Alpha CETSA Knowledgebase

• CETSA ®
• kohde – / Näytetyypit
• Cetsa® – Määritysolosuhteet
• Alpha CETSA® – immunomääritykset
• Cetsa® – tietojen analysointi ja tulkinta

Vastuuvapauslauseke: ainoastaan tutkimuskäyttöön. CETSA® on Pelago Bioscience AB: n rekisteröity tavaramerkki. Huomaa, että Kitin käyttöön tarvitaan voimassa oleva cetsa® – tilaus.

itse CETSA® – menetelmä

K: Mikä on CETSA®?

A : Cellular Thermal Shift Assay on menetelmä, jonka avulla voidaan kvantifioida yhdisteen kohde-sitoutuminen (te) elävissä soluissa tai häiriintyneissä soluissa. CETSA® – määritysperiaate perustuu kohdeproteiinin termisen denaturaatioprofiilin muutokseen, joka tapahtuu yhdisteen sitoutumisen jälkeen. CETSA® – määritys suoritetaan inkuboimalla soluja testiaineella, minkä jälkeen yhdisteellä käsitellyt solut kuumenevat ja sen jälkeen mitataan jäljellä oleva liukoinen kohdeproteiini.

Q: Mikä on terminen muutos

A: Kuumennettaessa proteiini kohtaa lämpötilan, jossa se denaturoituu (kutsutaan joskus sulamispisteeksi). Tämä sulamislämpötila on fysikaalinen ominaisuus ja vakio kaikissa olosuhteissa (pH, paine, suolat). Yhdisteet, jotka vuorovaikuttavat proteiinin kanssa, muuttavat sulamislämpötilaa (terminen muutos). Tietyn sitoutumiskohdan osalta proteiinissa lämpösiirtymä voidaan mitata eri yhdistepitoisuuksilla (annos-vaste), ja tällaisista käyristä johdettuja EC50-arvoja voidaan käyttää määritettäessä yhdisteiden sarjan voimakkuusjärjestystä, joka korreloi suoraan yhdisteiden affiniteetin arvojärjestykseen . On olemassa useita muunnelmia in vitro Thermal Shift assay, mutta avain tekniikka kuvattiin ensin Semisotnov et al. (1991). Tässä menetelmässä sulava ja Avautuva proteiini altistaa hydrofobisille pinnoille, jotka mahdollistavat SYPRO oranssin sitoutumisen. Tämän värin fluoresenssi sammuu vedessä, joten sitoutuminen näihin hydrofobisiin pintoihin kumoaa tämän ja aiheuttaa fluoresenssin huipun, kun proteiini on täysin avautunut. Tämän tyyppistä Lämpösiirtymätestiä voidaan soveltaa vain erittäin puhdistettuihin proteiineihin, ja vähäisen runsauden lajien osalta tämä voi tarkoittaa, että riittävien määrien tuottamiseen tarvitaan yliekspressiojärjestelmä.

Thermofluor-temperature sensitive dye system (using Sypro Orange)

Differential scanning fluorimetry (DSF) – alternative dye based methods

Quantitive PCR systems (esim. Roche Light cycler) : näitä käytetään lämmitystapahtuman toimittamiseen ja niillä voidaan mitata fluoresenssin muutoksia

Nanotemper-on yritys, joka valmistaa erityisen instrumentin, joka lämmittää näytteen ja mittaa fluoresenssin. Se tarjoaa paremman suorituskyvyn kuin mukautetut PCR-järjestelmät.

K: Miksi Tavoiteaktiivisuuden mittaaminen on tärkeää?

A: Jos ei ole varmistusta siitä, että yhdiste todella on vuorovaikutuksessa halutun kohteen kanssa, lääkekehittäjät voivat menettää arvokasta aikaa ja resursseja, jotka liikkuvat väärään suuntaan. Tästä syystä yhdisteen Kohdehenkilöllisyyden varmistamista on pitkään pidetty välttämättömänä huumelöydössä. Tällaisten määritysten avulla voidaan tehdä suoria vertailuja yhdisteen affiniteetista kohteeseensa, koska se on olennainen toimenpide sen valitsemiseksi, mitkä yhdisteet etenevät lyijyn tuotannon ja optimoinnin kaikissa vaiheissa. Koska kohteen sitoutuminen voi korreloida affiniteettiin, tutkijat voivat valita yhdisteitä, joilla on suurimmat affiniteettiarvot. Sellaisenaan se on erittäin hyödyllinen toimenpide oikean yhdisteen priorisoinnin varmistamiseksi huumeiden löytöprosessin jokaisessa vaiheessa.

K: Miten cetsa® eroaa muista termisen siirtymän määritystekniikoista?

