformación principal de clordecona apareció durante la fase estacionaria (Fig. 1e). Dado que no se pudo observar un pico clorado visible en las MS-LC (Fig. 1d), basamos la elucidación estructural de F1 en la interpretación de los datos de GC–MS (Fig. 1f). Suponiendo que el patrón isotópico más alto centrado en m/z 507.8 contenía el ion molecular, planteamos dos posibles fórmulas neutras para F1, C10Cl10O2H2 y C10Cl10SH2. Los fragmentos en la fuente fueron muy similares a los observados en estructuras policloradas a base de bishomocubano, incluidas la clordecona, las hidroclordeconas,el clordecol y el mirex5,6, 24. De hecho, los patrones isotópicos en m / z 201.0, 235.9 y 271.9 presumiblemente surgió de la conocida retrocyclodimerización bishomocubana en origen y correspondió a fragmentos C5 cargados positivamente. La comparación con simulaciones isotópicas limitó la posibilidad a los siguientes iones radicales: + * + * y+·, con n = 0,1. Esta última fórmula genérica bisoxigenada resultó ser muy improbable, ya que requería la presencia de una función de gema-diol o una fracción de gema-clorhidrina en el anillo ciclopentenilo que tenía que resistir las duras condiciones cromatográficas de GC (> 200 °C). En cambio, concluimos que una fracción de azufre, i. e. una función tiol, probablemente estaba presente en el policociclo bishomocubano. Propusimos para F1 la estructura representada en la Fig. 2a y sugirió el nombre de clordecthiol, el análogo de azufre del clordecol (alcohol de clordecona).

Síntesis del estándar de clordecttiol y confirmación de que el producto de transformación F1 es idéntico al clordecttiol

Para confirmar la estructura de F1, el clordecttiol estándar se sintetizó químicamente y se caracterizó completamente. Para lograr la sulfuración reductora química de la clordecona, se necesitaban dos pasos. El primero consistió en la conversión de la función gem-diol de la clordecona en equilibrio con la forma cetona correspondiente 20,25 en el análogo del azufre, es decir, la fracción gem-tiol/tiocarbonilo. Para realizar este paso, generalmente se aplican reactivos de azufre que contienen fósforo 26,27. Aquí utilizamos decasulfuro de fósforo (P4S10) también llamado reactivo de Berzelius 27,28 de acuerdo con el protocolo de Zaidi y compañeros de trabajo que sintetizaron con éxito alcanfortiol29 (Fig. 2a). El segundo paso consistió en la reducción del intermedio gema-tiol utilizando NaBH4. Después de la purificación, se obtuvo un sólido blanco con un rendimiento total del 73% (Fig. 2a). Los análisis de RMN 1D y 2D confirmaron la estructura del clordectiol: (i) dos señales de 1H integradas cada una para un protón y acopladas entre sí (δ 3,78 ppm, d, J = 5,5 Hz y δ 2,01 ppm, d, J = 5,5 Hz), con la de δ 3,78 ppm correlacionada con una señal de 13C desplazada hacia abajo (δ 55,1 ppm) en el experimento HSQC que explica perfectamente la fracción CH junto a la función tiol y (ii) un total de seis señales visibles de 13C que reflejan el plano de simetría conservado en la actual estructura bishomocubana (Fig. 2a, Higos. S19 a 23). Aunque en la transformación microbiana no se pudo detectar F1 utilizando la herramienta LC-HRMS en las condiciones desarrolladas, una muestra concentrada del clordecttiol estándar sintético proporcionó una señal significativa. Se confirmó la presencia de un átomo de azufre y la fórmula neutra esperada C10Cl10SH2 (Fig. 2c, d), y se descartaron las fórmulas crudas C10Cl10O2H2 (Fig. 2b). Por último, el análisis de GC–MS demostró la coincidencia perfecta (es decir, el mismo tiempo de retención de 25,6 min y el mismo espectro de masas en la fuente Fig. S6) entre el estándar sintético y el TP F1, por lo que definitivamente lo asigna como clordecttiol. De hecho, F1 representa el primer miembro de una nueva familia de clordecona TPs que posee por primera vez un átomo de azufre.

La capacidad de Desulfovibrio sp.86 para degradar productos de transformación de clordecona

Compuestos A1, B1, C1-C2 y F1 representativos de las cuatro familias de TPs posiblemente formadas en presencia de Desulfovibrio sp.86 se sintetizaron de acuerdo con protocolos químicos previamente informados6 y desarrollados en el presente documento para F1. Cada uno de ellos fue incubado en presencia de Desulfovibrio sp.86 cultivos en condiciones que demostraron promover la sulfuración reductora (vial sellado; condiciones de AC) o la decloración con apertura anular (vial abierto; condiciones de AR). Se realizó monitoreo dual de CG–MS y LC-EMR de todas las muestras.

