a) Klamydomonas reinhardtiin seksuaalinen elinkaari koostuu… / Lataa Tieteellinen Kaavio

… Mendelin lakia uhmaavien geneettisten aineiden luonne. Viime vuosisadan laajat tutkimukset, joissa on käytetty lukuisia tekniikoita, mukaan lukien elektronimikroskopia, genetiikka, molekyylibiologia ja biokemia, ovat paljastaneet, että geneettiset aineet ovat itse asiassa genomeja kloroplasteissa ja mitokondrioissa (Kuroiwa 1991; Birky 1995). Kloroplastien (cp) ja mitokondrioiden (mt) arvellaan syntyneen nukleosolujen ja vapaana elävien bakteerien-syanobakteerien ja alfa – purppurabakteerien-välisistä endosymbioottisista suhteista. Niissä on omat genominsa, jotka ovat oletettavasti jäänteitä kantaisistään (Gray 1992). Nykyään tiedämme, että cp-ja mt-geenit siirtyvät jälkeläisille yksinomaan äidin vanhemmalta korkeampien kasvien, saniaisten, sammalten, levien (Kuroiwa 1991), sienten (Mitchell and Mitchell 1952; Kawano et al. 1987), ja eläimet (Hutchison et al. 1974) mukaan lukien ihmiset. CP/mt-genomien uniparentaalista periytymistä luultiin pitkään passiiviseksi lopputulokseksi, joka perustui siihen, että munasoluissa on useita organelleja, kun taas urospuoliset sukusolut myötävaikuttavat parhaimmillaankin vain muutamiin (Gyllensten et al. 1991). Kuitenkin, prosessi uniparental perintö on todennäköisesti dynaamisempi. Klassinen ja silmiinpistävä esimerkki olisi esiintyminen ei-Mendelialainen perintö yksisoluinen viherlevä, Klamydomonas reinhardtii, joka tuottaa sukusoluja samankokoisia (isogamous) (Sager 1954). C: n elinkaari.reinhardtii on erinomaisen yksinkertainen. On olemassa kaksi parittelutyyppiä C. reinhardtii, parittelutyyppi plus (mt+) ja parittelutyyppi miinus (mt), jota ohjaa yksi monimutkainen parittelutyyppi loci linkage group VI (Ferris et al. 2002). C. reinhardtii käy läpi seksuaalisen elinkaaren, joka sisältää määriteltyjä eriytymisvaiheita (Kuva 1). Kasvulliset solut erilaistuvat sukusoluiksi typen nälkiintymisen ja valon säteilytyksen olosuhteissa (Pan et al. 1996). Muutaman minuutin kuluttua sekoittumisesta vastakkaisten parittelutyyppien sukusolut kiinnittyvät toisiinsa flagellallaan ja sulautuvat muodostaen tsygootteja. Pakollisen horroksen jälkeen tsygootti käy läpi meioosin ja itämisen tuottaen neljä haploidista jälkeläistä. Yli 90% syntyneistä jälkeläisistä perii chloroplast (cp) – piirteitä, mieluiten mt + – vanhemmasta, ilmiö, joka kuvattiin ensimmäisen kerran yli 50 vuotta sitten (Sager 1954). Sager kuvasi kahden UV-säteilyn aiheuttaman mutaation, sr1: n ja sr2: n periytymiskuviot . Sr1-mutaatio aiheuttaa resistenssin streptomysiiniantibiootille ja sr2-mutaatio aiheuttaa resistenssin suurille streptomysiinipitoisuuksille. Kun sr1 risteytettiin a-streptomysiiniherkän kannan kanssa, streptomysiiniresistenssin vähäisyys periytyi Mendelin lain mukaisesti. Sen sijaan kun sr2 – mutaatiota kantava mt+ – vanhempi risteytettiin herkälle mt-vanhemmalle, kaikki meioottiset jälkeläiset olivat resistenttejä suurille streptomysiinipitoisuuksille. Vastavuoroisessa risteytyksessä meioottiset jälkeläiset olivat kaikki streptomysiiniherkkiä (Sager 1954). Vuonna 1962 todisteet cpdna: n olemassaolosta tulivat ris: n ja Plaut: n (ris and Plaut 1962) tekemistä valo-ja elektronimikroskooppisista tutkimuksista. Vain vuotta myöhemmin Sager ja Ishida kuvasivat cpdna: n eristämisen cesiumkloridin (CsCl) tiheysgradientin sentrifugoinnilla (Sager and Ishida 1963). Vuonna 1989 sr2-mutaation osoitettiin paikantuvan cp-genomin rps12-geenin sisällä (Liu et al. 1989). Vuonna 1972 eräs biokemiallinen tutkimus osoitti, että mt – cpDNA: n määrä väheni suhteessa mt + cpDNA: han, 6-24 h parittelun jälkeen (Sager and Lane 1972). Mt+ – ja mt – sukusolujen DNA merkittiin joko 14 N – tai 15 NH 4 Cl, ja CsCl-tiheysgradientin sentrifugoinnilla seurattiin ydin-DNA: n ja cpDNA: n kohtaloa 6-ja 24-h tsygooteissa. Kuusi tuntia tsygootin kehitykseen Mt – cpDNA: ta edustava signaali oli selvästi pienempi kuin mt+ cpDNA, mikä osoittaa Mt – cpDNA: n alennusta suhteessa mt+ cpDNA: han. Vuonna 1980 Grant et al toimitti ensimmäiset molekyylitodisteet mt – cpDNA: n edullisesta vähentämisestä. (Grant ym. 1980). Kirjoittajat tarkkailivat Mt+: n ja mt – cpdna: n käyttäytymistä käyttäen hyväksi restriktiofragmenttien pituuspolymorfismeja (rflps) C. reinhardtii-mutanttikannassa ac-u-g-23, joka kantaa kloroplasti-DNA: ssaan kahta pientä deleaatiota. Kirjoittajat havaitsivat, että sekä cpdna: n deleetiot että fotosynteettinen fenotyyppi olivat uniparentaalisesti periytyviä. 203-kb kloroplastin genomi C. reinhardtii (Maul et al. 2002)esiintyy ~80-100 kopiota per solu, ja on järjestäytynyt 5-10 DNA-proteiinikomplekseihin, joita kutsutaan kloroplastinukleideiksi (Kuroiwa et al. 1981). Vuonna 1982, Kuroiwa et al. todettiin, että DAPI (dsDNA spesifinen fluorochrome,4′, 6-diamidino-2-fenyyliindoli)-värjätty mt – CP-nukleoidit hävisivät mieluiten nuorilla tsygooteilla 50 minuutin kuluessa parittelusta (Kuroiwa et al. 1982). Vuonna 1999 Mt – cp-nukleoidien ensisijainen häviäminen havaittiin elävässä tsygootissa käyttäen SYBR Green I: tä (dsDNA-spesifinen fluorokromi, joka voi tunkeutua eläviin soluihin) (Kuva 1) (Nishimura et al. 1999). Tämän dramaattisen ilmiön tulkinta oli kuitenkin kiistanalainen, koska fluoresoivien mt – cp-nukleoidien ensisijainen häviäminen tapahtui hyvissä ajoin ennen DNA: n pelkistymistä biokemiallisilla tai molekyylibiologisilla menetelmillä (6-24 h parittelun jälkeen) (Sager and Lane 1972). Tämän selittämiseksi ehdotettiin kahta ensisijaista mahdollisuutta. Yksi mahdollisuus oli, että CP-nukleoidien hajoaminen saattaisi johtaa cpDNA-molekyylien dispersioon, ja toinen mahdollisuus oli, että cpdna-molekyylien nopea pilkkoutuminen voisi johtaa cpdna-nukleoidien katoamiseen. Yksi ongelma tämän kysymyksen käsittelyssä on se, että pariutumisreaktio suoritetaan käyttämällä miljoonia mt+ – ja mt-sukusoluja (kuva 2). Solupopulaatio on väistämättä heterogeeninen solujen seos, kuten yhdistämättömät mt+ – ja mt – gameetit, tsygootit, joissa on tai ei ole mt-cp-nukleoideja, ja poikkeukselliset meitoottiset tsygootit (1~5%), jotka eivät muodosta meitoottisia tsygootteja (Ebersold 1967). Yleensä molekyyli-ja biokemialliset menetelmät vaativat suuria määriä homogeenisia näytteitä tarkkoihin analyyseihin, ja näytteiden heterogeenisuus sekoittaisi tulokset. Toisin sanoen populaation yksittäisten solujen tai organellien” persoonallisuudet ” heikkenisivät ja todennäköisesti katoaisivat analyysiprosessissa. Toisaalta mikroskopia voi paljastaa” persoonallisuudet ” morfologisella tasolla, mutta ei molekyylitasolla. Tutkittaessa cpdna – molekyylien tilaa mt – cp-nukleoidien katoamisen aikana oli tarpeen kerätä tsygootteja mt-cp-nukleoidien läsnäolon tai puuttumisen perusteella ja analysoida