A: Cetsa®: n lisäksi on olemassa lukuisia menetelmiä kohteen sitoutumisen arvioimiseksi (esim.Pintaplasmoniresonanssi, Fluoresenssipolarisaatio ja terminen muutos). Kaikki nämä menetelmät perustuvat kuitenkin siihen, että puhdistettua proteiinia on saatavilla, ja niitä voidaan käyttää vain in vitro, eli johdetut affiniteettiarvot eivät välttämättä ennusta todellista affiniteettia tai sitoutumispotentiaalia elävissä soluissa. Se, että voidaan suorittaa Lämpösiirtotestejä relevantissa solukontekstissa, jossa proteiini on alkuperäisessä ympäristössään, sen luonnollisten kumppaniproteiinien läsnä ollessa ja sen kofaktorien ja substraattien fysiologisina pitoisuuksina, tuottaa paljon relevanttimpaa tietoa, joka voidaan paremmin muuntaa eläinmalleiksi ja kliinisiksi kokeiksi.

vaikka solun terminen Siirtymämääritys on menetelmä, joka perustuu samaan biofysikaaliseen periaatteeseen kuin standardoidut termiset siirtymämääritykset (eli se, että tietyt proteiinit denaturoituvat tietyssä lämpötilassa), se ei mittaa suoraan avautumislämpötilaa, vaan perustuu sen sijaan siihen, että yhdisteen esiintyminen proteiinissa vaikuttaa liukoisen proteiinin määrään kuumennettaessa määrättyyn lämpötilaan. Cetsa® on siis pohjimmiltaan kokonaisproteiinimääritys, joka tehdään tietyn lämmitystapahtuman jälkeen. Yhdisteet, joilla on erilaiset kohdekytkentäpotentiaalit, muuttavat lämmitystapahtumasta selviytyvän proteiinin suhteellisia määriä. Koska määritys mittaa tätä jäännösproteiinia varsinaisen sulamistapahtuman sijaan, sitä voidaan käyttää monimutkaisempiin in vivo-järjestelmiin, kuten soluihin ja lysaatteihin (ja joissakin CETSA® – muodoissa jopa kiinteään kudokseen). Lisäksi CETSA® voi tunnistaa yhdisteitä, jotka epävakauttavat proteiinia (eli vähentävät sen sulamislämpötilaa), tämä on vähemmän suoraviivaista muiden lämpösiirtomenetelmien kanssa.

Q: Miten Alpha cetsa® eroaa muista Cellular Thermal Shift assay-teknologioista tai muista Cellular Target Engagement-määrityksistä?

A: kuten edellä mainittiin, cetsa® on pohjimmiltaan kokonaisproteiinimääritys, joka tehdään lämpöshokin jälkeen. Alpha CETSA® käyttää kahta vasta-aineiden läheisyyteen perustuvaa tunnistusjärjestelmää. Muilla menetelmillä vältetään vasta-ainepohjaisen järjestelmän käyttö muuttamalla kohdeproteiinia:

• Promega nanolusiferaasi thermal shift assay (NaLTSA): kohdeproteiiniin fuusioitu Nanoluksiferaasi (rekombinatiivisesti ilmentyvä proteiini); Kun nanoluc-entsyymin tunnisteella varustettu proteiinikohde aggregoituu, luciferaasisignaali pienenee.
• Promega NanoBRET Target Engagement Assay : Luciferase Fusion Tag yhdistettynä merkittyihin merkkiaineyhdisteisiin, jotka lusiferaasin läheisyydessä johtavat Bioluminesenssiresonenssien energiansiirtoon (BRET). Yhdisteen sitoutuminen samaan taskuun syrjäyttää merkkiaineen ja BRET-signaali pienenee. Tämä ei ole lämpöshokkimenetelmä.
• DiscoverX InCELL Pulse: Based on Enzyme Fragment Complementation (EFC) technology : kohdeproteiini fuusioituu β-galaktosidaasin (β-gal) pieneen entsyymin luovuttajafragmenttiin. Lisätty reportteriproteiini sitoutuu tähän fragmenttiin-ja aktivoi aktiivisen entsyymin, joka hydrolysoi substraatin-ja tuottaa kemiluminesenssisignaalin, joka mahdollistaa proteiinin runsauden määrittämisen. Lämpödenaturaation jälkeen proteiini kerääntyy ja rajoittaa suuremman lusiferaasikomponentin pääsyä kumppaniinsa proteiinitavoitteeseen.

näiden “rekombinantti CETSA®” – tai “rekombinantti kohdekiinnitys” – järjestelmien ja Alpha CETSA® – järjestelmän keskeinen ero on se, että niitä ei voida soveltaa alkuperäisiin ja muuttumattomiin soluihin. Tällä on useita kielteisiä seurauksia:

1. vaikka uuden vasta-aineparin kehittäminen ja sitä seuraavat kaivokustannukset saattavat olla suuremmat kuin vain yhden solulinjan siirto, on todennäköistä, että kaikki löytöohjelmat halutaan testata erilaisilla mallisolulinjoilla, jokaisella transfektiolla on omat kustannuksensa ja seuraavien solulinjojen Kloonaus vie lisää viikkoja.
2. merkityn proteiinin tuottamisella on aina fysiologisia vaikutuksia soluun ja merkitty proteiini voi olla (I) yliekspressoitunut (väärä Stoikiometria vs. partnerit), (ii) eivät sijaitse oikeassa solulokerossa tai (iii) eivät liity keskeisiin kumppaniproteiineihin ja (iv) niiden sulamiskäyttäytyminen voi poiketa alkuperäisestä proteiinista. Yhdisteen näennäinen vaikutus ei välttämättä heijasta sen todellista käyttäytymistä potilaan kudoksessa. Nämä ongelmat voivat korostua missä tahansa tilapäisessä verensiirtojärjestelmässä.
3. Lusiferaasin estäjät voivat aiheuttaa vääriä positiivisia osumia.
4. lyijyn optimoinnin myöhemmissä vaiheissa, kun tarvitaan monimutkaisempia ja fysiologisesti merkityksellisempiä solumalleja (primaariset, alkuperäiset solulinjat ja kudos), merkittyjä proteiinimenetelmiä ei yksinkertaisesti voida soveltaa.

K: Mitä tietoja cetsa® – määritys antaa?

A: CETSA® antaa ainutkertaisen mittauksen yhdisteestä ‘on target presence’, ja sitä voidaan pitää kohteen käyttöasteena. Tähän käyttöasteeseen vaikuttavat sekä yhdisteiden kyky sitoutua kohteeseen että yhdisteen kyky olla läsnä oikeassa paikassa (ts. onko sillä oikea liukoisuus, läpäisevyys, metabolinen Stabiilisuus ja saatavuus oikeassa solulokerossa). Ei-huokoiset Target Engagement-määritykset tarjoavat toimenpiteitä, affiniteetti, jotka korreloivat vain proteiini käyttäytyy erittäin keinotekoinen ympäristöissä, usein käyttämällä puhdistettua recombinantly ilmaisi kohde proteiineja.

Q: voidaanko CETSA® – valmistetta käyttää SAR-analyysitutkimuksissa?

A: vielä ei ole julkaistuja esimerkkejä, joissa cetsa®: tä olisi käytetty yhdisteen optimointiin. Shaw et al osoittivat kuitenkin selvästi cetsa®: n potentiaalin ja sovellettavuuden SAR-analyysiin ja osuman vahvistamiseen. vertaamalla cetsa® – määrityksen tietoja yleisesti käytettyihin biokemiallisiin ja solupohjaisiin määritystietoihin (Shaw et al. 2018 SLAS Discovery 1-12 DOI: 10.1177/2472555218813332). Julkaisu osoittaa cetsa®: n lisäarvon seulontaan, hit confirmationiin ja SAR-generointiin kahdelle proteiinitavoitteelle: B-Raf: lle ja PARP1: lle.

tavoite – /Näytetyypit

Q: Kuinka monta kohdetta on tähän mennessä validoitu cetsa® – järjestelmässä?

A: Cetsa® HT: ssä (suurin osa on Alfa cetsa®, jotkut käyttävät HTRF: ää) on onnistuneesti validoitu yli 30 kohdetta, mukaan lukien kohteet, joissa on ydin -, mitokondrio -, sytoplasma-ja plasmakalvon lokalisointi.

CETSA® Classic (Western Blot based detection) – menetelmässä on tähän mennessä validoitu yli 100 kohdetta.

CETSA® M/S tuottaa kerralla tietoa 6000-7000 kohteelle.

Q: voidaanko kaikki kohdeproteiinit testata cetsa® – valmisteella?

R: jotkut kohteet ovat cetsa® – järjestelmässä” sokeita”, ts. yhdisteen sitoutuminen ei muuta niiden lämpöstabiilisuutta. Tämä voi tapahtua, kun proteiinissa on useita domeeneja ja yhdiste sitoutuu vain yhteen domeeniin, ja jos tämän yhden domeenin stabiloituminen ei globaalisti vaikuta koko proteiinin lämpöstabiiliuteen. Cetsa® – kokeissa on muutamia proteiineja, jotka eivät sula tyypillisellä lämpötila-alueella.

Pelagolla on pääsy laajaan tietokantaan, joka sisältää lämpöstabiilisuutta koskevia tietoja hankkeista, joissa on massaspektrometrinen lukema (CETSA® MS), ja tämä tieto otetaan huomioon, kun Pelago arvioi proteiinikohteen “cetsa® bilility” – arvoa ennen Alpha cetsa® – määrityksen kehittämistä. Ota yhteyttä Pelagoon ja pyydä näitä tietoja.

K: soveltuvatko GPCRs: t cetsa®: lle ?

A: muutamia esimerkkejä GPCRs: stä on testattu cetsa®: ssä . Astra Zenecan tuoreessa julkaisussa (Kawatkar et al Chem Biology 2019) perustettiin cetsa® Classics-määritykset joukolle kalvoon sitoutuneita proteiineja, mukaan lukien gpcr-proteiinikohde. Yksi mahdollinen haaste Cetsa®: n kanssa Gpcr-säännöissä voi olla vasta-aineiden rajallinen saatavuus havaitsemiseksi. Lisäksi gprcs: n kiinteä kalvolokalisaatio voi johtaa arvaamattomaan sulamiskäyttäytymiseen.