Después de un mes de incubación en condiciones de AC, la 10-monohidroclordecona A1 se transformó completamente en dos compuestos clorados desconocidos apenas separados utilizando GC–MS (tiempos de retención: 24,3 min F2 y 24,5 min F3, Fig. 3, Higos. S7 a S11). Mostraron un espectro de masa idéntico en la fuente que era muy similar al patrón de fragmentación F1 (Fig. S8). Todos los fragmentos detectados en la fuente pasaron a poseer un átomo de cloro menos que sus análogos en el espectro de masa F1. Por lo tanto, se asumió que los compuestos F2 y F3 eran diastereoisómeros de 10-monohidroclordectiol (Fig. 3c). Esto fue confirmado por la síntesis química de los dos patrones de 10-monohidroclordectiol a partir de 10-monohidroclordecona A1 utilizando el procedimiento aplicado previamente para la síntesis de clordectiol F1 (Figs. S24 a 27). Estos estándares químicos tenían los mismos tiempos de retención (24,3 y 24,5 min) y los mismos espectros de masa en comparación con los biológicos F2 y F3 (Fig. S8). El TPs B1, C1-C2 y F1 se mantuvo sin cambios incluso después de seis meses de incubación con Desulfovibrio sp.86 bajo condiciones de CA.

Después de seis meses de incubación en condiciones de AR, el clordecthiol F1 se convirtió parcialmente en 10 monohidroclordecthioles F2 y F3, y se detectaron otras dos especies cloradas desconocidas utilizando GC–MS, denominadas F4 (tiempo de retención: 17,9 min) y F5 (tiempo de retención: 26,6 min) (Fig. 3d, Fig. S12). Ninguno de estos dos compuestos dio ninguna señal detectable en LC-HRMS. El análisis GC-MS permite proponer C10Cl6SH4 como fórmula cruda para F4 (Fig. S14), y C11Cl10SH4 para F5 (Fig. S15). El clordecsulfuro de metilo se sintetizó químicamente y se caracterizó completamente por RMN (Fig. S28 a 31). La correspondencia perfecta entre los tiempos de retención de CG y los espectros de masa de CG del clordecsulfuro de metilo y el F5 biológico (Fig. S13) confirma su identidad postulada. Cabe destacar la estructura de F5 (Fig. 3d) representa una forma S-metilada de F1. Queda por aclarar la naturaleza exacta de F4 (véase el texto complementario del SI). Todos los demás TPs se mantuvieron sin cambios en condiciones de RA.

En resumen, A1 (formado en condiciones de AR) sufrió una sulfuración reductora al igual que la clordecona; en ambas condiciones de incubación, las policloroindenias (B1 y C1-C2) no parecían ser degradables por Desulfovibrio sp.86, mientras que F1 (producido en condiciones de CA) podría transformarse en condiciones de RA (Fig. 3).

Investigación de las condiciones de incubación que conducen a la sulfuración reductora bacteriana

Para cuestionar los parámetros físico-químicos o fisiológicos que influyen en las vías de transformación de la clordecona en los cultivos de Desulfovibrio sp.86, Se eligió el monitoreo CG–MS (presencia B1 y F1 como evidencia de condiciones de AR y AC, respectivamente).

Dos compuestos inorgánicos que contienen azufre, el reductor Na2S y el aceptor de electrones Na2SO4, estaban presentes en el medio líquido MMD original. Una primera serie de experimentos en viales sellados con sustitución de Na2S por otros agentes reductores, sulfurosos o no, es decir, cisteína y citrato de titanio(III) (TiCi), condujo a un nivel comparable de clordectiol F1 (Tabla 1). También se observaron trazas de TP B1 en todos los experimentos, incluido Na2S, el control positivo (Tabla 1).

Tabla 1 Influencia del agente reductor en el perfil de clordecona TP.

Se diseñó un segundo conjunto de experimentos utilizando Na2S como agente reductor y aceptadores de electrones alternativos a base de azufre en viales sellados (Tabla 2). El uso de sulfato inorgánico enriquecido con 34S al 90% resultó en un producto de clordectiol que mostró un nivel de enriquecimiento de 34S similar (90% 34S-F1/10% F1, Fig. S16). El análisis de GC-MS del espacio de cabeza de cultivo también reveló la presencia de H234S y H3C34SH (Fig. S16), mostrando así que Desulfovbibrio sp.86 H2S producidos a partir de sulfato. Estos gases se detectaron en el espacio de cabeza de cultivo en condiciones de CA, utilizando el medio MMD, mientras que estaban ausentes del espacio de cabeza de cultivo en condiciones de AR que correspondían a la atmósfera de la guantera (Fig. S17). La ausencia de sulfato no inhibió el Desulfovibrio sp.86 crecimiento, sin embargo resultó en la formación de B1 (Tabla 2)5. La sustitución de sulfato por sulfito, bisulfito o tiosulfato condujo en todos los casos a la formación de clordectiol F1.