yksittäiset tsygootit molekyylibiologisin menetelmin. Tämän saavuttamiseksi käytettiin optisia pinsettejä (kuva 3). Optisten pinsettien käyttö on uusi tekniikka elävien solujen tai organellien manipuloimiseksi suorassa mikroskooppisessa tarkkailussa (Ashkin et al. 1987). Tässä tutkimuksessa yksi tsygootti, jossa oli tai ei ollut cp-nukleoideja, kerättiin optisilla pinseteillä ja mt – cpDNA-molekyylien läsnäolo tai puuttuminen määritettiin sisäkkäisellä PCR-analyysillä. Mt+: n ja mt – tsygoottisen cpDNA: n yksittäisiä kohtaloita seurattiin erikseen käyttämällä kloroplastista transformanttia LO3c: tä , jossa on bakteerigeeni aadA (aminoglykosidiadenyylitransferaasi). Yksittäisille tsygooteille, jotka saatiin optisilla pinseteillä, tehtiin erittäin herkkä sisäkkäinen PCR-analyysi aadA: ta varten (kuva 4)(Nishimura et al. 1999). Kun l03c mt+ – sukusolut risteytettiin villin tyypin mt-sukusolujen kanssa, havaittiin aadA-geenisekvenssejä kaikissa tutkituissa tsygooteissa. Päinvastoin, kun l03c mt – gameetit risteytettiin villityyppisten gameettien kanssa, Aada-sekvenssit monistuivat vain nuoremmilla tsygooteilla (10 ja 30 minuuttia tsygootin muodostumisen jälkeen). Fluoresoivien mt-cp-nukleoidien kadottua Aada-sekvenssejä ei enää havaittu tsygooteilla (90 ja 120 minuuttia tsygootin muodostumisen jälkeen). Nämä tulokset osoittavat, että mt – cpDNA – molekyylit pilkkoutuvat täysin 10 minuutissa, jonka aikana mt-cp-nukleoidit katoavat, ja että myös ainakin yksi erittäin tehokas nukleaasi aktivoituu mt-kloroplastissa heti tsygootin muodostumisen jälkeen. Tämä Mt – cpDNA: n aktiivinen ruoansulatus on todennäköisesti perusta cpdna: n äidilliselle periytymiselle. Yksinkertaisin malli cpdna: n uniparentaaliselle periytymiselle on, että prosessi koostuu kahdesta erillisestä tapahtumasta, jotka todennäköisesti tapahtuvat elinkaaren eri vaiheissa: mt+ cpDNA: n “suojaaminen”, ehkä gametogeneesin aikana, ja suojaamattoman mt – cpDNA: n “tuhoaja” tsygootin varhaisen kehityksen aikana. A) Restriction –Metylation hypoteesi vuonna 1972, Sager ja kollegat ehdottivat, että mt – cpDNA pilkottiin toiminnan restriktioentsyymien, kun taas mt+ cpDNA oli suojattu metylaatio – malli analoginen bakteerien restriktioetylaatio järjestelmä (Sager and Lane 1972). Sager ja kollegat keräsivät nopeasti vakuuttavaa näyttöä, joka osoittaa Mt+ cpDNA: n metylaatiotason nousun, joka havaittiin 7 h parittelun jälkeen (Burton et al. 1979; Royer and Sager 1979; Sano et al. 1980). Lisäksi on raportoitu mt+ gameettispesifisten DNA-metyylitransferaasien, joiden molekyylipainot ovat 60 kDa ja 20 kDa, puhdistamisesta (Sano et al. 1981). Tämä mt+ gamete specific metylation tapahtuma oli ilmeisesti palautuva, kuten olisi odotettavissa suojaa (Sano et al. 1984). Kloroplastissa asuvan DNA-metyylitransferaasin geeni tunnistettiin lopullisesti vuonna 2002, ja sen mt+-sukusolujen spesifinen ilmentyminen ja kloroplastien lokalisointi vahvistettiin (Nishiyama et al. 2002). Toisaalta joukko riippumattomien ryhmien julkaisuja on myöhemmin väittänyt, että mt+ cpDNA: n metylaatio ei voisi selittää suojaa riittävästi. Bolen ym. eristettiin ydinmutantti me1, joka konstitutiivisesti metyloi cpdna: ta korkeammalla tasolla sekä mt+ – että mt-soluissa (Bolen et al. 1982). Kun ME1-sukusoluja käytettiin risteytyksiin, havaittiin normaaleja uniparentaalisia periytymiskuvioita, jotka olivat ristiriidassa …