Q: minkä tyyppisiä näytteitä voidaan testata cetsa®: ssa?

A : On esimerkkejä cetsa® – määrityksistä, joissa käytetään monia erityyppisiä matriiseja, mukaan lukien immortalisoidut solulinjat, primaarisolut, iPS-solut, potilasperäiset Pbmc: t, spheroidit, viljeltyjen solujen ydinfraktiot, ex-vivo-käsitelty kudos, in vivo-eläinkokeiden kudokset, bakteerit, hiiva, seeprakala ja hyönteiset.

Q: voidaanko näytteet jäädyttää lämmitysvaiheen jälkeen?

A: Tämä on mahdollista, mutta tämä edellyttää tapauskohtaista validointia, koska pakastaminen voi denaturoida joitakin proteiineja.

Q: soluni tarvitsevat viljelylevypinnoitetta joillakin proteiineilla (esim. kollageeni tai Matrigel); onko näytteenvalmistuksen välttämiseksi noudatettava erityistä varovaisuutta?

A: meillä ei ole ollut ongelmia pinnoitetuilla levyillä viljeltyjen solujen kanssa.

CETSA® – Määritysolosuhteet

Q: Mitkä ovat tyypilliset Alfa cetsa® – määrityksen optimointipisteet?

A: jos immunomääritys aloitetaan alusta, sitä on ensin kehitettävä ja optimoitava. On tärkeää ja kannattavaa investoida erittäin herkän Alfa-määrityksen kehittämiseen, koska sen avulla voidaan vähentää cetsa® – määrityksessä tarvittavaa solumäärää kaivoa kohti. Koska CETSA® – määritys tuhoaa osan havaittavasta proteiinista, cetsa®-määrityksessä tarvitaan yleensä enemmän soluja/kuoppaa kuin muissa solupohjaisissa määrityksissä. Tutustu perkinelmerin alpha assay development-oppaisiin, miten edetä, ja hyödyllisiin vihjeisiin, sekä cetsa® toolbox-ohjeisiin, jos käytät toolbox-lähestymistapaa (anti mouse Ig X anti rabbit Ig beads).

silloin cetsa® – määrityksen optimointipisteisiin kuuluvat:

• Solutiheyden titraus
• solulyysipuskurin valinta
• solujen inkubointiaika testiyhdisteellä
• solujen inkubointilämpötila testiyhdisteellä
• sulamis-ja siirtymäkäyrien määrittäminen
• Lämpötilan valinta isotermisille annos-vastekokeille
• työnkulun ja automaation asetukset

Q: Miksi eri cetsa® – solulyysipuskureita on saatavilla ja mitä vaikutuksia eri solulyysipuskurien käytöllä on?

A: Lysis-puskuri on tärkeä määrityksen useiden näkökohtien osalta. Sen tehtävä on moninkertainen: solujen lysääminen ja kohdeproteiinin mahdollinen vapauttaminen kumppaniproteiineista, jotka voivat häiritä vasta-ainetunnistusta, jotta kohde voidaan havaita vasta – aineilla; kohdeproteiinin stabilointi, jotta määritys olisi stabiili; mahdollisen epiturbance-vaikutuksen välttäminen tai minimoiminen; tarjoten oikeat fysikaalis-kemialliset olosuhteet (pH, ionilujuus ja suolojen luonne, pesuainetyyppi ja pitoisuus, … ) immunomääritystä varten, … koska eri immunomäärityksillä voi olla erilaiset optimaaliset olosuhteet, erilaiset proteiinitavoitteet ja eri solutyypeillä voi olla erilaiset vaatimukset optimaaliselle määritykselle, tarjoamme 5 erilaista solulyysipuskuria. Nämä tarjoavat erilaisia solujen hajoamisolosuhteita. Tämä ei kuitenkaan tarkoita, että lisätapauksia, kuten pesuainetyyppejä, voitaisiin lisätä määrityksen suorituskyvyn parantamiseksi.

Q: Onko cetsa® – solujen hajoamispuskureissa proteaasi-inhibiittoreita?

A: CETSA® – Solulyysipuskurit 1, 4 ja 5 sisältävät joitakin kahdenarvoisia kationikelaattoreita, joiden odotetaan estävän proteaaseja, jotka tarvitsevat tällaisia kahdenarvoisia kationeja aktiivisuutensa vuoksi (esim.Matriisimetalloproteinaasit). Tämän lisäksi CETSA® – solulyysipuskureihin ei sisälly muita proteaasinestäjiä, koska niitä ei yleensä tarvita Alfa cetsa® – määritysten suorittamiseen. Tiettyihin solutyyppeihin tai kudosnäytteisiin kannattaa kuitenkin lisätä tyypillisiä proteinaasin estäjiä, kuten leupeptiniä.

Q: Mitkä ovat tyypilliset sulamislämpötilat?