Tabla 2 Influencia del aceptor de electrones a base de azufre en el perfil de clordecona TP.

Una tercera serie de experimentos con frascos investigó el efecto de la naturaleza de la fase gaseosa en contacto con el cultivo. Entre la condición de AR usando viales abiertos en la guantera y la condición de CA usando viales sellados en el horno, varios parámetros diferían (naturaleza y volumen de la atmósfera, temperatura). Usando un sistema de frascos que incluye varios viales, estudiamos selectivamente el efecto de la renovación de la atmósfera en la transformación de clordecona por Desulfovibrio sp.medio de 86 pulgadas MMD. En cada caso, se colocaron viales abiertos con películas porosas hidrófobas en frascos que inicialmente se purgaron con un gas seleccionado. Todos los frascos se incubaron a 30 °C. Algunos de ellos se lavaron varias veces, para imitar el sistema de la guantera, mientras que otros se mantuvieron cerrados.

Los frascos 1-4 contenían dos viales abiertos idénticos llenos de MMD, clordecona y Desulfovibrio sp.86 inóculos y un control abiótico negativo. Entre ellos, dos frascos se lavaban dos veces por semana, el frasco 1 con (N2 / H2 (98/2; V / V)), el frasco 2 con N2 (Fig. 4a), mientras que los frascos 3 y 4, se purgan inicialmente con N2 y (N2 / H2 (98/2; V / V)), respectivamente, se dejaron sin aplanar (Fig. 4b).

Los dos últimos frascos (frascos 5 y 6) contenían tres frascos abiertos llenos de MMD, clordecona y Desulfovibrio sp.86, más un cultivo sin sulfato. Estos frascos se lavaron inicialmente con (N2 / H2 (98/2; V / V)) y se dejaron sin enjuagar durante 2 meses (Fig. 4c).

En paralelo a los frascos, dos viales sellados llenos de MMD sin sulfato, clordecona y Desulfovibrio sp.86 fueron lavados con H2S sintetizados extemporáneamente (Fig. S4).

Después de dos meses de incubación a 30 °C, se detectó TP B1 en viales colocados en los frascos lavados 1 y 2 (Tabla 3a), mientras que TP F1 solo se encontró en viales colocados en frascos no lavados 3 y 4 (Tabla 3b). No había TP en los controles abióticos. En los frascos 5 y 6, la F1 estaba presente tanto en Desulfovibrio sp sin sulfato como en Desulfovibrio sin sulfato.86 cultivos abiertos (cuadro 3c). De la misma manera, Desulfovibrio sp.86 cultivos libres de sulfato, lavados con H2S, mostraron niveles significativos de F1 TP, mientras que no se observó transformación en el control negativo (Tabla 3d).

Tabla 3 Influencia de la atmósfera gaseosa en el perfil de clordecona TP.

Se llevó a cabo otro experimento químico para evaluar la influencia del H2S en la transformación de la clordecona. Se aplicó el protocolo químico clásico que permitía la formación de TPs B y C (clordecona, citrato de titanio, vitamina B12, agua). Bajo la atmósfera N2, se obtuvieron TPs B y C, sin embargo, bajo la atmósfera H2S, solo se produjo A1 (Fig. S18).

Estos resultados muestran claramente que la formación de clordecttiol F1 requiere un sistema de incubación cerrado con una atmósfera reductora. Sin embargo, el H2 como atmósfera de gas inicial no es obligatorio, mientras que se requiere la presencia de H2S. Químicamente, la presencia de H2S evita el proceso de decloración de apertura de anillos.

Relevancia ambiental de la sulfuración reductora de clordecona

Volvimos a investigar nuestra colección anterior de muestras ambientales contaminadas con clordecona de la isla de Martinica (ocho suelos y dos sedimentos de lecho) en las que se habían notificado diversos niveles de TPs de clordecona 6. Entre los nuevos TPs que contienen azufre reportados en este documento, encontramos niveles apreciables de F1 en las muestras de sedimentos de dos lechos (927 y 928) a una concentración estimada alrededor de 50 µg/kg y 20 µg/kg de sedimento húmedo, respectivamente (Tabla S1). Paralelamente, se obtuvieron datos de diversidad de poblaciones bacterianas a partir del análisis metabarcodificador de estas muestras (Fig. 5, Fig. S5) se procesaron para recuperar una agrupación jerárquica de muestras ambientales de acuerdo con su composición taxonómica6. Se observó que las bacterias reductoras de sulfato estaban mucho más presentes en los sedimentos del lecho que en los otros compartimentos, como se informó previamente30,31,32.

Transformación del plaguicida recalcitrante clordecona por Desulfovibrio sp.86 con un interruptor de decloración con apertura anular a actividad de sulfuración reductora