A: sulamislämpötila (Tm) määritellään lämpötilaksi, jossa puolet kohdeproteiinipopulaatiosta on denaturoitu (eli Alpha CETSA®: ssä, jossa puolet Alfasignaalista on kadonnut). Kohteesta riippuen sulamislämpötila on useimmiten 40-60°C, keskimääräinen sulamislämpötila 52°C. jotkut proteiinit, kuten kalvoon liittyvät proteiinit, ovat yleensä stabiilimpia ja niillä voi olla korkeampi sulamislämpötila. Cetsa® – määritystietoihin proteiineista, joiden sulamislämpötila on yli 65°C, voi vaikuttaa se, että solukalvon läpäisevyys ja solujen eheys häiriintyvät, kun soluja kuumennetaan, mikä vaikuttaa määrityksen fysiologiseen merkitykseen.

kokemuksemme mukaan sulamislämpötila on kohdekohtainen ja riippuu määritysmatriisista ja käytetystä liukupuskurista.

K: odotetaanko Tm: n olevan sama, kun käytetään ehjiä soluja ja häiriintyneitä soluja?

A: ei välttämättä, sillä soluja hajottaessa proteiineja stabiloivat proteiini-proteiini-vuorovaikutukset voivat kadota, mikä voi johtaa muuttuneeseen sulamislämpötilaan verrattuna ehjiin soluihin. Esimerkkejä ovat Alpha CETSA® MEK1-määritystiedot.

Q: Mikä lämmityslämpötila pitäisi valita yhdistetestaukseen?

A: Yhdisteiden stabiloimiseksi on suositeltavaa valita alin lämpötila, jossa on suurin määritysikkuna, koska sen odotetaan antavan herkimmän määrityksen (alhaisemmat EC50-arvot). Epävakauttavia yhdisteitä varten on suositeltavaa valita korkein lämpötila, jossa on suurin määritysikkuna. Yli 65°C: n lämpötila voi vaikuttaa solujen läpäisevyyteen ja vähentää datan merkitystä.

Q: pitäisikö odottaa samaa sulamislämpötilaa cetsa® Classicissa (Western Blot) ja Alpha cetsa®?

A: ei välttämättä: näennäinen sulamislämpötila voi vaihdella molempien menetelmien välillä, koska havaitsemismenetelmät ovat erilaisia.

K: Onko tärkeää valvoa tarkasti näytteen lämmitysaikoja?

A: Kyllä Tämä on erittäin tärkeää kontrollin kannalta, koska pidemmät lämmitysajat voivat johtaa annos-vastekäyrän oikeaan muuttumiseen (KS.viipymisaikaa koskevat huomautukset jäljempänä). Vakio lämmitysaika on 3 minuuttia.

yhdisteet, joiden viipymisaika on lyhyt (eli suuren dissosiaationopeuden vakio koff; viipymisaika T on yhtä suuri kuin 1/koff) hajoaa nopeammin kohteesta kuumennettaessa verrattuna yhdisteisiin, joilla on pitkä viipymisaika. Tästä syystä EC50: n eli ITDRF50: n arvon odotetaan kasvavan lämmitysaikojen pidentyessä. Lisätietoja cetsa® – teoriasta on Seasore-Ludlow B, Axelsson H, Almqvist H, Dahlgren B, Jonsson M, Lundbäck T. (2018) Quantitative Interpretation of Intracellular Drug Binding and Kinetics Using the Cellular Thermal Shift Assay. Biokemia 57: 6715-6725. https://dx.doi.org/10.1021/acs.biochem.8b01057. Teoriassa eri yhdisteiden viipymisaikojen havaitseminen kohteessa vaihtelevalla lämmitysajalla voisi olla mahdollista, mutta tästä ei ole vielä julkaistu raportteja.

Q: käsikirjassa neuvotaan joko jäähdyttämään jäällä tai 3 min 25°C: ssa lämpöshokin jälkeen. Onko tämä jäähdytysvaihe tärkeä ja onko tärkeää valvoa tarkasti jäähdytysaikaa?

A: näytteen jäähdyttäminen nopeasti varmistaa, että lämpöshokkivaihe on hyvin hallinnassa. Jo pelkkä lämpötilojen jäähdyttäminen ilman lupaa tuottaisi varmasti erilaisia jäähdytysnopeuksia eri kaivoissa ja vaikuttaisi järjestelmään tulevan lämpöshokin määrään. Jäähdytysvaihe ei ole yhtä kriittinen kuin lämmitysvaihe, vaan se on suoritettava nopeasti ja johdonmukaisesti.

K: Voinko käyttää PerkinElmer “Biomarker”-ja “SureFire” – sarjoja (ei-CETSA® ) cetsa® – määritykseen?

A: teoriassa mikä tahansa kokonaisproteiinimääritys voi soveltua käytettäväksi cetsa® – protokollassa, vaikka jokainen järjestelmä on optimoitava ja validoitava. Cetsa® – menetelmä on kuitenkin patentoitu ja siihen tarvitaan Pelago Biosciencen lupa. Lisäksi PerkinElmer tukee vain nimettyjen kohdesarjojen käyttöä. Pelago Bioscience tukee työkalupakkauksen käyttöä ja se on vain lisenssinhaltijoiden käytettävissä.

Q: Onko mahdollista lukea Alfa-signaali suoraan näytteiden lämmittämiseen käytetyltä PCR-levyltä?

: Tämä tarjoaisi etuja pipetointivaiheiden lukumäärän, näytteen kulutuksen ja automaation helppouden kannalta, mutta mahdollisuutta käyttää PCR – levyjä koko prosessissa – näytteen käsittelystä havaitsemiseen-ei ole vielä osoitettu. PCR-levyt ovat usein hyvin joustavia, mikä johtaa epäyhtenäiseen signaaliin levyn päällä tai niillä ei ole oikeita mittoja, jotta niitä voitaisiin käsitellä levylukijoilla. Well-to-well cross-talk voi olla myös ongelma tällaisissa PCR levyt.

Q: voidaanko lämmön sijasta käyttää kemiallista denaturointia (esim. ureaa tai guanidiinia)?

A: Etuna käyttämällä lämpötila antaa lämpöiskun on, että se tehdään erittäin hallitulla tavalla, joka on todennäköisesti vakio näytteiden välillä, ja rajoitettu hyvin hallitulla aikavälillä. Kemiallinen denaturointiprosessi saattaa toimia puhdistetussa proteiiniuutteessa, mutta monimutkaisessa soluympäristössä solujen tilavuuden vaihtelu, puskurointikyky, lipidipitoisuus jne.tarkoittavat kaikki todennäköisesti sitä, että eri solulinjoilla on erilaiset denaturointiominaisuudet mille tahansa proteiinille.

koska denaturaatio (lämmitysaika) on kriittinen, tätä voi olla melko vaikea hallita kemiallisella denaturoinnilla. Lisäksi lämpöä voidaan soveltaa häiritsemättä soluja, jolloin voidaan testata todellisessa solukontekstissa. Tämä ei koskisi kemiallista denaturointia, koska soluja jouduttaisiin häiritsemään, jotta denaturoivalle aineelle päästäisiin käsiksi, jolloin solunsisäiset pitoisuudet, proteiiniyhdistykset jne.häviäisivät.. Siksi emme suosittele lämpöshokin korvaamista kemiallisella denaturoinnilla.

Alpha CETSA® – immunomääritys

Q: Kun kehitän cetsa® – määritystä, Tarvitsenko monoklonaalisia vasta-aineita vai voidaanko myös polyklonaalisia vasta-aineita käyttää?

A: voidaan käyttää sekä monoklonaalisia että polyklonaalisia vasta-aineita, riippuen tietenkin vasta-aineiden laadusta. Monoklonaaliset vasta-aineet ovat eduksi reagenssin vakaan saannin kannalta, kuten kaikissa muissakin vasta-aineita käyttävissä osoitusmenetelmissä.

K: kun käytetään polyklonaalisia vasta-aineita, toimiiko seuraava erä samalla tavalla CETSA® – määrityksessä?

A: Kokemuksemme mukaan emme ole koskaan kohdanneet tilannetta, jossa polyklonaalisen vasta-aineen seuraava erä käyttäytyisi cetsa® – määrityksessä eri tavalla kuin aiemmat erät. CETSA® – määritys on kuitenkin validoitava uudelleen polyklonaalisen vasta-aineen seuraavalla erällä.

K: Onko olemassa muita suosituksia vasta-aineiden valinnasta?

A: Jos saatavilla, vasta-aineet on valittava siten, että ne kattavat kohdeproteiinin eri epitoopit, jotta voidaan maksimoida mahdollisuudet löytää sopiva vasta-ainepari, joka toimii Alpha CETSA® – määrityksessä.

vasta-aineparit, jotka tuottavat jyrkempiä käyriä (korkeampi mäenrinne) ja vähemmän taustaa, ovat suositeltavia, koska ne antavat yleensä tarkemman signaalin. Matala mäenrinne voi olla merkki vasta-aineparin kyvystä tunnistaa uudelleen taitettu proteiini.

Q: ovatko Alfa CETSA® – vasta-aineet vain endogeenista kohdeproteiinia tai endogeenista kohdeproteiinia ja siihen sitoutunutta pienimolekyyliä vastaan?

A: tähän mennessä kehitettyjen lääkepakkausten perusteella vasta-aineet ovat vain proteiinikohdetta vastaan.

Q: Voinko odottaa, että detektiovasta-aineiden affiniteetit ovat erilaisia sitoutuneen ja sitoutumattoman pienmolekyylin ja kohdeproteiinin välillä?

A: pienet molekyylit, jotka vaikuttavat proteiinin taittumiseen epitooppipaikoilla, ovat todellakin vaarassa muuttaa vasta-aineiden sitoutumista. Tätä ilmiötä kutsutaan “epiturbanceksi” ja se voi olla vasta-ainepohjaisen cetsa®: n rajoitus . Epiturbanssia ei yleensä havaita Cetsa® Classic-määritysformaatissa (Western Blotting), koska tässä tapauksessa proteiini denaturoidaan täysin ennen vasta-aineiden määritysvaihetta.

Q: Voiko IgG: tä käyttää vain cetsa® toolbox-pakettien kanssa?

A: Itse asiassa vasta-aineet anti-kani ja anti-hiiri helmiä ovat spesifisiä IgG, eivätkä tunnista muita vasta-aineluokkia (ts IgA, IgM, jne ei pitäisi valita).

K: Onko Alpha CETSA®: n käytössä etua verrattuna Cetsa® Classiciin (Western Blotting)?

A: Alpha CETSA® – määrityksen suuremman herkkyyden ja läpivirtaus-ja automaationäkökohtien Lisäksi, koska kalvoproteiinien analysointi Cetsa® Classic-menetelmällä voi olla vaikeaa, Alpha cetsa® saattaa toimia paremmin tällaisissa kohteissa, koska se ei tarvitse erottamisvaihetta.

CETSA® Data Analysis and Interpretation

Q: Mitä vääriä positiivisia osumia cetsa®: stä voidaan saada?

A: joidenkin proteiinien lämpöstabiilisuus voi heikentyä yhdisteen käsittelyn jälkeen, vaikka testiyhdiste ei suoraan sido niitä. Nämä epäsuorat vaikutukset voivat olla seurausta esimerkiksi proteiinin fosforylaatiosta, kumppanin proteiinin aktivoitumisesta proteiiniin tai solun Redox-tilan yleisestä muutoksesta. Cetsa® – määrityksen suorittaminen rinnakkain vahingoittumattomilla soluilla ja häiriintyneillä soluilla voi erottaa toisistaan suorat ja epäsuorat vaikutukset, koska tällaisia epäsuoria vaikutuksia ei odoteta, kun solut häiriintyvät ja aineenvaihduntaprosessit pysäytetään.

Yhdistemäärityksessä voidaan havaita intereferenssiä Alpha CETSA®: ssä, koska yhdisteitä esiintyy detektiovaiheessa suhteellisen suurina pitoisuuksina. Tämä voi antaa harhaanjohtavia tuloksia, ja on tärkeää suorittaa laskuri näytön tunnistaa nämä yhdisteet.

K: Miten kohteen epävakautta voidaan tulkita?

A: Epävakaus voi johtua proteiinikompleksin yhdisteen sitoutumisesta, joka stabiloi kohdeproteiinia. Kokemuksemme mukaan kalvoproteiineilla on yleensä korkeampi sulamislämpötila ja ne ovat pikemminkin epävakaita kuin stabiloituneet yhdisteen sitoutumisella. Kinaaseille se voi yhtä hyvin johtua ATP: n siirtymisestä. Tällaisessa tapauksessa cetsa® – määritysten tulosten vertaaminen vahingoittumattomille soluille (fysiologiset ATP-pitoisuudet) ja häiriintyneille soluille (ATP: n menetys) voi olla hyödyllistä. Joidenkin kohteiden osalta (katso Erbb2 Alpha CETSA® kit-käyttöohje) olemme havainneet, että peruuttamattomat estäjät horjuttivat kohdetta, kun taas palautuva estäjä vakautti kohdetta.

K: Voiko epiturbanssivaikutuksen välttää?

A: lisäämällä pieni määrä pesuainetta, kuten 0,01% SDS, voidaan estää epiturbance-ilmiö. Selitys voisi olla, että SDS tarjoaa pääsyn vasta-aineeseen jopa yhdisteen läsnä ollessa. Osa cetsa® – solulyysipuskurista sisältää pienen määrän SDS: ää, minkä vuoksi se saattaa välttää epiturbanssia muihin lyysipuskureihin verrattuna. Emme voi sulkea pois sitä, että joissakin tapauksissa saatetaan tarvita lisää käyttöturvallisuustiedotteita.

on huomattava, että tällainen epiturbanssivaikutus ei rajoitu CETSA® – määrityksiin, vaan sitä voidaan havaita myös missä tahansa immunomäärityksessä.

Q:Counter-screen / Miten tarkistaa, onko CETSA® – hit väärä positiivinen?

A: Cetsa®: ssa on yksinkertainen menetelmä, jonka avulla voidaan määrittää, vaikuttaako yhdiste itse kohdeproteiinin (de)stabilointiin vai häiritseekö se havaitsemismenetelmää: vertailu voidaan tehdä 1) lisäämällä yhdisteitä soluihin, sitten inkuboimalla ja tekemällä lämpökäsittely ja 2) kuumentamalla solut ensin ja lisäämällä yhdiste vasta sen jälkeen. Jos yhdisteen aktiivisuus havaitaan vasta testissä 1, se on todella aktiivinen kohteessa. Jos yhdiste aktiivisuus löytyy 1 ja 2, Se osoittaa, että se häiritsee jotenkin havaitsemistekniikka (katso PerkinElmer proteiini-proteiini vuorovaikutus opas luettelo mahdollisista alfainterferences).

K: Mitä vääriä negatiivisia osumia cetsa®: stä voi saada?

A: Jos yhdiste ei saavuta kohdetta solukontekstissa, se voi näkyä positiivisena biokemiallisissa määrityksissä ja silti negatiivisena CETSA®: ssä . Tämä ei ole väärä negatiivinen, vaan kuvastaa vain sitä, että yhdiste ei pääse kohteeseen todellisissa soluolosuhteissa, mikä on osa menetelmän voimallisuutta.

Q: Miten CETSA® – arvot vertautuvat funktionaalisiin määrityksiin / onko termoshiftin amplitudilla merkitystä?

A: Cetsa® – tietoja analysoitaessa on pidettävä mielessä, että määrityksen periaate eroaa täysin tyypillisistä funktionaalisista määrityksistä, kuten proteiinien fosforylaation, ionipitoisuuksien, cAMP-ja muiden signaalien transduktiomarkkereiden tarkastelusta tai fenotyyppianalyysistä korkean pitoisuuden seulonnassa, ja siksi tietoja on tulkittava vastaavasti.

termoshiftin amplitudi ei ole yhdisteen affiniteetin mitta.

EC50-tai ITDRF50-arvot ovat erityisiä tietyissä määritysolosuhteissa (lämpötila, lämmitysaika,…). Tämä ei eroa funktionaalisista määrityksistä, joissa EC50-arvot ovat esimerkiksi spesifisiä stimulaatioajoille.

Q: Onko mahdollista erottaa antagonistit agonisteista cetsa® – määrityksissä?

A: tavallisesti tämä tieto ei ole peräisin CETSA® – määrityksistä, vaan Shaw et al: n julkaisusta. (2018) Scientific REPORTS | (2018) 8: 163 / DOI: 10.1038 / s41598-017-18650-x. raportit, joiden mukaan vain agonistit pystyivät stabiloimaan androgeenireseptorin kehitetyssä cetsa® – määrityksessä, kun taas antagonistilla ei ollut suoraa vaikutusta cetsa® – määrityksessä, mutta se voitiin havaita agonistien vaikutuksen kilpailijoina cetsa® – määrityksessä. Siksi tässä erityistapauksessa cetsa® – määrityksessä pystyttiin erottamaan androgeenireseptoriagonistit ja antagonistit toisistaan. Tämä ei tarkoita, että tämä olisi mahdollista mille tahansa kohteelle, sillä on lukuisia esimerkkejä, joissa CETSA® – määritys tunnistaa suoraan sekä agonistit että antagonistit.

Q: Voidaanko cetsa® – valmistetta käyttää yhdisteen myrkyllisyyden osoittamiseen?

A: yhdisteiden, joilla on jokin toksinen vaikutus soluun, odotetaan muuttavan joidenkin proteiinien tasoa (hajoamis-ja/tai transkriptiovaikutusten kautta) ja muuttavan joidenkin proteiinien termostoitavuutta (translaation jälkeisten muutosten tai solujen Redox-tilan yleisen muutoksen kautta). Pelago tutkii mahdollisuutta luoda cetsa® MS-tiedoista” CETSA® – sormenjälkiä”, jotka voisivat olla yhteydessä erilaisiin myrkyllisyystyyppeihin. Tämä voisi myös tuottaa tietoa kohteista, joihin lääkkeiden ei pitäisi osua tällaisen myrkyllisyyden välttämiseksi. Jos jokin tietty kohde näyttää liittyvän Myrkyllisyyteen, Alpha CETSA® – valmisteen käytöstä voi tulla lääketeollisuuden valintamenetelmä.

K: voidaanko cetsa® – määritysten normalisointiin käyttää kodinhoitoproteiinia?

A: normalisointia ei yleensä tarvita CETSA® – määrityksissä, koska määrityksen tärkeä tulos on EC50-arvo. Kuitenkin joissakin tapauksissa, esimerkiksi työskenneltäessä kudosnäytteiden, materiaalin määrä mukana per datapoint voi vaihdella melko merkittävästi ja normalisointi voi sitten olla toivottavaa. CETSA® Classicissa (Western blotting) SOD1: tä käytetään yleisesti, koska sen 80°C: n sulamispiste tekee siitä hyvän muuttumattoman referenssin mille tahansa kohteelle, ja koska sen molekyylipaino on 18 kDa, se on helppo havaita Western bloteilla. GAPDH: ta ei suositella sen alhaisemman sulamislämpötilan (55 °C) vuoksi, joten se ei ole mahdollinen kontrolli kohteille, joilla on korkeampi sulamislämpötila.

jos halutaan normalisoida Alpha CETSA® – määritys, voidaan kokeilla cofilin-määritystä (Total cofilinille on olemassa AlphaLISA SureFire ultra kit, jossa on alustavat cetsa® – tiedot, mutta ei vielä täysin validoitua pakkausta)